賀建寧，王春亮，趙金山，程　明，劉開東，劉積鳳，柳　楠*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109； 2.公安部南昌警犬基地，南昌 330100； 3.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，青島 266121)

?

EphA2及EphrinA2在敖漢細(xì)毛羊皮膚中的表達(dá)及分布規(guī)律研究

賀建寧1，王春亮2，趙金山1，程明3，劉開東3，劉積鳳1，柳楠1*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，青島 266109； 2.公安部南昌警犬基地，南昌 330100； 3.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，青島 266121)

摘要：本文旨在探究EphA2及其配體EphrinA2基因在細(xì)毛羊毛囊發(fā)生、發(fā)育過程中的表達(dá)與分布規(guī)律，為毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。試驗(yàn)以敖漢細(xì)毛羊生長發(fā)育不同時(shí)期體側(cè)部皮膚為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)，對EphA2和EphrinA2基因的mRNA和蛋白水平在皮膚毛囊中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：EphA2和EphrinA2基因的表達(dá)量在胎齡120d時(shí)顯著高于胎齡90d和出生后1d(P<0.01)；出生后1和30d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。免疫組化結(jié)果表明：EphA2及EphrinA2蛋白在胎齡90和120d、出生后1和30d，4個(gè)時(shí)期的細(xì)毛羊體側(cè)皮膚毛囊發(fā)育過程中，主要在毛囊、毛母質(zhì)、外根鞘和表皮中表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的特異性表達(dá)。綜上結(jié)果表明，EphA2及EphrinA2與細(xì)毛羊皮膚毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)育過程密切相關(guān)，可為相關(guān)研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞：細(xì)毛羊皮膚；EphA2；EphrinA2；表達(dá)；分布規(guī)律

敖漢細(xì)毛羊是中國優(yōu)秀的細(xì)毛羊品種之一，其毛囊是皮膚的附屬結(jié)構(gòu)，也是產(chǎn)生被毛的重要組織，它的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)決定著被毛的品質(zhì)和產(chǎn)量。毛囊的形態(tài)特征及發(fā)育規(guī)律，對羊毛性狀有重要影響，并受多種因素的調(diào)控，其中基因是其最根本的調(diào)控因子。EphA2及其配體EphrinA2蛋白是細(xì)胞表面型酪氨酸蛋白激酶受體(Protein-tyrosinekinases，PTKs)的一種，都屬于Eph蛋白家族。作為蛋白酪氨酸激酶家族中的最大的成員，Eph家族是外界信息在體內(nèi)信號傳遞通路的關(guān)鍵組成部分，并廣泛參與了各生物學(xué)過程的調(diào)控[1-2]。EphA2與EphrinA2均為膜蛋白，當(dāng)只有以細(xì)胞膜附著的形式存在時(shí)才具有活性，其若要被活化則需要依賴細(xì)胞間的近距離接觸[3]。由于其結(jié)構(gòu)中都存在酪氨酸磷酸化的活性結(jié)構(gòu)，故它們所在的細(xì)胞具有雙向信號傳遞的功能。Eph受體的正向信號傳遞與經(jīng)典細(xì)胞信號傳遞一樣，當(dāng)受體結(jié)合配體后，受體自身發(fā)生酪氨酸激酶磷酸化，并激活多種信號分子，進(jìn)而通過相應(yīng)信號通路來調(diào)節(jié)受體的細(xì)胞效應(yīng)[4]。Ephrin介導(dǎo)的反向信號則向配體所在的細(xì)胞進(jìn)行傳遞，其主要過程：Ephrin與Eph受體結(jié)合后，配體胞質(zhì)區(qū)的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，配體可以與相鄰細(xì)胞的EphB受體相互作用，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)反向信號的產(chǎn)生[5]。有研究表明，Eph/Ephrin系統(tǒng)的雙向信號傳導(dǎo)通路與多個(gè)生理和病理過程有關(guān)，如正常組織邊界的形成、體節(jié)和血管的生成、細(xì)胞遷移、骨穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生等方面[6-10]。迄今，有關(guān)EphA2和EphrinA2基因與細(xì)毛羊毛囊發(fā)育關(guān)系的研究還鮮有報(bào)道。本研究旨在通過對敖漢細(xì)毛羊皮膚毛囊組織中EphA2和EphrinA2表達(dá)量及表達(dá)位置變化的研究，了解其對細(xì)毛羊毛囊生長發(fā)育的作用，以期為毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制研究提供理論依據(jù)，為運(yùn)用分子生物學(xué)加快育種進(jìn)程提供技術(shù)支持。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

分別采集胎齡90、120d及出生后1、30d4個(gè)時(shí)期敖漢細(xì)毛羊體側(cè)皮膚，每個(gè)時(shí)期3只，分別采集兩份2cm2的皮膚樣品，其中一份投入4%多聚甲醛溶液固定，用于石蠟切片制作；另一份投入液氮中，用于總RNA的提取。以上羊均來自同一羊場，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

1.2主要儀器和試劑

羅氏RocheLightCycler480Ⅱ熒光定量PCR系統(tǒng)；羅氏TriPureRNAIsolationReagent，RocheTranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit1kit，SYBR?PremixEXTaqTMⅡ(2×)；一抗(博奧森)：RabbitAnti-EphrinA2antibody(bs-9758R)、RabbitAnti-EphA2antibody(bs-10209R)；二抗(Sigma)：Anti-RabbitIgG(wholemolecule)-FITC；LeicaRM2235切片機(jī)、FEATHERMICROTOMEBLADER35切片刀、OlympusBX51正置熒光顯微鏡；二甲苯、無水乙醇、4% 多聚甲醛、1%PBS溶液、枸櫞酸緩沖溶液、抗熒光衰減封片劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1引物的設(shè)計(jì)與合成引物根據(jù)GenBank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)，由生工生物(上海)有限公司合成，相關(guān)引物的基本信息如表1所示，退火溫度為60 ℃。

表1　EphA2、EphrinA2和GAPDH基因引物信息

1.3.2皮膚組織總RNA的提取及cDNA的合成利用Trizol法提取皮膚組織總RNA，并經(jīng)Bioanalyzer2100(Agilent，CA，USA)檢測合格后用于cDNA的合成。cDNA第一鏈的合成，按照羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系20μL：SYBR?PremixEXTaqTMⅡ(2×)10μL，PCR正反向引物(10μmol·L-1)各0.5μL，DNA模板(<100ng)1.0μL，滅菌蒸餾水8.0μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參基因。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)量。

1.3.4石蠟切片制備將固定好的皮膚樣品修整為5mm×5mm×3mm的小塊，用PBS緩沖溶液浸泡10h，期間每隔1h更換一次液體；然后采用不同濃度酒精逐級脫水，二甲苯透明。隨后用石蠟(Ⅰ)、石蠟(Ⅱ)、石蠟(Ⅲ) 依次各浸蠟1h，然后包埋于小紙盒內(nèi)用于下一步試驗(yàn)。將包埋好的蠟塊修整后固定到切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5μm，共制得2套切片，1套用于EphA2和EphrinA2的免疫組化分析，另1套用于空白對照。

1.3.5熒光免疫組化常規(guī)脫蠟至水后，用PBS緩沖液浸泡10min。然后，在抗原修復(fù)盒中加入0.01mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液，將玻片浸入，在98 ℃ 溫度下保持15min后，自然冷卻至室溫。用PBS緩沖液洗3次，每次5min。滴加山羊血清后，放入濕盒中，置于37 ℃ 恒溫箱中20min進(jìn)行封閉。隨后，傾去封閉血清，并小心拭去組織片周圍的液體，滴加一抗(兔抗綿羊EphrinA2、兔抗綿羊EphA2)1∶150，覆蓋組織片。置于4 ℃ 冰箱過夜，同時(shí)利用PBS緩沖液代替一抗，作為陰性對照。用PBS緩沖液洗3次，每次5min，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，覆蓋組織片，放入濕盒內(nèi)并置于37 ℃ 恒溫箱中30min。用PBS緩沖液洗3次，每次5min，最后用抗熒光衰減劑封片，在熒光顯微鏡下鏡檢觀察并拍片分析。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

熒光定量PCR結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，所有數(shù)據(jù)采用SAS程序t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1總RNA提取

皮膚總RNA提取后，檢測結(jié)果如圖1所示，28S和18SRNA條帶明亮，且兩條帶的亮度比值接近2∶1；OD260nm/OD280nm比值為1.8～2.0。表明所提取的總RNA完整性良好，且濃度和純度可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖1　RNA質(zhì)量檢測Fig.1　Results of RNA quality

2.2EphA2及EphrinA2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

2.2.1EphA2及EphrinA2基因qRT-PCR擴(kuò)增引物檢測由圖2、圖3可知，EphA2和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線峰值圖上只有1個(gè)特征峰，表明在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中熒光信號均來自特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物，EphA2和內(nèi)參基因GAPDH均沒有非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，可以進(jìn)行下一步的數(shù)據(jù)分析。

圖2　EphA2和GAPDH熔解曲線Fig.2　The melt curves of EphA2 and GAPDH

2.2.2EphA2和EphrinA2基因的mRNA表達(dá)水平由圖4可知，不同時(shí)期細(xì)毛羊皮膚中EphA2基因mRNA相對表達(dá)量：胎齡120 d時(shí)顯著高于胎齡90 d和出生后1 d (P<0.01)；出生后30和1 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。由圖5可見，不同時(shí)期細(xì)毛羊皮膚中EphrinA2基因mRNA相對表達(dá)量：胎齡120 d時(shí)顯著高于胎齡90 d和出生后1 d(P<0.01)；出生后30和1 d時(shí)差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果與EphA2基因mRNA的表達(dá)趨勢一致。

2.3EphA2及EphrinA2在細(xì)毛羊皮膚發(fā)育過程中的分布規(guī)律

圖3　EphrinA2和GAPDH熔解曲線Fig.3　The melt curves of EphrinA2 and GAPDH

圖4　不同時(shí)期細(xì)毛羊體側(cè)皮膚中EphA2基因的相對表達(dá)量Fig.4　The relative expression level of EphA2 gene in skin of Fine Wool sheep in the different periods

圖5　不同時(shí)期細(xì)毛羊體側(cè)部皮膚中EphrinA2基因的相對表達(dá)量Fig.5　The relative expression level of EphrinA2 gene in skin of Fine Wool sheep in the different periods

2.3.1EphA2蛋白在細(xì)毛羊皮膚發(fā)育過程中表達(dá)及分布規(guī)律結(jié)果表明，EphA2蛋白，在胎齡90 d時(shí)，主要在表皮細(xì)胞、初級毛囊毛釘上皮細(xì)胞中表達(dá)(圖6A)；在胎齡120 d時(shí)，主要在皮脂腺細(xì)胞和毛囊的毛母質(zhì)細(xì)胞及靠近毛球的內(nèi)、外根鞘集束細(xì)胞中表達(dá)(圖6B)。在出生后1 d時(shí)，主要在表皮細(xì)胞、毛囊的毛母質(zhì)細(xì)胞及部分皮脂腺細(xì)胞中表達(dá)(圖6C)；在出生后30 d時(shí)，主要在毛囊的毛母質(zhì)細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞中表達(dá)，在毛干及表皮上皮細(xì)胞中僅有少量表達(dá)(圖6D)。

2.3.2Ephrin A2蛋白在細(xì)毛羊皮膚發(fā)育過程中表達(dá)及分布規(guī)律結(jié)果表明，Ephrin A2蛋白，胎齡90 d時(shí)，主要在表皮細(xì)胞表達(dá)，而在初、次級毛囊細(xì)胞中幾乎不表達(dá)(圖7A)；胎齡120 d時(shí)，主要在毛囊外根鞘細(xì)胞及毛母質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，少量表達(dá)于表皮細(xì)胞及皮脂腺細(xì)胞中(圖7B)；出生后1 d時(shí)，主要在毛囊的外根鞘細(xì)胞、毛母質(zhì)細(xì)胞和表皮細(xì)胞中表達(dá)(圖7C)；出生后30 d時(shí)，主要在毛囊的毛干細(xì)胞、外根鞘集束細(xì)胞中表達(dá)，少量表達(dá)于皮脂腺細(xì)胞和表皮細(xì)胞中(圖7D)。

EP.表皮；HP.初級毛囊毛釘；HF.毛囊：HM.毛母質(zhì)；SG.皮脂腺；SWG.汗腺;HS.毛干；ORS.外根鞘。A.胎齡 90 d(400×)；B.胎齡120 d(200×)；C.出生后1 d(100×)；D.出生后30 d(100×)。下同EP.Epidermis；HP.Hair peg；HF.Hair follicle；HM.Hair matrix；SG.Sebaceous gland；SWG.Sweat gland;HS.Hair shaft；ORS.Outer root sheath.A.E90 d of fetal period(400×)；B.E120 d of fetal period(200×)；C.1 d after birth(100×)；D.30 d after birth (100×).The same as below圖6　不同時(shí)期的細(xì)毛羊皮膚毛囊中EphA2蛋白的表達(dá)特征Fig.6　Expression characteristics of EphA2 protein in skin of Fine Wool sheep in the different period

SHG.次級毛囊毛芽。A.胎齡90 d;B.胎齡120 d；C.出生后1 d；D.出生后30 dSHG.Secondary follicles germ.A.E90 d of fetal period；B.E120 d of fetal period；C.1 d after birth；D.30 d after birth圖7　不同時(shí)期的敖漢細(xì)毛羊皮膚毛囊中Ephrin A2蛋白的表達(dá)特征Fig.7　Expression characteristics of Ephrin A2 protein in skin of Fine Wool sheep in the different periods 100×

3討論

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶( Extracellular regulated protein kinases，ERK)包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，主要通過進(jìn)入細(xì)胞核作用于E1k-1、c-myc、c-jun和ATF等轉(zhuǎn)錄因子起作用。ERK1/2調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，主要與細(xì)胞的增殖、分化密切相關(guān)。EphA2和EphA3則通過抑制ERK信號，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新[11]。研究表明，在野生型小鼠中，EphA2的活化能抑制ERK1/2的活性并減少細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞中EphrinA1是ERK1/2 MAPK的活性抑制因子；在角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，EphA2對EphrinA1誘導(dǎo)/抑制ERK1/2 MAPK的活性是必不可少的[12]；通過對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，可溶性Eph和Ephrin的胞外模擬肽可以促進(jìn)毛囊角質(zhì)細(xì)胞的增殖。EphA2和EphrinA1可能通過調(diào)節(jié)ERK1/2 MAPK的活性，來參與毛囊的凋亡和再生[13]。有研究顯示，破骨細(xì)胞中EphrinA2基因的表達(dá)，可以激活成骨細(xì)胞中的EphA2，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞中某些特異基因的激活[14]。在牙槽骨的成骨細(xì)胞中，EphrinA2依賴Ras和ERK1/2的作用，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)，延遲成骨細(xì)胞分化的信號傳遞[15]，而Ras和ERK1/2是EphA2信號系統(tǒng)的主要中間媒介。綜上，EphA2可能通過調(diào)節(jié)ERK1/2參與了毛囊的凋亡和再生，推斷EphA2/EphrinA2系統(tǒng)可能在毛囊發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，EphA2和EphrinA2基因mRNA表達(dá)水平，在胎齡120 d時(shí)顯著高于胎齡90 d時(shí)，在出生后1 d時(shí)顯著低于胎齡120 d時(shí)，出生后30 d時(shí)和出生后1 d時(shí)差異不顯著。有研究表明，在胚胎期的后三分之一時(shí)間段，細(xì)毛羊胎兒的次級毛囊數(shù)量增加緩慢，有時(shí)甚至停止[2]。這與本試驗(yàn)結(jié)果中，次級毛囊密度在出生后1 d時(shí)顯著低于胎齡120 d時(shí)，及與EphA2和EphrinA2 mRNA表達(dá)量水平趨勢相一致，由此初步推測EphA2和EphrinA2基因可能與此時(shí)期毛囊細(xì)胞增殖速度降低有一定關(guān)系。EphA2和EphrinA2基因mRNA表達(dá)趨勢與理論上次級毛囊密度的升降趨勢一致，結(jié)合相關(guān)研究，綜合推測EphA2/EphrinA2系統(tǒng)可能在誘導(dǎo)次級毛囊再分化為次級毛囊中具有重要作用，但由于樣本量的局限，其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

EphA2作為典型的細(xì)胞表面受體，主要在人皮膚角質(zhì)細(xì)胞的外膜上表達(dá)，同時(shí)也在人正常皮膚的表皮基底層及毛囊內(nèi)根鞘的角質(zhì)細(xì)胞，以及在小鼠皮脂腺和毛囊的外根鞘中表達(dá)[12，16-17]。研究顯示，在小鼠整個(gè)毛囊周期中，EphA2在不同的區(qū)域表達(dá)。在第一個(gè)生長期，主要在毛乳頭表達(dá)；在靜止期到生長期的過渡階段，則在杵狀毛周圍的一些隆突區(qū)的細(xì)胞中表達(dá)；在第二個(gè)生長期，主要在新形成的毛囊周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而在表皮和毛囊的上皮細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有表達(dá)[18]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，EphA2蛋白在不同時(shí)期敖漢細(xì)毛羊皮膚中，主要在毛囊的毛母質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)根鞘細(xì)胞和外根鞘細(xì)胞及表皮上皮細(xì)胞中表達(dá)。由于毛母質(zhì)的生長分化決定毛發(fā)的粗細(xì)和形狀，會誘導(dǎo)毛囊的再生；內(nèi)根鞘則包圍毛干，決定毛干的形狀；外根鞘包裹內(nèi)根鞘，起保護(hù)作用；由此推測EphA2蛋白可能在這些部位對細(xì)毛羊毛囊形態(tài)發(fā)育，特別是毛囊再生和細(xì)度方面起著一定的作用。綜上，EphA2和EphrinA2蛋白在與毛囊形成和形態(tài)變化相關(guān)的組織中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，表明其對毛囊的生長發(fā)育具有作用，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

綜上表明，EphA2和EphrinA2的mRNA表達(dá)量在細(xì)毛羊毛囊發(fā)育的不同時(shí)期呈現(xiàn)差異性表達(dá)，特別在次級毛囊的分化再生過程中表達(dá)量顯著升高；其蛋白在與毛囊發(fā)育相關(guān)的部位特異表達(dá)；綜合以上結(jié)果及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測EphA2和EphrinA2可能參與了毛囊的形態(tài)變化和發(fā)育過程，可能誘導(dǎo)次級毛囊的再分化，促進(jìn)毛囊密度的增加。結(jié)果可為細(xì)毛羊毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1]KLEIN R.Eph/ephrin signaling in morphogenesis，neural development and plasticity[J].CurrOpinCellBiol，2004，16(5):580-589.

[2]PASQUALE E B.Eph-ephrin bidirectional signaling in physiology and disease[J].Cell，2008，133(1):38-52.[3]WEI Q，LIU J，WANG N，et al.Structures of an Eph receptor tyrosine kinase and its potential activation mechanism[J].ActaCrystallogrDBiolCrystallogr，2014，70(Pt 12):3135-3143.

[4]HUOT J.Ephrin signaling in axon guidance[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry，2004，28(5)：813-818.

[5]SASAKI E，HIKONO H，KAKU Y，et al.EphA9，a novel avian receptor tyrosine kinase gene[J].Gene，2003，316：103-110.

[6]代勝軍.EphA/EphrinA在癲癇小鼠海馬的時(shí)空表達(dá)對顳葉癲癇形成的影響[D].成都：電子科技大學(xué)，2009.DAI S J.Effects of EphA/EphrinA expression levels to temporal lobe epilepsy formed in epilepticus mouse’ hippocampus[D].Chengdu：University of Electronic Science and Technology of China，2009.(in Chinese)

[7]SUBBARAYAL P，KARUNAKARAN K，WINKLER A C，et al.EphrinA2 receptor(EphA2) is an invasion and intracellular signaling receptor for Chlamydia trachomatis[J].PLoSPathog，2015，11(4)：e1004846.

[8]LIM B K，MATSUDA N，POO M M.Ephrin-B reverse signaling promotes structural and functional synaptic maturationinvivo[J].NatNeurosci，2008，11(2)：160-169.

[9]SURAWSKA H，MA P C，SALGIA R.The role of ephrins and Eph receptors in cancer[J].CytokineGrowthFactorRev，2004，15(6)：419-433.

[10]蔣澍.EphA/EphrinA信號系統(tǒng)在小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育中的表達(dá)與意義[D].長沙：中南大學(xué)，2014.

JIANG S.Expression of EphA/EphrinA in mouse retinal cell development[D].Changsha：Central South University，2014.(in Chinese)

[11]CHEN J，SONG W Q，AMATO K.Eph receptor tyrosine kinases in cancer stem cells[J].CytokineGrowthFactorRev，2015，26(1)：1-6.

[12]GUO H，MIAO H，GERBER L，et al.Disruption of EphA2 receptor tyrosine kinase leads to increased susceptibility to carcinogenesis in mouse skin[J].CancerRes，2006，66(14)：7050-7058.

[13]GENANDER M，HOLMBERG J，F(xiàn)RISéN J.Ephrins negatively regulate cell proliferation in the epidermis and hair follicle[J].StemCells，2010，28(7)：1196-1205.[14]IRIE N，TAKADA Y，WATANABE Y，et al.Bidirectional signaling through ephrinA2-EphA2 enhances osteoclastogenesis and suppresses osteoblastogenesis[J].JBiolChem，2009，284(21)：14637-14644.

[15]DIERCKE K，SEN S，KOHL A，et al.Compression-dependent up-regulation of ephrin-A2 in PDL fibroblasts attenuates osteogenesis[J].JDentRes，2011，90(9)：1108-1115.

[16]HAFNER C，BECKER B，LANDTHALER M，et al.Expression profile of Eph receptors and ephrin ligands in human skin and downregulation of EphA1 in nonmelanoma skin cancer[J].ModPathol，2006，19(10)：1369-1377.

[17]EASTY D J，HILL S P，HSU M Y，et al.Up-regulation of ephrin-A1 during melanoma progression[J].IntJCancer，1999，84(5)：494-501.

[18]YAMADA Y，MIDORIKAWA T，OURA H，et al.Ephrin-A3 not only increases the density of hair follicles but also accelerates anagen development in neonatal mice[J].JDermatolSci，2008，52(3)：178-185.

(編輯程金華)

ExpressionandDistributionofEphA2andEphrinA2inSkinofAohanFineWoolSheep

HEJian-ning1，WANGChun-liang2，ZHAOJin-shan1，CHENGMing3，LIUKai-dong3，LIUJi-feng1，LIUNan1*

(1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109， China；2.Nanchang Police Dog Base of the Ministry of Public Security，Nanchang 330100， China；3.Qingdao Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao 266121，China)

Abstract:TheobjectivesofthestudyweretoidentifytheexpressionanddistributionofEphA2andEphrinA2geneinhairfolliclesdevelopmentandmorphogenesisofFineWoolsheep.Theresultsmightlayatheoreticalbasisforunderstandingmolecularregulationmechanismofhairfollicledevelopment.SkinsofAohanFineWoolsheepinthedifferentperiod(prenatalstage,E90dandE120d;afterbirth, 1dand30d)wereselected.TheqRT-PCRandimmunohistochemicaltechnologieswereusedtostudytheirlevelsofmRNAandprotein.TheqRT-PCRresultsshowedthatmRNAexpressionlevelofEphA2andEphrinA2geneinE120dweresignificantlyhigherthanthatofE90dand1d(P<0.01)，but1dand30dwerenotsignificantlydifference(P>0.05).Immunohistochemicaldetectionresultsshowedthat,thelevelandlocalizationofEphA2andEphrinA2proteinwerespatialandtemporalspecificityamongE90d,E120d, 1dand30dofsheepskinbodyside.Andtheymainlyexpressedinhairfollicle,hairmatrixouterrootsheathandepidermis.Inconclusion, EphA2andEphrinA2mayplayimportantrolesinhairfollicledevelopmentandmorphogenesis.Theseresultswouldprovidefundamentalinformationfortherelatedresearchfields.

Keywords:finewoolsheepskin；EphA2；EphrinA2；expression；distribution

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.012

收稿日期：2015-09-08

基金項(xiàng)目：國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金(CARS-40)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402047)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金(631410)

作者簡介：賀建寧(1984-)，男，陜西靖邊人，博士，從事羊遺傳育種與繁殖研究，Tel：0532-88030498，E-mail：hexingxing104@163.com *通信作者：柳楠，教授，博士，E-mail：nanliu@sina.com

中圖分類號：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0509-06