曹　忻，鄒云龍，蔡　勇，周　平，李　明，石國慶，康相濤*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002； 2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730070；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧所，石河子 832000)

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綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中VEGF對DNMT3a表達(dá)的影響

曹忻1，2，鄒云龍2，蔡勇2，周平3，李明1，石國慶3，康相濤1*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002； 2.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730070；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧所，石河子 832000)

摘要：旨在探究血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中對DNMT3a的影響。本研究采用RNA干擾和顯微注射技術(shù)將針對VEGF兩個(gè)受體FLT1和KDR/Flk-1的有效干擾片段導(dǎo)入到綿羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocytescomplexes，COCs)中，檢測體外成熟培養(yǎng)各時(shí)間卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，無論是否添加VEGF，卵母細(xì)胞內(nèi)DNMT3amRNA表達(dá)量都隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，培養(yǎng)至8h時(shí)DNMT3amRNA表達(dá)量急速下降，之后下降速度放緩，至24h后各組趨于一致，且未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01)。添加VEGF組DNMT3amRNA表達(dá)量的下降速度快于未添加組。干擾片段導(dǎo)入后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT1-siRNA和KDR-siRNA復(fù)合干擾組干擾效果優(yōu)于KDR-siRNA干擾組，F(xiàn)LT1-siRNA干擾組干擾效果最弱(P<0.01)。無論是否添加VEGF，在COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，顆粒細(xì)胞DNMT3amRNA表達(dá)量都隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，且各組表達(dá)量差別不大。其中未注射干擾片段對照組的下降速度在COCs成熟培養(yǎng)中期快于其他干擾組(P<0.05或P<0.01)，F(xiàn)LT1-siRNA干擾效果較好。無論是否添加VEGF卵母細(xì)胞內(nèi)DNMT3a蛋白表達(dá)量從0～4h上升，之后勻速下降，至16h急速下降，24h為零。未導(dǎo)入干擾片段對照組下降速度最快。其中16h對照組、FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組DNMT3a蛋白表達(dá)量，添加VEGF后，分別下降到培養(yǎng)初期的23.12%、31.07%、41.47%和37.90%，未添加VEGF的組則分別下降到培養(yǎng)初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%。顆粒細(xì)胞中，添加VEGF組DNMT3a蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，至20h時(shí)，已無DNMT3a蛋白表達(dá)；未添加VEGF組從0～4h有略微上升，之后呈現(xiàn)逐漸均速下降趨勢，20h時(shí)，急速下降，至24h時(shí)，無DNMT3a蛋白表達(dá)，且干擾片段對DNMT3a蛋白表達(dá)影響不大，而本身顆粒細(xì)胞中DNMT3a蛋白表達(dá)量也不高。結(jié)果提示，綿羊COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，VEGF加快了卵母細(xì)胞中DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)量的下降速度。而干擾片段的導(dǎo)入則使DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)量下降速度放緩；顆粒細(xì)胞內(nèi)VEGF的添加和受體干擾片段的導(dǎo)入，對DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)影響效果不明顯。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長因子；DNMT3a；卵母細(xì)胞；綿羊；體外培養(yǎng)

血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一種促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷徙，抑制細(xì)胞凋亡，提高血管和微血管對大分子物質(zhì)通透性的生長因子[1-2]，其研究多集中在人類醫(yī)學(xué)，而關(guān)于動物方面的研究報(bào)道很少[3-4]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase，DNMT)保證基因印跡的建立和維持，DNMT的缺失或功能異常導(dǎo)致基因印跡的異常，這將嚴(yán)重阻礙胚胎的正常發(fā)育[5-6]。DNMT3a在細(xì)胞的生長和調(diào)亡中可以起到一定作用，能與P53直接作用而抑制P21的轉(zhuǎn)錄從而解除P21對細(xì)胞增殖的抑制作用[7]。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是通過綿羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocytescomplexes，COCs)體外成熟過程中同時(shí)促進(jìn)卵母細(xì)胞核成熟和胞質(zhì)成熟，以提高卵母細(xì)胞成熟率，為后期的體外授精和胚胎發(fā)育提供高質(zhì)量的成熟卵母細(xì)胞[8-11]。VEGF是通過存在于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的兩個(gè)受體FLT1(Thefms-liketyrosinekinase1)和KDR/Flk-1(Kinaseinsertdomainreceptor)相結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用[12]。本研究采用RNA干擾(InterferenceRNA，RNAi)技術(shù)將前期研究試驗(yàn)篩選出的針對VEGF受體FLT1和KDR/Flk-1的兩個(gè)有效干擾片段顯微注射到綿羊COCs中進(jìn)行體外培養(yǎng)，測定不同培養(yǎng)時(shí)間DNMT3amRNA和蛋白分別在綿羊卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)變化。探究在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中，VEGF對卵母細(xì)胞的成熟起到的促進(jìn)作用是否伴隨DNMT3a的表達(dá)變化，為后期VEGF在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育中的表觀遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1綿羊卵巢采集

新疆石河子市牛羊定點(diǎn)屠宰場屠宰的母羊，在30min內(nèi)用無菌手術(shù)剪刀剪下兩側(cè)卵巢，置于含青霉素60mg·L-1和鏈霉素100mg·L-1的25～30 ℃生理鹽水中，在3～4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。隨后用生理鹽水沖洗3或4次至無血水。剪去卵巢上附帶的輸卵管和系膜，隨后在超凈工作臺上用滅菌紗布吸干水分備用。

1.2綿羊COCs采集和體外培養(yǎng)

將準(zhǔn)備好的卵巢采用剖切法采集卵母細(xì)胞，即將清洗干凈的卵巢置于2%FBS洗卵液的培養(yǎng)皿中，然后用滅菌手術(shù)刀片對卵巢表面所有卵泡(2～6mm)進(jìn)行縱橫方向切割。選取形態(tài)正常、胞質(zhì)均勻并帶有致密卵丘細(xì)胞的A、B級COCs，用洗卵液清洗3～4遍，然后在成熟液中清洗1～2遍，放于含有2mL成熟液的30mm培養(yǎng)皿中聚堆培養(yǎng)24h，每堆卵母細(xì)胞數(shù)量控制在100枚左右，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5%的CO2空氣和飽和濕度。

成熟液成分：TCM199(GIBICOBRL.LotNo.1090183)+10%FBS+10μLFSH(中國科學(xué)院動物所)+10μg·mL-1LH(寧波第二激素廠)+1μg·mL-1E2(寧波第二激素廠)。

1.3siRNA干擾片段信息

篩選出的針對FLT1和KDR/Flk-1兩個(gè)受體基因進(jìn)行干擾的雙鏈小RNA干擾片段由上海吉凱基因有限公司設(shè)計(jì)合成。

表1　siRNA干擾片段信息

1.4顯微注射

在培養(yǎng)前將COCs表面部分顆粒細(xì)胞去除后，放入礦物油覆蓋的操作液滴中，用內(nèi)徑為0.2～0.3μm的注射針吸取20μm的siRNA母液進(jìn)行顯微注射。每個(gè)卵注射約5～9pL的siRNA，然后分組培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)時(shí)間為0、4、8、12、16、20、24h的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)定量和Westernblot檢測。

1.5試驗(yàn)分組

表 2中“+”表示添加5ng·mL-1VEGF，“-”表示不添加VEGF。VEGF添加劑量根據(jù)前期研究結(jié)果確定[8-9]。對照組為注射無效的干擾片段；FLT1干擾組為注射篩選出的FLT1-siRNA-2片段；KDR干擾組為注射篩選出的KDR-siRNA-1片段；FLT1和KDR干擾組為復(fù)合注射FLT1-siRNA-2及KDR-siRNA-1片段。

1.6RNA提取與cDNA合成

采用FastLineCellcDNAkit(天根生化科技有限公司)試劑盒，對卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞進(jìn)行RNA提取及cDNA第一鏈的合成。

1.7實(shí)時(shí)定量PCR

針對NCBI提供的mRNA序列，采用Primer5.0以及在線BLAST軟件設(shè)計(jì)引物，GAPDH為內(nèi)參。GAPDH (119bp)上游：5′-CCTGCCAAGTATGATGAGAT-3′;下游：5′-TGAGTGTCGCTGTT-GAAGT-3′；DNMT3a(60bp)上游：5′-TGTACG-

表2　試驗(yàn)分組

AGGTACGGCAGAAGTG-3′；下游：5′-GGCTCC-CACAAGAGATGCA-3′。引物由上海生工合成。

采用羅氏480II實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為LightCycle480SYBRGreenIMaster96模塊標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增條件為LightCycle480SYBRGreenIMaster96模塊標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件(退火溫度為60 ℃)。mRNA相對表達(dá)量采用2-ΔΔCT進(jìn)行計(jì)算。

1.8Westernblot檢測

取20μL經(jīng)變性處理后的蛋白質(zhì)樣品，于SDS-PAGE(10%)分離蛋白。用濕轉(zhuǎn)法，300mA1h，將電泳后的SDS-PAGE上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，通過彩虹MARK和示蹤染料檢查轉(zhuǎn)膜效率。將轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用Westernblot封閉液Ⅰ(BSA，pH7.5)室溫封閉1.5h，確保PVDF膜上非特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)被封閉。封閉后的PVDF膜經(jīng)TBST洗滌后用一抗室溫?fù)u床孵育1h。再經(jīng)TBST洗滌后，PVDF膜用二抗室溫?fù)u床孵育1h。PVDF膜用TBST沖洗兩次，然后用TBST洗滌5min，重復(fù)5～6次。用ECL對PVDF膜進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)后，于暗室用X光片對發(fā)光后的PVDF膜進(jìn)行曝光。Westernblot結(jié)果采用QuantityOne分析軟件對蛋白含量做相對定量統(tǒng)計(jì)分析并制表。

2結(jié)果

2.1綿羊COCs體外成熟過程中添加VEGF卵母細(xì)胞DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)效果

“O+”表示添加5 ng·mL-1VEGF。表達(dá)量標(biāo)注相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，標(biāo)注不同大字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同“O+” represent for adding 5 ng·mL-1VEGF.The expression levels with the same capital letters have no significant difference(P>0.05)；The expression levels with the different capital letters differ significantly (P<0.01).The same as below圖1　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)卵母細(xì)胞中DNMT3a mRNA表達(dá)水平(添加VEGF)Fig.1　DNMT3a mRNA expression level of oocytes at different COCs cultured time(adding VEGF)

從圖1中可以看出，添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞DNMT3amRNA表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01) 。培養(yǎng)8h是DNMT3amRNA表達(dá)量變化的拐點(diǎn)，即各組從培養(yǎng)初期的1.30×10-1驟降到8h的4.00×10-3左右，之后下降速度放緩，至24h時(shí)各組趨于一致。16h時(shí)FLT1-siRNA干擾組DNMT3amRNA表達(dá)量高于KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組表達(dá)量外，8h后其余時(shí)間點(diǎn)都低于這兩組的測定值，且差異極顯著(P<0.01) 。圖2和表3表明，添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞各個(gè)組中DNMT3a蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再下降最后為零的變化趨勢，尤其在16h時(shí)下降明顯。未注射干擾片段的對照組從0～4h時(shí)呈上升趨勢，之后勻速下降，至16h時(shí)急速下降為培養(yǎng)初期的23.12%，下降速度最快。注射干擾片段各個(gè)組從0～4h呈上升趨勢，之后下降，到16h時(shí)FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組DNMT3a蛋白表達(dá)量分別下降到培養(yǎng)初期的31.07%、41.47%和37.90%，24h時(shí)為0。

2.2綿羊COCs體外成熟過程中未添加VEGF卵母細(xì)胞DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)效果

表3　COCs中卵母細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(添加VEGF)

橫坐標(biāo)中每組的時(shí)間點(diǎn)為0、4、8、12、16、20和24 h。圖4、6和8同The time point of each group in X axis are 0，4，8，12，16，20 and 24 h.The same as Fig.4，F(xiàn)ig.6 and Fig.8圖2　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)卵母細(xì)胞中DNMT3a蛋白表達(dá)水平(添加VEGF)Fig.2　DNMT3a protein expression of oocytes at different COCs cultured time(adding VEGF)

從圖3中可以看出，未添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞DNMT3amRNA表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)呈下降趨勢，未注射干擾片段對照組的下降速度快于其他干擾組(P<0.01)。培養(yǎng)4和8h是DNMT3amRNA表達(dá)量變化的拐點(diǎn)，尤其8h驟降，F(xiàn)LT1-siRNA干擾組、KDR-siR-NA干擾組、FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組和對照組從培養(yǎng)初期的1.3×10-1下降到8h的4.80×10-3、4.80×10-3、7.80×10-3和4.00×10-3左右，之后下降速度放緩，至24h時(shí)各組幾乎趨于一致。在COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，DNMT3amRNA表達(dá)量FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組>KDR-siRNA干擾組>FLT1-siRNA干擾組>對照組(P<0.01)。圖4和表4結(jié)果表明，未添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞各個(gè)組中DNMT3a蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)從0～4h上升之后勻速下降，到16h后急速下降，最后為零的變化趨勢。未注射干擾片段對照組、FLT1-siRNA干擾組、KDR-siRNA干擾組和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組DNMT3a蛋白表達(dá)量4h時(shí)分別上升了5.65%、14.46%、19.30%和22.12%，之后勻速下降，至16h時(shí)下降為培養(yǎng)初期的37.38%、54.60%、57.58%和82.75%，對照組下降速度最快。

“O-”表示未添加5 ng·mL-1VEGF“O-” represent for without adding 5 ng·mL-1VEGF圖3　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)卵母細(xì)胞中DNMT3a mRNA表達(dá)水平(未添加VEGF)Fig.3　DNMT3a mRNA expression level of oocytes at different COCs cultured time(non-VEGF)

表4　COCs中卵母細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(未添加VEGF)

圖4　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)卵母細(xì)胞中DNMT3a蛋白表達(dá)水平(未添加VEGF)Fig.4　DNMT3a protein expression of oocytes at different COCs cultured time(non-VEGF)

2.3綿羊COCs體外成熟過程中添加VEGF顆粒細(xì)胞DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)效果

從圖5可以看出，添加了VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，顆粒細(xì)胞DNMT3amRNA表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，且各組表達(dá)量差別不大。其中未注射干擾片段對照組的下降速度在12h后快于其他干擾組，尤其快于KDR-siRNA和FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組(P<0.05)，而KDR-siRNA干擾組則較其他組略慢。DNMT3amRNA表達(dá)量從0h的6.00×10-2左右下降至16h后變?yōu)?，并維持到培養(yǎng)結(jié)束。圖6和表5可見，添加了VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，至20h時(shí)已無DNMT3a蛋白表達(dá)，且各組差異不大。從0～12h是勻速下降，到16h急速下降，各組下降到培養(yǎng)初期的25.07%。

表達(dá)量標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)The expression levels with the same small letters have no significant difference (P>0.05),with the different small letters significant difference (P<0.05)圖5　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)顆粒細(xì)胞中DNMT3a mRNA表達(dá)水平(添加VEGF)Fig.5　DNMT3a mRNA expression level of granule cells at different COCs cultured time(with VEGF)

表5　COCs中顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(添加VEGF)

圖6　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(添加VEGF)Fig.6　DNMT3a protein expression of granule cells at different COCs cultured time(adding VEGF)

2.4綿羊COCs體外成熟過程中未添加VEGF顆粒細(xì)胞DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)效果

從圖7中可以看出，未添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，顆粒細(xì)胞DNMT3amRNA表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)而降低，到20h表達(dá)量為0，并持續(xù)到卵母細(xì)胞成熟，且各組表達(dá)量差別不大。其中FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組較其他組DNMT3amRNA表達(dá)量略高。未注射干擾片段對照組8和16h時(shí)的DNMT3amRNA表達(dá)量略低于其他組(P<0.01)。圖8和表6可見，未添加VEGF的COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)量從0～4h有略微上升，之后呈現(xiàn)逐漸均速下降趨勢，20h時(shí)急速下降，至24h時(shí)無DNMT3a蛋白表達(dá)，且各組差異不大。FLT1-siRNA&KDR-siRNA復(fù)合干擾組較其他組DNMT3a蛋白表達(dá)量略高。20h時(shí)各組基本下降到培養(yǎng)初期的24.36%～24.49%。

圖7　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)顆粒細(xì)胞中DNMT3a mRNA表達(dá)水平(未添加VEGF)Fig.7　DNMT3a mRNA expression level of granule cells at different COCs cultured time(non-VEGF)

表6　COCs中顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(未添加VEGF)

圖8　COCs培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)顆粒細(xì)胞DNMT3a蛋白表達(dá)水平(未添加VEGF)Fig.8　DNMT3a protein expression of granule cells at different COCs cultured time(non-VEGF)

3討論

1942年表觀遺傳學(xué)的概念“Epigenetics”首次被提出，并指出表觀遺傳與遺傳是相對的[13-14]，主要研究基因型和表型的關(guān)系，并將其定義為研究生物發(fā)育機(jī)制的學(xué)科[15-16]。DNA甲基化(DNAmethylation)是表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)機(jī)制之一[17-18]，它是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶中5位碳原子上[19-20]。哺乳動物的DNMT家族主要成員：DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L等[21-22]。有研究表明胚胎中的DNMT3a主要遺傳于卵子并發(fā)揮表達(dá)作用[23]。在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中，沉默DNMT3a不能誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡[24]。D.Watanabe等[25]發(fā)現(xiàn)DNMT3a在卵及受精的胚胎中高表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育至囊胚期逐漸降低。而有關(guān)VEGF在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育中對DNMT3a的影響少見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，綿羊COCs體外成熟培養(yǎng)過程中，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞都存在DNMT3amRNA表達(dá)，且伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)表達(dá)量呈下降趨勢，說明DNMT3a在綿羊卵母細(xì)胞成熟過程中具有階段性和時(shí)效性表達(dá)。添加VEGF無論是在卵母細(xì)胞內(nèi)還是在顆粒細(xì)胞內(nèi)都加速了DNMT3amRNA表達(dá)量的下降，尤其在培養(yǎng)16h之前，當(dāng)卵母細(xì)胞成熟后(24h時(shí))則表達(dá)量幾乎趨于一致，說明VEGF在卵母細(xì)胞成熟過程中加速DNMT3amRNA表達(dá)量的下降。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在綿羊卵母細(xì)胞體外成熟前8hDNMT3amRNA表達(dá)量的下降速度很快，8h以后其下降速度放緩。一個(gè)好的、具有發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞要首先獲得生發(fā)泡破裂(Germinalvesiclebreakdown，GVBD)的能力，然后才能逐漸獲得完成成熟分裂的能力，以產(chǎn)生高質(zhì)量的、具有受精能力的卵母細(xì)胞[26]。而前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加VEGF有效促進(jìn)了綿羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中GVBD的完成[12]。說明DNMT3a的變化主要發(fā)生在卵母細(xì)胞成熟前期，尤其是生發(fā)泡破裂前，判斷VEGF可能由于促進(jìn)卵母細(xì)胞GVBD能力的獲得使得DNMT3amRNA表達(dá)量的下降變快。另外本試驗(yàn)中有效干擾片段導(dǎo)入后DNMT3amRNA表達(dá)量的下降速度放緩，說明干擾片段確實(shí)有效抑制受體FLT1和KDR的表達(dá)，從而影響到DNMT3amRNA表達(dá)量下降速度發(fā)生變化。其中復(fù)合干擾組效果優(yōu)于KDR干擾組，F(xiàn)LT1干擾組干擾效果最弱(P<0.01)。此外還可通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，卵母細(xì)胞中DNMT3amRNA的表達(dá)量高于在顆粒細(xì)胞中的，充分證明在綿羊卵丘卵母細(xì)胞體外成熟過程中DNMT3a的表達(dá)主要體現(xiàn)在卵母細(xì)胞中，此時(shí)顆粒細(xì)胞的輔助作用發(fā)揮不明顯。

哺乳動物卵母細(xì)胞的大多數(shù)RNA在卵母細(xì)胞的生長過程中積累并合成，GVBD1h內(nèi)RNA的合成維持低水平，一些新合成的RNA在GVBD前釋放到細(xì)胞質(zhì)，排卵時(shí)停止。因此卵母細(xì)胞和早期的胚胎的發(fā)育能力依賴于在排卵前mRNA和蛋白的積累[27]。本研究結(jié)果顯示，綿羊卵丘卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，雖然伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，DNMT3amRNA表達(dá)量呈下降趨勢，但其蛋白表達(dá)則不同。無論是否添加VEGF，卵母細(xì)胞中DNMT3a蛋白表達(dá)量從0～4h上升，之后勻速下降，在16h急速下降，最后為0。說明在DNMT3amRNA表達(dá)量下降的情況下，為了能更好的完成GVBD，DNMT3a蛋白在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)4～8h有強(qiáng)表達(dá)，而VEGF的介入使得DNMT3a蛋白下降速度加速，推測是因?yàn)樘砑覸EGF較未添加組卵母細(xì)胞更好更早的完成整個(gè)成熟過程所致，且一旦成熟過程趨于完成，DNMT3a蛋白表達(dá)立刻消失。而未導(dǎo)入干擾片段的對照組下降速度最快，說明VEGF受體干擾片段的導(dǎo)入有效提高DNMT3a蛋白的表達(dá)。其中在添加VEGF的情況下，KDR干擾組干擾效果優(yōu)于復(fù)合干擾組，F(xiàn)LT1干擾組效果最弱；未添加VEGF組復(fù)合干擾組效果優(yōu)于KDR干擾組，KDR干擾組優(yōu)于FLT1干擾組，說明KDR受體在整個(gè)卵母細(xì)胞成熟過程中是VEGF發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要途徑。顆粒細(xì)胞中，添加了VEGF組DNMT3a蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，至20h已無DNMT3a蛋白表達(dá)；未添加VEGF組從0～4h有略微上升，之后呈現(xiàn)逐漸均速下降趨勢，20h急速下降，至24h無DNMT3a蛋白表達(dá)，且干擾片段對DNMT3a蛋白表達(dá)影響不大。說明VEGF的外源添加和干擾片段的導(dǎo)入對于顆粒細(xì)胞中的DNMT3a蛋白表達(dá)無影響，且本身顆粒細(xì)胞中DNMT3a蛋白表達(dá)量也不高。

總之綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，受到諸多因素的影響，其卵母細(xì)胞成熟率仍然顯著低于體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞。而VEGF在卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)的改進(jìn)方面有著積極的促進(jìn)作用[8-12]，保證了卵母細(xì)胞的高成熟率和成熟質(zhì)量[8]，這種促進(jìn)作用也影響了DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)。綿羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中，VEGF加快了卵母細(xì)胞中DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)量的下降速度。而干擾片段的導(dǎo)入則使DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)量下降速度放緩；顆粒細(xì)胞中VEGF的添加和受體干擾片段的導(dǎo)入，對DNMT3amRNA和蛋白表達(dá)影響效果不明顯。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步研究綿羊卵母細(xì)胞體外成熟過程中DNA甲基化變化奠定基礎(chǔ)。

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(編輯程金華)

TheEffectsofVEGFonDNMT3aExpressioninOocytesMaturationofOvinein vitro

CAOXin1，2，ZOUYun-long2，CAIYong2，ZHOUPing3，LIMing1，SHIGuo-qing3，KANGXiang-tao1*

(1.College of Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2.Scientific Experimental Center，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730070，China；3.Xinjiang Academy of Agriculture and Reclamation Science，Shihezi 832000，China)

Abstract:Tostudytheeffectofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)onDNMT3aexpressionduringovineoocytesmaturationin vitro.Inthisresearch,inordertotestDNMT3amRNAandproteinexpressionofoocytesandgranulecells(GCs)atdifferenttimepointsduringcumulus-oocytescomplexes(COCs)culturedin vitro,RNAiandmicroinjectionwereusedtoimport2pairsofeffectivedoublechainsmallinterferingRNA(dsRNA)fragmentswhichweredesignedforVEGFreceptorsFLT1andKDR/Flk-1intoCOCs.Theresultsindicatedthat,duringtheculturingprocessofCOCsmaturationin vitro,theexpressionlevelofDNMT3amRNAofoocyteswouldbedecreasedregardlessofthepresenceofVEGF. DNMT3amRNAexpressionquantityfellsharplyatthe8h,then,itdecreasedslowlyandtendedtobesimilartoeachothergroupsatthe24h. DNMT3amRNAwithoutdsRNAofcontrolgroupsignificantlydeclinedfasterthanthatoftheothertreatmentgroups(P<0.01).TheexpressionlevelofDNMT3amRNAofVEGFgroupsinoocytesshowedafasterdecreasethanthegroupswithoutVEGF.AfterdsRNAfragmentsmicroinjection,interferingeffectofFLT1-siRNA&KDR-siRNAgroupwasbetterthanthatoftheKDR-siRNAgroupandthatofFLT1-siRNAgroupwasthelowest(P<0.01).Duringthematurationprocess, DNMT3amRNAofGCswouldbedecreasedregardlessofthepresenceofVEGF,andthedifferencebetweeneachgroupweretiny.AtthemidmaturityofCOCs, DNMT3amRNAwithoutdsRNAofcontrolgroupdecreasedfasterthanthatoftheothertreatmentgroups(P<0.05orP<0.01),andtheeffectofRNAionFLT1-siRNAgroupwasthebest.WhetheraddingVEGFornot,theproteinexpressionlevelofDNMT3ainoocyteshadbeenincreasingfrominitialtimeuntilthe4h,thenitstartedtodecreaseataconstantspeed.AnoteworthydecreaseofDNMT3aproteinexpressionwasthenobservedatthe16handwascompletelyunexpressedatthe24h.TheproteinexpressionlevelofDNMT3aincontrolgroupwithoutdsRNAhadthefastestdecreasingspeed.Atthe16h,DNMT3aproteinlevelsofthecontrolgroup,FLT1-siRNAgroup,KDR-siRNAgroupandFLT1-siRNA&KDR-siRNAgroupweredecreasedto23.12%, 31.07%, 41.47%and37.90%respectivelywithVEGFcomparingtothatofthe0h.Atthesametime,thatofthenon-VEGFgroupshaddecreasedto37.38%, 54.60%, 57.58%and82.75%.InGCs,DNMT3aproteinexpressionlevelsofgroupswithVEGFdecreasedgraduallysince0handcouldnotbetestedatthe20h,andthatofgroupswithoutVEGFincreasedslightlyfrom0to4h,thenpresentedtheaveragedeclinegraduallyuntilthe20hwherearapiddropappearedandwentcompletelyundetectedatthe24h.Inaddition,dsRNAhadnegligibleeffectonDNMT3aproteinexpressionlevels,whiletheoriginalDNMT3aproteinexpressionlevelintheGCswerelow.Inconclusion,duringtheprocessofCOCsmaturationin vitro,VEGFcouldacceleratethedecreasingspeedofbothmRNAandproteinexpressionlevelsofDNMT3a.dsRNAfragmentsmicroinjectioncouldslowdownthedecreasingspeedofbothmRNAandproteinlevelsofDNMT3a.VEGFanddsRNAhadnoobviousinfluencesonbothDNMT3amRNAandproteinexpressionofGCs.

Keywords:vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)；DNMT3a；oocytes；ovine;in vitro

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.009

收稿日期：2015-07-15

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31060309)；中國博士后科學(xué)基金(2012M511579)

作者簡介：曹忻(1978-)，女，寧夏人，副教授，博士后，主要從事動物遺傳育種與繁殖方面研究，E-mail：caoxin-juliet@163.com，Tel：0931-4512969 *通信作者：康相濤，教授，E-mail：Xtkang2001@263.net

中圖分類號：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0484-09