洪潛龍，張　穎，曹春偉，王憲龍，趙建國(guó)*

(1.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230601)

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巴馬小型豬OCA2基因序列、組織表達(dá)分析及載體構(gòu)建研究

洪潛龍1，2，張穎1，曹春偉1，王憲龍1，趙建國(guó)1*

(1.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 2.安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230601)

摘要：旨在為豬的毛色調(diào)控機(jī)制和模擬與OCA2基因相關(guān)的人類疾病模型的研究建立基礎(chǔ)。本研究將GenBank公布的豬OCA2基因序列(NC_010457.4)所缺失的5個(gè)外顯子(20～24號(hào)外顯子)進(jìn)行了克隆和劃分，在基因組水平和cDNA水平上采用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序方法對(duì)劃分結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證；并對(duì)OCA2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)在廣西巴馬小型豬中對(duì)OCA2基因外顯子的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了篩選。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Q-PCR)分析了OCA2基因在各組織中的表達(dá)規(guī)律，并以皮膚全長(zhǎng)cDNA為模板構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并利用XhoⅠ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。在已公布的豬OCA2基因中成功劃分和克隆了所缺失的外顯子，并在OCA2基因所有外顯子中共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中7個(gè)為同義突變，3個(gè)為錯(cuò)義突變(R124H、G509D、R573H)；豬OCA2基因在多種組織中廣泛表達(dá)，其中，肺、大腦、小腦相對(duì)高表達(dá)，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達(dá)，而在心和肝中表達(dá)量較低；OCA2基因重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證明構(gòu)建成功。本研究初步探討了豬OCA2基因的序列信息及組織表達(dá)規(guī)律，并構(gòu)建了OCA2基因重組表達(dá)質(zhì)粒，為該基因下一步的功能學(xué)研究及疾病模型的研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬；OCA2基因；熒光定量PCR ；重組表達(dá)質(zhì)粒；單核苷酸多態(tài)性

白化病(Albinism)是一組與黑色素合成相關(guān)的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致眼、皮膚、毛發(fā)或全身黑色素缺乏的一種單基因遺傳性疾病[1]。醫(yī)學(xué)上白化病分為3種類型，其中，眼、皮膚、毛發(fā)均有色素缺乏的稱為眼皮膚白化病(Oculocutaneous albinism，OCA)，僅有眼色素減少或缺乏的稱眼白化病(Ocular albinism，OA)，另外一種是除具有一定程度的眼皮膚白化病表現(xiàn)外，同時(shí)還具有免疫功能低下的Chediak-Higashi綜合征[2]和具有出血癥狀的Hermansky-Pudlak綜合征[3]。眼皮膚白化病分為4種亞型(OCAⅠ、OCAⅡ、OCAⅢ、OCAⅣ)，其致病基因分別為T(mén)YR、OCA2、TYRP1、SLC45A2[4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界范圍內(nèi)白化病的發(fā)病率約為1/17 000[5]，其中由OCA2基因突變引起的眼皮膚白化?、蛐桶l(fā)生頻率最高。

人類OCA2基因(NM_000275.2)定位于染色體15q11.2-15q12，基因組DNA全長(zhǎng)345 kb，mRNA長(zhǎng)3.4 kb，包含24個(gè)外顯子。OCA2基因編碼產(chǎn)物是一個(gè)由838個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜蛋白，含有12個(gè)跨膜區(qū)域，主要在黑色素細(xì)胞表達(dá)[6]。近年來(lái)關(guān)于眼皮膚白化病的研究相繼被報(bào)道，I.Yuasa等[7]報(bào)導(dǎo)了眼皮膚白化病人OCA2基因的14號(hào)外顯子內(nèi)發(fā)現(xiàn)G-A轉(zhuǎn)換，C.Rooryck等[8]在3個(gè)沒(méi)有血緣關(guān)系的眼皮膚白化病人的OCA2基因中發(fā)現(xiàn)了184 kb的缺失。目前對(duì)于眼皮膚白化病動(dòng)物模型研究相關(guān)的報(bào)道較少，且主要研究嚙齒類小型試驗(yàn)動(dòng)物模型。豬在遺傳、代謝、生理生化特性等方面比小鼠更接近于人類，因此在作為遺傳、發(fā)育、疾病模型以及提供異種器官移植等方面具有不可替代的優(yōu)勢(shì)[9]。另外豬皮膚的組織學(xué)與生化性質(zhì)與人類非常類似[10]，眼睛具有與人類類似的脈管系統(tǒng)和光感受器，已廣泛用于人類眼睛的外科手術(shù)[11]，本研究以豬為模型對(duì)OCA2基因進(jìn)行相關(guān)的研究。

豬OCA2基因(NC_010457.4)位于15號(hào)染色體，目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank上公布的基因序列只包括19個(gè)外顯子，而將19個(gè)外顯子拼接分析發(fā)現(xiàn)，其總長(zhǎng)要比mRNA(NM_214094)短，故推斷NCBI所公布的OCA2基因序列不夠完整。雖然已報(bào)道的五指山豬全基因組測(cè)序研究提示豬基因組中存在缺失的序列，但是目前尚未有研究在基因組DNA和mRNA水平上將OCA2基因的外顯子序列進(jìn)行精細(xì)定位和驗(yàn)證。本研究旨在完善OCA2基因的序列信息并對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)Q-PCR研究豬OCA2基因的組織表達(dá)特點(diǎn)和規(guī)律，并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，為下一步基因功能和眼皮膚白化病疾病模型研究建立基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料和試劑

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物為廣西巴馬小型豬，來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所北方大動(dòng)物研究基地。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在18～25 ℃，相對(duì)濕度為 40%～70%，每日飼喂2次，每日飼料量為體重的3%。按照北京市試驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)范試驗(yàn)操作。

1.1.2主要試劑TIANamp Genomic DNA 試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA MarkerⅡ和Ⅲ、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒、卡那霉素等試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，DL10000 DNA Marker、6×Loading Buffer、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)、E.coliDH5α Competent Cells購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，pEGFP-N1質(zhì)粒購(gòu)自Clontech公司，XhoⅠ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶、Phusion超保真PCR Master Mix、T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司，快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣本采集取100頭巴馬小型豬的耳組織用于提取基因組DNA，ddH2O溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采?頭8月齡成年豬的心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦、胃、盲腸、皮膚等組織樣本提取RNA，樣品采集后立即放入液氮速凍，-80 ℃保存，用于Q-PCR和克隆。

1.2.2DNA提取 按照TIANamp Genomic DNA 試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取，溶于ddH2O，用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增巴馬豬OCA2基因的24個(gè)外顯子，引物由Invitrogen公司合成，序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，最適溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余樣本送往Invitrogen公司測(cè)序，用Chromas軟件分析測(cè)序峰圖和堿基序列。

1.2.4引用的數(shù)據(jù)庫(kù)豬基因組信息系統(tǒng)( Pig Genomic Informatics System，PigGIS)(http://pig.genomics.org.cn/)對(duì)豬的基因進(jìn)行了準(zhǔn)確的注釋，人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Mutation Database)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)收錄了文章報(bào)導(dǎo)的人類遺傳性疾病的突變位點(diǎn)，NCBI中的dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=)對(duì)豬中存在的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行了匯總。

1.2.5生物信息學(xué)分析用Clustal 2.1分析軟件將豬和黑猩猩、恒河猴、人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)的OCA2基因的編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；通過(guò)NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)在線預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域；用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件對(duì)豬OCA2蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.6RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄總RNA的提取方法參照Invitrogen公司的Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取的總RNA用RNase-free水充分溶解。根據(jù)天根生化科技有限公司的FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒里的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成，保存于-20 ℃。

1.2.7RT-PCR和熒光定量PCR根據(jù)GenBank公布的OCA2基因的mRNA序列(NM_214094)設(shè)計(jì)普通RT-PCR引物和熒光定量PCR引物，內(nèi)參選擇GAPDH基因，具體信息見(jiàn)表2。RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL： 2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。熒光定量PCR試驗(yàn)利用Agilent Technologies公司的Stratagene Mx3005P儀器完成，反應(yīng)步驟：95 ℃ 60 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線的制作：95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s。根據(jù)倍比稀釋法制作內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，目標(biāo)基因樣本和GAPDH內(nèi)參樣本重復(fù)3次進(jìn)行擴(kuò)增，且均有空白對(duì)照組，采用2-△△CT方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.8OCA2基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以皮膚總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，根據(jù)OCA2的mRNA序列(NM_214094)設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Phusion HF PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，DMSO 0.6 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR產(chǎn)物用快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ型切膠回收，用XhoⅠ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)純化的PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后，將目的基因和載體用T4 DNA連接酶連接，將連接載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，涂布于預(yù)先加入卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑單克隆搖菌經(jīng)酶切鑒定后送Invitrogen公司測(cè)序。

2結(jié)果

2.1豬OCA2基因結(jié)構(gòu)分析及缺失外顯子的位置劃分

表1　OCA2基因PCR擴(kuò)增引物信息

表2　豬OCA2基因的cDNA PCR擴(kuò)增的引物信息

圖1　人、小鼠、豬OCA2基因結(jié)構(gòu)Fig.1　The structure of OCA2 gene in human，mouse and pig

小鼠和人的OCA2基因均由24個(gè)外顯子組成，而目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的GenBank公布的豬OCA2基因僅包括19個(gè)外顯子，且將其拼接分析發(fā)現(xiàn)總長(zhǎng)要比全長(zhǎng)mRNA短(NM_214094)(圖1)，故推斷NCBI所公布的OCA2基因序列不夠完整。根據(jù)五指山豬的基因組序列[12]和GenBank公布的OCA2基因cDNA序列(NM_214094)，將豬OCA2基因序列(NC_010457.4)所缺失的5個(gè)外顯子(20～24號(hào)外顯子)的位置進(jìn)行了劃分(圖2)。

2.2豬OCA2基因未注釋的外顯子在基因組水平上的驗(yàn)證

根據(jù)GenBank公布的豬OCA2基因19個(gè)外顯子和上述劃分的5個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3和圖4所示。24個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性均較好，并經(jīng)Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)20～24號(hào)外顯子的大小以及在基因組的位置與預(yù)測(cè)的一致。

2.3豬OCA2基因未注釋的外顯子在cDNA水平上的驗(yàn)證

由于GenBank公布的豬OCA2基因的cDNA序列(NM_214094)是通過(guò)試驗(yàn)獲得并公布的[13]，故根據(jù)基因組20～24號(hào)外顯子區(qū)域所對(duì)應(yīng)的cDNA設(shè)計(jì)引物(表2)并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖5)和Sanger測(cè)序結(jié)果同樣驗(yàn)證了上述在基因組中對(duì)20～24號(hào)外顯子序列劃分的準(zhǔn)確性。

2.4豬OCA2基因生物信息學(xué)分析

將NCBI所公布的豬(NC_010457.4)和黑猩猩(NC_006482.3)、恒河猴(NC_007864.1)、人(NC_000015.10)、小鼠(NC_000073.6)、大鼠(NC_005100.4)、斑馬魚(yú)(NC_007117)的OCA2基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，相對(duì)于人而言，除了靈長(zhǎng)類外，豬與其同源性最高(表3)； CDD檢測(cè)結(jié)果顯示，OCA2蛋白中具有ArsB/NhaD permease 超家族和Citrate transporter兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖6)，利用SMART程序進(jìn)行的蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，豬OCA2具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖7)。

2.5豬OCA2基因外顯子多態(tài)位點(diǎn)的分析

獲得了豬OCA2基因的全部外顯子后，在群體中隨機(jī)選擇了100頭巴馬豬，提取耳組織DNA，分別根據(jù)表1中所設(shè)計(jì)的24個(gè)外顯子的引物擴(kuò)增PCR并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬豬OCA2基因中存在 10個(gè)單堿基突變位點(diǎn)，其中7個(gè)為同義突變，3個(gè)為錯(cuò)義突變(圖8)：外顯子4中的c.371G>A轉(zhuǎn)換，外顯子15的c.1526G>A轉(zhuǎn)換和外顯子16的c.1718G>A轉(zhuǎn)換，3個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)在NCBI中豬的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)均有已知的SNPs ID號(hào)(表4)，而在人的HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的82個(gè)OCA2基因單堿基突變的位點(diǎn)中并未發(fā)現(xiàn)與本次研究中同源對(duì)應(yīng)的SNPs位點(diǎn)。

下劃線為外顯子，省略號(hào)為內(nèi)含子underline represent exons，apostrophe represent introns圖2　豬OCA2基因20～24號(hào)外顯子的定位Fig.2　The location of exons 20-24 in OCA2 gene of pig

1～19.分別表示1～19號(hào)外顯子；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1～19.Represent exon 1-19；M.Marker Ⅱ圖3　OCA2基因第1～19外顯子的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3　The PCR results of exons 1-19 in OCA2 gene

20-1、20-2.外顯子20；21-1、21-2.外顯子21；22-1、22-2.外顯子22；23-1、23-2.外顯子23；24-1、24-2、24-3、24-4.外顯子24，每個(gè)樣本兩個(gè)重復(fù)；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)20-1，20-2.Exon 20；21-1，21-2.Exon 21；22-1，22-2.Exon 22；23-1，23-2.Exon 23；24-1，24-2，24-3，24-4.Exon 24，twice per sample；M.Marker Ⅱ圖4　OCA2基因第20～24外顯子的基因組PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.4　The validation results of exons 20-24 in OCA2 gene by PCR

1～4.RT-PCR產(chǎn)物，代表4個(gè)樣本；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-4.RT-PCR products for 4 samples；M.Marker Ⅱ圖5　OCA2基因第20～24外顯子cDNA的PCR產(chǎn)物Fig.5　The PCR amplification products of exon 20-24 for cDNA of OCA2 gene

2.6豬OCA2基因mRNA水平組織表達(dá)分析

利用相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測(cè)了OCA2基因在巴馬豬的心、肝、脾、肺、大腦、小腦、胃、盲腸、皮膚中mRNA的表達(dá)情況(圖9)。結(jié)果表明，在巴馬豬中，OCA2基因在不同組織中均有不同程度的表達(dá)。其中，肺、大腦、小腦相對(duì)高表達(dá)，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達(dá)，而在心和肝中表達(dá)量較低。

2.7OCA2基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以豬皮膚組織的cDNA為模板，擴(kuò)增得到與預(yù)期全長(zhǎng)CDS序列片段大小相符的特異性片段?；厥盏腜CR產(chǎn)物與pEGFP-N1連接的重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和SacⅡ限制性內(nèi)切酶雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)與預(yù)期相符的兩條帶：分別為2 638 bp的目的片段和4 733 bp的載體片段(圖10)，且經(jīng)Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確。

表3　巴馬小型豬與6個(gè)物種間OCA2基因氨基酸序列同源性比較

圖6　豬OCA2保守結(jié)構(gòu)域Fig.6　The conserved domains of pig OCA2

圖7　豬OCA2蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.7　The transmembrane domains of pig OCA2

表4　巴馬小型豬OCA2基因的多態(tài)位點(diǎn)信息

圖8　OCA2基因的錯(cuò)義突變位點(diǎn)測(cè)序圖譜Fig.8　The sequencing chromatograms of missense sites of OCA2 gene

3討論

本研究以巴馬小型豬為模型完善了OCA2基因外顯子序列信息，并檢測(cè)和分析了OCA2基因在各組織中的表達(dá)情況，成功構(gòu)建了OCA2基因載體，為后續(xù)功能學(xué)研究及疾病模型構(gòu)建建立了基礎(chǔ)。目前對(duì)眼皮膚白化病的研究較少，且主要研究嚙齒類小型試驗(yàn)動(dòng)物模型[14]，由于小型哺乳動(dòng)物體型過(guò)小，可操作性差，更為重要的是與人的解剖結(jié)構(gòu)相差甚遠(yuǎn)，所以限制了人類疾病模型的創(chuàng)制。巴馬小型豬由于體型小、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，增加了試驗(yàn)的可操作性以及節(jié)省了飼養(yǎng)成本，與體型大的豬相比較具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)對(duì)OCA2基因的氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，豬與人的同源性較高，這一結(jié)果無(wú)疑增添了豬作為該類疾病模型的研究具有優(yōu)勢(shì)的科學(xué)依據(jù)。

圖9　豬OCA2基因在mRNA水平上的多組織表達(dá)譜分析Fig.9　The tissue expression profile of OCA2 gene at the mRNA level in pig

1.CDS序列全長(zhǎng)；2.單酶切產(chǎn)物；3.雙酶切產(chǎn)物；4.空載體；5.CDS序列全長(zhǎng)；M1、M2.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.Full-length CDS；2.SAFLP；3.Double digestion；4.Empty vector；5.Full-length CDS；M1.DL10000 DNA marker；M2.Marker Ⅲ圖10　豬OCA2基因CDS全長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增和pEGFP-N1-OCA2表達(dá)載體酶切鑒定Fig.10　PCR product of OCA2 gene and digestion of pEGFP-N1-OCA2

基因序列信息完整性是一切后續(xù)的基因功能研究的基本前提，而目前NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank公布的OCA2基因序列不夠完整。雖然五指山豬全基因組測(cè)序研究提示存在缺失的序列，但目前尚未有研究通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)行精細(xì)地分析和確認(rèn)，因此完善豬OCA2基因信息具有極大的必要性。而且，這也是以基因組修飾創(chuàng)制豬眼皮膚白化?、蛐湍Ｐ脱芯康幕A(chǔ)。為此，本研究將OCA2基因未注釋的外顯子部分進(jìn)行了劃分。通過(guò)在這些劃分的序列周圍設(shè)計(jì)引物，同時(shí)在基因組和cDNA水平上對(duì)所缺失區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序分析，最終證實(shí)巴馬豬基因組中確實(shí)存在以上序列。本研究獲得了豬OCA2基因的全部外顯子后，在巴馬豬群體中篩選SNPs位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巴馬豬OCA2基因外顯子中存在 10個(gè)單堿基突變位點(diǎn)，其中3個(gè)為錯(cuò)義突變，且在豬的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)中均已報(bào)道。截止目前，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中共收錄了82個(gè)OCA2基因單堿基突變位點(diǎn)，例如，W.S.Oetting等[15]發(fā)現(xiàn)了人S86R、C112F、A368V、T592I、A724P 和 A787V與眼皮膚白化?、蛐拖嚓P(guān)，W.S.Oetting等[16]報(bào)導(dǎo)了2個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)(Ile646Val 和 Val519Ala)會(huì)導(dǎo)致人眼皮膚白化?、蛐?，然而以上所有位點(diǎn)均與本次研究中發(fā)現(xiàn)的SNPs位點(diǎn)不同，說(shuō)明在巴馬豬自然群體中并未發(fā)現(xiàn)與人類OCA2基因突變引發(fā)的眼皮膚白化?、蛐拖嚓P(guān)的模型，同時(shí)反映出未來(lái)通過(guò)對(duì)巴馬豬基因組修飾來(lái)獲得眼皮膚白化?、蛐湍Ｐ偷谋匾浴?/p>

由于OCA2基因組織表達(dá)的相關(guān)報(bào)道較少，且在不同組織中發(fā)揮的生物學(xué)功能未知。利用相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測(cè)了OCA2基因在巴馬豬各組織的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在巴馬豬中，OCA2基因在不同組織中均有不同程度的表達(dá)。其中，肺、大腦、小腦相對(duì)高表達(dá)，脾、胃、盲腸和皮膚中度表達(dá)，而在心和肝中表達(dá)量較低。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得知，OCA2基因在人類組織器官中也具有廣泛表達(dá)的特性，而且也在皮膚中相對(duì)高表達(dá)。OCA2基因的多組織表達(dá)表明其不僅在皮膚和眼睛中發(fā)揮主要作用，在其他組織中也可能扮演了重要的角色。此外，本研究成功構(gòu)建了OCA2基因重組表達(dá)質(zhì)粒，為該基因下一步的功能學(xué)研究建立了基礎(chǔ)。

找到合適的動(dòng)物模型來(lái)研究人類疾病，已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床藥物開(kāi)發(fā)和治療研究的關(guān)鍵。豬作為大動(dòng)物模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類的多種復(fù)雜的疾病模型中，比如心血管疾病模型等，而眼部和皮膚相關(guān)的疾病模型在大動(dòng)物中研究較少?；蚪M編輯技術(shù)(比如TALEN[17]、CRISPR-Cas9技術(shù)[18])由于相對(duì)經(jīng)濟(jì)和高效，已經(jīng)在動(dòng)物疾病模型構(gòu)建中興起，然而由于基因組的信息不完善從不同程度上阻礙了疾病模型的創(chuàng)建。本研究以巴馬豬為研究對(duì)象，初步探討了OCA2基因序列信息、組織表達(dá)規(guī)律和載體的構(gòu)建，為OCA2基因的功能研究提供了基礎(chǔ)。

4結(jié)論

本研究完善了OCA2基因的序列信息，并通過(guò)Q-PCR研究了豬OCA2基因的組織表達(dá)特點(diǎn)和規(guī)律，并成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，為下一步基因功能和眼皮膚白化病疾病模型的研究建立了基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

Analysis of Sequence，Tissue Expression and Vector Construction ofOCA2 Gene in Bama Miniature Pigs

HONG Qian-long1，2，ZHANG Ying1，CAO Chun-wei1，WANG Xian-long1，ZHAO Jian-guo1*

(1.StateKeyLaboratoryofStemCellandReproductiveBiology，InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences，Beijing100101，China；2.SchoolofLifeSciences，AnhuiUniversity，Hefei230601，China)

Abstract:In order to establish scientific basis for farm animal models associated with coat color mechanism and human diseases inOCA2 gene，we carried out this experiment.The exons 20-24 of porcineOCA2 gene(NC_010457.4) in absence in GenBank were cloned and mapped.The mapping result was confirmed at the genomic and cDNA levels using PCR amplification and Sanger sequencing simultaneously.Bioinformatics analysis was performed forOCA2 gene.Polymorphic loci of all exons forOCA2 gene were screened in Guangxi Bama Miniature pigs.Meanwhile，the mRNA expression in different tissues was detected by real-time fluorescence quantitative PCR(Q-PCR).A full-length skin cDNA was used as a template to construct recombinant expression plasmid，and thenXhoⅠandSacⅡrestriction enzyme double digestion was carried out.We mapped and cloned the porcineOCA2 gene in GenBank successfully.A total of 10 SNP loci were found in all exons，including 7 synonymous mutations and 3 missense mutations(R124H，G509D，R573H).PorcineOCA2 gene was widely expressed in various tissues.The expression in lung，brain and cerebellum was at relatively higher level compared to that in spleen，stomach，caecum and skin，which exhibited moderate expression level，and the expression level in heart and liver was lower.pEGFP-N1-OCA2 recombinant plasmid was constructed successfully after confirmation of restriction enzyme double digestion and sequencing.This study explored porcineOCA2 gene sequence information and mRNA expression preliminarily，and recombinant expression plasmid ofOCA2 gene was constructed，which provide the foundation for the study of disease model and gene biological function in future.

Key words:pig；OCA2 gene；Q-PCR；recombinant expression plasmid；SNP

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.004

收稿日期：2015-03-30

基金項(xiàng)目：973國(guó)家科技重大專項(xiàng)(2011CBA01005)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2012AA020602)

作者簡(jiǎn)介：洪潛龍(1988-)，男，安徽潛山人，碩士，主要從事大動(dòng)物遺傳修飾研究，E-mail:hongqianlong.1988@163.com *通信作者：趙建國(guó)，研究員，E-mail:zhaojg@ioz.ac.cn

中圖分類號(hào)：S828；S813.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)03-0439-10