陳 雷，孔衛(wèi)賀，韓曉霞，趙 冰*

1. 吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平 136000

2. 吉林大學(xué)超分子結(jié)構(gòu)與材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)對(duì)非標(biāo)記蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

陳 雷1, 2，孔衛(wèi)賀1，韓曉霞2，趙 冰2*

1. 吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平 136000

2. 吉林大學(xué)超分子結(jié)構(gòu)與材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130012

基于表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)在非標(biāo)記蛋白質(zhì)研究方面的最新進(jìn)展。SERS是一個(gè)特殊的拉曼光譜現(xiàn)象，對(duì)于眾多被吸附到粗糙金屬表面上的拉曼活性分析物，可以提供增強(qiáng)拉曼信號(hào)(通?？梢栽鰪?qiáng)幾個(gè)數(shù)量級(jí))。SERS是一個(gè)靈敏的，選擇性的，和通用的技術(shù)，并且可以實(shí)時(shí)、快速的對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。因此，在基于儀器儀表技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法以及SERS在生物體系中的諸多優(yōu)勢(shì)，SERS經(jīng)歷了快速的發(fā)展階段。重點(diǎn)介紹幾個(gè)采用SERS技術(shù)對(duì)生物體系的代表性研究。某些SERS的生物應(yīng)用發(fā)展比較成熟，并已經(jīng)可以小范圍臨床應(yīng)用，而有些還停留在發(fā)展的初始階段(實(shí)驗(yàn)室研究階段)。討論了最近發(fā)展起來(lái)的幾種基于SERS技術(shù)定量分析的方法, 選擇不同SERS活性基底和技術(shù)(如生物分子在電極上，膠體納米粒子，周期性圖案結(jié)構(gòu)和基于針尖拉曼技術(shù))對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直接研究。此外，根據(jù)SERS指紋信息的變化可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)-配體間的相互作用?；赟ERS技術(shù)對(duì)生物分子進(jìn)行定性和/或定量分析方面顯示出了相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)。

表面增強(qiáng)拉曼光譜；蛋白質(zhì)；非標(biāo)記方法；定性分析；定量分析

1 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的一般概述

拉曼光譜和紅外吸收光譜是通過(guò)分析分子振動(dòng)信息實(shí)現(xiàn)對(duì)分子結(jié)構(gòu)的解析，目前已經(jīng)成為最廣泛使用的分析技術(shù)。拉曼光譜可以提供解析分子結(jié)構(gòu)的指紋信息。特別是，拉曼光譜在生物體系研究中具有諸多優(yōu)勢(shì)，它可以實(shí)現(xiàn)生物分子的無(wú)損分析和超高的檢測(cè)靈敏度。并且拉曼光譜特別適用于水體系研究，因此拉曼光譜也被認(rèn)為是生命體系研究。拉曼散射是光子與分子之間的非彈性碰撞[1-3]。當(dāng)光從分子中被分散出來(lái)，散射光的一小部分(約1千萬(wàn)分之1個(gè)光子)，通過(guò)激發(fā)被散射出來(lái)，因?yàn)樯⑸涔庾优c入射的光子具有不同的頻率，因此光子與分子之間發(fā)生了能量交換而產(chǎn)生拉曼散射。SERS是表面敏感的分析技術(shù)，當(dāng)分子吸附于粗糙的貴金屬表面(例如金，銀，和銅)時(shí)會(huì)產(chǎn)生拉曼信號(hào)增強(qiáng)的現(xiàn)象(如圖1)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的不同現(xiàn)象，關(guān)于SERS的許多理論在早期階段就被提出來(lái)了，并且有很多種解釋。在眾多理論中大多數(shù)研究人員都接受一個(gè)由兩部分組成的理論。拉曼信號(hào)的增強(qiáng)，通常歸因于兩個(gè)不同的因素[4-12]：電磁(EM)和化學(xué)增強(qiáng)(電荷轉(zhuǎn)移，CT)。在電磁增強(qiáng)方面，一個(gè)分析物被吸附到或接近粗糙金屬表面時(shí)，由于金屬表面能夠在表面發(fā)生等離子體震蕩現(xiàn)象，因此分析物可以受到電磁場(chǎng)的影響而被增強(qiáng)。在化學(xué)增強(qiáng)或電荷轉(zhuǎn)移方面，首先，分析物要吸附在金屬表面，通過(guò)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生增強(qiáng)的現(xiàn)象(金屬-分子-金屬)。因此，化學(xué)增強(qiáng)僅僅可能發(fā)生在吸附表面的分析物的第一層，而EM增強(qiáng)可能發(fā)生在第二層或其后表面層。有些增強(qiáng)的效能已經(jīng)高達(dá)10納米或離金屬表面層更遠(yuǎn)的距離[4-5]。

圖1 靶分子吸附于金屬粒子基底的SERS示意圖

2 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在蛋白質(zhì)研究方面的優(yōu)勢(shì)和限制

蛋白質(zhì)對(duì)于生命體來(lái)說(shuō)是必要的，因?yàn)樗麄兪羌?xì)胞新陳代謝的主要組成部分。SERS是一項(xiàng)非常靈敏的技術(shù)，在高通量的生物分子檢測(cè)方面已經(jīng)被證實(shí)具有很大的潛力，特別是在蛋白質(zhì)的檢測(cè)方面。關(guān)于蛋白質(zhì)的研究?jī)H僅涉及到氨基酸的側(cè)鏈，而一些研究小組從兩個(gè)酰胺基團(tuán)和側(cè)鏈取得了SERS信號(hào)。目前，生物分子(非標(biāo)記法)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息和外在的SERS標(biāo)簽(標(biāo)記法)是用于直接和間接檢測(cè)生物分子的兩種獨(dú)立的方法。標(biāo)記法需要適當(dāng)?shù)娜玖蠘?biāo)簽，該標(biāo)簽若在某一激發(fā)線(xiàn)下存在共振的現(xiàn)象，則可以提供附加的增強(qiáng)信號(hào)，因此它的檢測(cè)靈敏度更高。而非標(biāo)記的手段，得到的都是蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸骨架的信息，該光譜的重現(xiàn)性差，蛋白質(zhì)吸附位點(diǎn)的非重現(xiàn)性以及蛋白質(zhì)吸附于金屬表面的變性等問(wèn)題，都會(huì)對(duì)非標(biāo)記方法研究帶來(lái)困難。但是非標(biāo)記手段給出的信息更直接的分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)的解析有很大幫助。

3 應(yīng)用不同SERS活性材料用于蛋白質(zhì)的直接分析

SERS活性基底對(duì)于SERS技術(shù)的生物分析與檢測(cè)方面都起著重要的作用。由于SERS的發(fā)現(xiàn)，各種各樣的SERS活性基底被發(fā)展起來(lái)并應(yīng)用于生物檢驗(yàn)。一個(gè)理想的SERS活性基底應(yīng)該具有以下四個(gè)特點(diǎn)：(1)具有很高的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)；(2)具有均勻的表面，使得SERS信號(hào)重現(xiàn)性好；(3)提供良好的光譜穩(wěn)定性；以及(4)能夠從雜散SERS信號(hào)中區(qū)分出其本身。

蛋白質(zhì)的直接的SERS分析可以給出蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)信息，這種方法更可靠、更靈敏并且更具有選擇性。隨著新型SERS活性基底的發(fā)展，拉曼光譜儀器，以及樣品前處理的方法的改進(jìn)，使得該分析方法更具有權(quán)威性，并且被認(rèn)為是具有前途的分析技術(shù)。

3.1 金屬電極

基于電化學(xué)粗糙的金屬電極的蛋白質(zhì)研究中，通常利用循環(huán)伏安法，處理電極表面結(jié)構(gòu)[13-14]。銀或金電極表面可以通過(guò)自組裝膜等覆蓋，提高了基底表面的生物相容性(圖2)[15-18]。

電極上的信號(hào)增強(qiáng)機(jī)制同樣可以依靠電磁場(chǎng)和化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制來(lái)解釋。金屬電極的表面粗糙度通常通過(guò)電化學(xué)粗糙化產(chǎn)生，其對(duì)SERS活性的改善具有非常重要的作用?；赟ERS活性電極的蛋白質(zhì)研究，主要圍繞著細(xì)胞色素類(lèi)蛋白質(zhì)研究，通過(guò)外加電源，根據(jù)對(duì)SERS信號(hào)的分析，來(lái)對(duì)電荷在蛋白質(zhì)內(nèi)部轉(zhuǎn)移過(guò)程進(jìn)行研究。

圖2 細(xì)胞細(xì)素c吸附于電化學(xué)粗糙的金或銀電極表面示意圖

3.2 膠體納米粒子

目前，對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)最常用的SERS活性基底是金屬膠體粒子(例如，金，銀，及金屬?gòu)?fù)合物納米粒子)[19-21]。這些膠體粒子的制備方法簡(jiǎn)單，而表現(xiàn)出非常優(yōu)異的應(yīng)用價(jià)值。然而，隨著銀溶膠的使用而出現(xiàn)一些問(wèn)題，是當(dāng)分析物加入后，金屬膠體粒子聚集嚴(yán)重，這使得膠體不穩(wěn)定，經(jīng)常導(dǎo)致SERS光譜的非重現(xiàn)性。因此，一些穩(wěn)定劑例如聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，檸檬酸鹽和十二烷基硫酸鈉等分子被廣泛的用來(lái)減少這種凝結(jié)問(wèn)題，然而，這些穩(wěn)定劑的使用可能會(huì)產(chǎn)生拉曼信號(hào)干擾[22-24]。在SERS活性基底的分析實(shí)驗(yàn)中，近段時(shí)間的研究中，已經(jīng)結(jié)合了膠體懸浮液的優(yōu)點(diǎn)和固體基底的穩(wěn)定性的共同優(yōu)勢(shì)來(lái)對(duì)生物體系進(jìn)行研究。

我們?cè)?jīng)開(kāi)發(fā)的方法之一就是(圖3)結(jié)合蛋白質(zhì)印記和銀溶膠染色技術(shù)，從而實(shí)現(xiàn)了基于SERS技術(shù)的非標(biāo)記蛋白質(zhì)的檢測(cè)(例如牛血清白蛋白，血紅素蛋白質(zhì)，溶菌酶，和人血清白蛋白(HSA))[25]。用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移載體的硝酸纖維素膜是一個(gè)擁有諸多優(yōu)點(diǎn)的很好的固定化膜，如蛋白結(jié)合的能力較強(qiáng)，高靈敏度，和易用性。在此，我們用銀膠體染色和蛋白質(zhì)印記技術(shù)結(jié)合的手段開(kāi)發(fā)了一個(gè)新型簡(jiǎn)便的方法(無(wú)任何其它干擾試劑)拓展了蛋白質(zhì)印記技術(shù)的檢測(cè)方法。由于蛋白質(zhì)和銀納米粒子之間的相互作用，蛋白質(zhì)條帶會(huì)被銀溶膠染色，呈現(xiàn)出較清晰的條帶。進(jìn)而，利用SERS技術(shù)對(duì)條帶進(jìn)行分析，可以得到不同蛋白質(zhì)的指紋信息，幫助我們分析蛋白質(zhì)的吸附行為。因此，非標(biāo)記的多目的蛋白質(zhì)可以在沒(méi)經(jīng)處理的條件下，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜表面而被檢測(cè)到。蛋白質(zhì)印記SERS研究方法是結(jié)合了銀溶膠染色技術(shù)，提高了待測(cè)物的檢測(cè)靈敏度。利用該方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)血紅素蛋白質(zhì)的達(dá)到納克水平的檢測(cè)靈敏度。

圖3 基于蛋白質(zhì)印跡SERS對(duì)蛋白質(zhì)檢測(cè)示意圖 血紅素蛋白質(zhì)和牛血清白蛋白SERS光譜

在另一項(xiàng)研究中(圖4)，銀膠體納米粒子[26]經(jīng)酸化的硫酸鈉作為聚集劑被用來(lái)誘導(dǎo)高的電磁場(chǎng)增強(qiáng)效應(yīng)。這里，幾種非標(biāo)記蛋白質(zhì)(如溶菌酶，核糖核酸酶B，抗生物素，過(guò)氧化氫酶，以及血紅素蛋白質(zhì))在水溶液中被檢測(cè)。展現(xiàn)出這種方法的諸多優(yōu)點(diǎn)。

圖4 硫酸鹽誘導(dǎo)的金屬納米粒子聚集 用于非標(biāo)記蛋白質(zhì)檢測(cè)示意圖

Fig.4 Schematic of acidified sulfate as an aggregation agent for label-free protein detection in aqueous solution

此外，Ozaki教授團(tuán)隊(duì)的研究報(bào)道的，電解質(zhì)和非標(biāo)記蛋白質(zhì)共同吸附在銀膠體上用來(lái)分析蛋白質(zhì)的吸附機(jī)制。由于蛋白質(zhì)和電解質(zhì)兩種物質(zhì)的特征峰都可以在SERS光譜上被觀察到，表明蛋白質(zhì)和NO-3共吸附在納米銀上。這些研究結(jié)果將有助于理解蛋白質(zhì)在Ag膠體上的吸附機(jī)理，并對(duì)設(shè)計(jì)制備蛋白檢測(cè)的SERS活性基底樣品非常有用[27]。Weidinger和Hildebrandt研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了關(guān)于血紅素蛋白質(zhì)裝飾在磁性與金屬納米粒子復(fù)合結(jié)構(gòu)表面，用于捕獲毒性物質(zhì)(如NO2-, CN-和H2O2等)。當(dāng)這些具有一定毒性物質(zhì)吸附于血紅素蛋白質(zhì)表面時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)血紅素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并且可以利用SERS技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化過(guò)程。因此，通過(guò)這一特點(diǎn)，可以對(duì)血紅素蛋白質(zhì)和毒性物質(zhì)的共檢測(cè)[28]。

3.3 有序陣列結(jié)構(gòu)

微納米尺度有序陣列是一種模型結(jié)構(gòu)，有助于我們理解SERS增強(qiáng)機(jī)制。這些陣列是通過(guò)電子束印刷技術(shù)，納米壓印光刻技術(shù)或納米球光刻等技術(shù)制備而形成的，這使得高度重復(fù)性圖案的制作能夠具有各種幾何形狀和尺寸的結(jié)構(gòu)[29-32]。SERS活性基底的周期模式被用來(lái)研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，Das等已經(jīng)發(fā)表了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析(如：溶菌酶、核糖核酸酶B、牛血清白蛋白和血紅素蛋白質(zhì))，他們利用電鍍和電子束刻蝕技術(shù)制備幾種金納米聚集體結(jié)構(gòu)的直徑在80和100納米之間、間隙在10～30 nm區(qū)間(圖5)，提高基底的SERS活性以及SERS光譜重現(xiàn)性。

有研究者構(gòu)筑一種檢測(cè)模型，將蛋白質(zhì)夾在Au/Ag三明治結(jié)構(gòu)中, 作為基于SERS技術(shù)的檢測(cè)對(duì)象。細(xì)胞色素c作為媒介用來(lái)構(gòu)造Au/Ag三明治結(jié)構(gòu)，由于金和銀層形成共振腔，提供了較強(qiáng)的電磁場(chǎng)貢獻(xiàn)而提高的基底的SERS活性。獲得的光譜具有較高的靈敏度和分辨率, 這表明這種SERS活性基底在蛋白質(zhì)檢測(cè)中是一種強(qiáng)大的工具, 并在蛋白質(zhì)芯片應(yīng)用方面潛力巨大[33]。

圖5 周期性有序金或銀納米陣列示意圖(a)； 血紅素蛋白質(zhì)SERS光譜(b)

Fig.5 (a) Schematic of periodic pattern Au/Ag substrate；(b) SERS spectrum of Mb

三維二氧化硅-銀核殼SERS活性基底是通過(guò)利用自組裝和種子催化結(jié)合的方法制備而成。該方法使我們能夠精確地控制和重塑成片的銀覆蓋在硅納米材料表面，可以制備出大片的連續(xù)的結(jié)構(gòu)并提供較大的電磁場(chǎng)貢獻(xiàn)。二氧化硅表面上聚集的銀納米粒子是通過(guò)無(wú)電沉積90 s得到的。這一方法制備出來(lái)的SERS活性基底允許非標(biāo)記蛋白質(zhì)直接吸附，得到的SERS光譜具有重現(xiàn)性好，靈敏度高的特點(diǎn)(圖6)。

3.4 基于針尖拉曼光譜技術(shù)

針尖拉曼技術(shù)(TERS)被認(rèn)為是最有前景研究化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制的一項(xiàng)技術(shù)。作為一個(gè)有潛途的技術(shù)，TERS 被用來(lái)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，尤其是細(xì)胞色素類(lèi)蛋白質(zhì)。TERS和SERS會(huì)得到不同的分子結(jié)構(gòu)信息，這種差異更有助于研究分析物的結(jié)構(gòu)。目前對(duì)于細(xì)胞色素類(lèi)蛋白質(zhì)可能有三種檢測(cè)結(jié)果(圖7)[34]。

圖6 細(xì)胞色素c和溶菌酶的SERS光譜 插入圖為細(xì)胞色素c和溶菌酶吸附于SERS活性基底示意圖

The inset is the schematic illustrations of cyt c and lysozyme adsorbed on the SSCS substrate

第一，當(dāng)制備AFM針尖距離樣品表面有一定距離時(shí)，第二，當(dāng)針尖貼近細(xì)胞色素類(lèi)蛋白質(zhì)的卟啉，這里面主要得到是卟啉的結(jié)構(gòu)信息，而很難觀測(cè)到氨基酸骨架信息，峰值強(qiáng)度相對(duì)于遠(yuǎn)場(chǎng)方法增強(qiáng)兩倍。第三，當(dāng)針尖貼近蛋白質(zhì)氨基酸部分，得到的SERS信息主要來(lái)自于氨基酸骨架的信息，對(duì)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加有利。目前，基于TERS技術(shù)的對(duì)其它類(lèi)蛋白質(zhì)，如血紅素蛋白質(zhì)和胰島素都有報(bào)道[35-39]。

圖7 金或銀AFM探針檢測(cè)細(xì)胞色素c的三種可能位置

4 展 望

概述了SERS基底技術(shù)及其在生物學(xué)應(yīng)用趨勢(shì)和發(fā)展，總結(jié)了近段時(shí)間不同類(lèi)型SERS活性基底用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中。SERS基底直接定量分析蛋白質(zhì):主要研究重點(diǎn)是蛋白質(zhì)的SERS指紋信息變化，這可能會(huì)進(jìn)一步被用于分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。SE(R)RS基底技術(shù)的進(jìn)一步研究將會(huì)從疾病相關(guān)蛋白質(zhì)研究目標(biāo)出發(fā)。利用不同的SERS活性材料選擇性的研究蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)間的相互作用。最重要的優(yōu)勢(shì)是, 它將提供快速和高靈敏度信息，為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的研究提供幫助，對(duì)于相關(guān)疾病的早期診斷具有一定的參考價(jià)值。

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(Received Jun. 28, 2015; accepted Nov. 15, 2015)

*Corresponding author

Study of Proteins Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS)

CHEN Lei1,2, KONG Wei-he1, HAN Xiao-xia2, ZHAO Bing2*

1. Key Laboratory of Preparation and Applications of Environmental Friendly Materials, Ministry of Education, Jilin Normal University, Siping 136000, China

2. State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, Jilin University, Changchun 130012, China

This article outlines the recent progress in surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) based proteins applications. SERS is a specific Raman spectroscopic technique that provides enhanced Raman signals (several orders of magnitude greater than normal) for numerous Raman-active analyte molecules adsorbed onto rough metal surfaces. SERS is a sensitive, selective, and versatile technique that lends to fast data acquisition in actual time. Therefore, SERS has undergone rapid development because of its technical advantages in instrumentation, data analysis methods and its multiple biological applications. This article highlights several representative areas in proteins where SERS could be employed. Some of the proteins applications of SERS are more maturely developed, whereas others are in their initial stages of development (in laboratories). This article discusses the recent developments in SERS based quantitative analysis: directly with different substrates (e.g. biomolecules on electrodes, colloidal particles, and periodic pattern structure and tip based substrates). Furthermore, SERS based techniques are advantageous for obtaining valuable information on protein-protein, protein-ligand, and protein-drug recognitions via spectral differences among molecular bridges. SERS based techniques show considerable promise for qualitative and/or quantitative analyses of biological systems.

SERS；Proteins; Label-free method; Quantitative analysis; Qualitative analysis

2015-06-28，

2015-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21403082，21273091)，吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150520015JH)，吉林省教育廳項(xiàng)目(2016-217)和吉林師范大學(xué)博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(2014004)資助

陳 雷，1982年生，吉林師范大學(xué)環(huán)境友好材料制備與應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室講師 e-mail: chenlei@jlnu.edu.cn *通訊聯(lián)系人 e-mail: zhaob@jlu.edu.cn

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)10-3087-05