汪秀會，宮曉倩，阮寶陽，2，劉曉敏，汪　琪，張　鵬，2，李澤君，周艷君，童　武，鄭　浩，童光志*，于　海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271000)

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古典H1N1亞型豬流感病毒PB2 K627E突變對病毒復制能力的影響

汪秀會1，宮曉倩1，阮寶陽1，2，劉曉敏1，汪琪1，張鵬1，2，李澤君1，周艷君1，童武1，鄭浩1，童光志1*，于海1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271000)

摘要：旨在探索古典H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1) PB2 K627E突變對病毒復制能力的影響。利用反向遺傳操作技術(shù)和點突變技術(shù)成功獲得古典H1N1亞型豬流感病毒的拯救株(627K)和突變株(627E)后，分別在MDCK細胞和小鼠體內(nèi)對拯救株和突變株的復制能力進行比較。體外MDCK細胞試驗結(jié)果顯示，突變株與拯救株相比，細胞病變(CPE)減小、空斑形態(tài)減小、生長曲線差異極其顯著，表明突變株在MDCK細胞上的復制能力減弱。小鼠攻毒試驗結(jié)果表明，突變株對小鼠體重變化的影響不明顯，在小鼠肺中的病毒滴度明顯下降，引起病理損傷較輕。體外MDCK細胞及小鼠攻毒試驗結(jié)果均表明，突變株與拯救株相比復制能力降低。該結(jié)果不僅證實了豬流感病毒 PB2 627位氨基酸是一種重要的毒力分子標記，同時還為進一步闡明其致病機制提供了條件。

關(guān)鍵詞：古典H1N1亞型豬流感病毒；PB2 K627E突變；體外MDCK細胞試驗；小鼠攻毒試驗；復制能力

豬流感(swine influenza，SI)是由豬流感病毒(swine influenza virus，SIV)引起的以咳嗽、流涕、噴嚏、高燒、昏睡、呼吸困難和食欲下降等[1]為主要特征的豬的一種常見病。該病一年四季均可發(fā)生，并可繼發(fā)或同時感染豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬偽狂犬、流行性腹瀉等[2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。由于在豬的呼吸道上皮細胞同時具有禽流感病毒受體SAα-2，3-Gal和人流感病毒受體SAα-2，6-Gal，豬可以同時被禽流感病毒、豬流感病毒和人流感病毒感染。因此，豬被認為是禽流感病毒和人流感病毒的中間宿主和發(fā)生基因重組的“混合器”[3]。豬對流感病毒的生態(tài)分布和遺傳演變起著舉足輕重的作用，成為流感病毒在“禽-豬-人”種間傳播鏈中的重要環(huán)節(jié)。目前，在世界范圍內(nèi)已從豬體內(nèi)分離出的流感病毒約有14種不同的亞型，其中主要為H1N1、H3N2和 H1N2三種[4-6]。

導致流感病毒致病性的因素很多，病毒蛋白在其中扮演著不可忽視的角色，其中的PB2 627位氨基酸被公認為流感病毒的一種重要的毒力分子標記[7-8]，且具有宿主特異性[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的流感病毒PB2第627位所編碼的氨基酸不同。分離得到的禽流感病毒的PB2 627位氨基酸通常為谷氨酸(E)，人源或豬源流感病毒該位點大多數(shù)為賴氨酸(K)，當該位點編碼的氨基酸由E突變?yōu)镵后，病毒的聚合酶活性會明顯升高，病毒在細胞內(nèi)的復制能力也明顯增強。當將K突變?yōu)镋后，病毒的復制能力及致病性明顯減弱，在體內(nèi)及體外試驗中的毒力明顯降低[10]。本研究中所選用的毒株為古典H1N1亞型SIV，其PB2 627位編碼的氨基酸為K，為了探索該位點的氨基酸由K突變?yōu)镋后，其致病性及在體內(nèi)外復制能力會發(fā)生怎樣的變化，作者進行了一系列試驗。

1材料與方法

1.1毒株、菌種及細胞

古典H1N1亞型SIV A/Swine/Guangdong/1/2011(H1N1)(簡稱G11)的八質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)由作者實驗室構(gòu)建并保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京天根生物有限公司。293T 細胞，MDCK細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

4%多聚甲醛，低熔點瓊脂糖，TPCK，5%結(jié)晶紫，0.5%雞紅細胞，PBS，DMEM培養(yǎng)基、FBS、BSA、2×MEM均購自GIBCO 公司(美國)?？股赜勺髡邔嶒炇冶４?。

1.3主要儀器

電子天平，組織破碎儀，Nikon TS100 倒置顯微鏡(Nikon公司)，生物安全柜(Forma-scientific 公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma-scientific 公司)，eppendorf 8道和12道排槍，乙醚，50 mL離心管，低溫水平離心機。

1.4拯救株病毒和突變株病毒的獲得

將G11反向遺傳系統(tǒng)的八個陽性質(zhì)粒分別按照1 μg量共轉(zhuǎn)染293T細胞，6 h后換液，48 h后吸取上清接種MDCK細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集病毒，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，進行序列測定，相應(yīng)病毒命名為拯救株。在突變株病毒的拯救過程中，首先要設(shè)計一對反向互補的內(nèi)部引物，這對引物的作用是使PB2基因的1 879—1 881位由AAG突變?yōu)镚AG；通過融合 RT-PCR方法獲得627位氨基酸由K突變?yōu)镋的突變PB2基因，進而構(gòu)建它的陽性質(zhì)粒；將G11原始毒株的PB1、PA、HA、NA、NP、M、NS陽性質(zhì)粒和突變PB2基因的陽性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒的拯救，最后也進行序列測定，相應(yīng)病毒命名為突變株。

1.5細胞病變的觀察

將拯救株和突變株病毒以同種劑量分別接種到單層鋪滿的MDCK細胞的6孔細胞培養(yǎng)板中，在不同時間點(6、12、24、36、48、60、72 h)觀察CPE情況。

1.6空斑試驗

拯救株和突變株病毒分別用含TPCK的感染液依次稀釋至10-6，然后分別接種于單層鋪滿MDCK細胞的6孔細胞培養(yǎng)板中，充分吸附1 h后，棄去病毒液，每孔加入4 mL配制好的膠(含LMP、MEM、BSA和TPCK等)，待膠凝固后，倒置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一段時間觀察空斑的有無及大小形態(tài)變化。待空斑形成大小適中(48～72 h)時，5%龍膽紫染色。

1.7生長曲線的繪制

拯救株與突變株分別以0.001MOI接種于單層鋪滿且狀態(tài)良好的MDCK細胞中，分別在不同的時間點(6、12、24、36、48、60、72 h)收集細胞上清，每個時間點設(shè)3個重復。將每個時間點收集到的每個重復視作一個單獨的樣品，將每個樣品由10-1依次稀釋至10-12后接種于MDCK細胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱，72 h后在顯微鏡下觀察細胞的生長情況，并結(jié)合血凝方法進行檢測。

1.8小鼠體重變化及存活率

將拯救株與突變株分別以1.0×105TCID50的攻毒劑量滴鼻接種小鼠，每天同一時間點進行連續(xù)稱重兩周，觀察并記錄小鼠體重變化及存活情況，繪制小鼠的體重變化曲線和存活率曲線。

1.9小鼠肺組織病理學觀察

分別取攻毒后第3天和第5天的試驗組及對照組的小鼠左肺組織，置于注滿4%多聚甲醛的5 mL離心管中，做好標記后送公司制備組織病理切片，進行組織病理學觀察。

1.10小鼠肺病毒滴度的檢測

分別取攻毒后第3天和第5天的試驗組和對照組小鼠右肺組織，充分研磨后離心取上清，在無菌環(huán)境下倍比稀釋至10-12，接種MDCK細胞，進行病毒滴度的測定。對照組小鼠接種的是同種劑量的DMEM，具體操作流程與試驗組小鼠一致。

2結(jié)果

2.1古典H1N1亞型SIV G11拯救株及突變株序列分析

利用反向遺傳技術(shù)及點突變技術(shù)，成功獲得了古典H1N1亞型SIV G11拯救株及突變株病毒，提取病毒RNA，進行RT-PCR擴增及序列測定，序列分析結(jié)果表明，拯救株的PB2 627位氨基酸為K，而突變株的PB2 627位氨基酸為E，進而證明成功獲得了古典H1N1亞型豬流感病毒的突變株。

2.2不同時間點MDCK細胞形態(tài)

不同時間點MDCK細胞形態(tài)的觀察結(jié)果(圖1)表明：拯救株與突變株在12 h時均沒有肉眼可見的CPE；24 h時拯救株出現(xiàn)CPE，突變株的病變?nèi)匀徊幻黠@；36 h時，突變株細胞出現(xiàn)肉眼可見的病變，拯救株CPE較明顯；48 h時，拯救株細胞約有50%發(fā)生病變，突變株CPE程度輕于拯救株；60 h時，拯救株與突變株的病變程度均很明顯，但突變株較拯救株相比程度較輕；72 h時，突變株與拯救株細胞完全脫落。

2.3空斑形態(tài)

在相同條件下突變株與拯救株分別接種于MDCK細胞，觀察兩毒株在MDCK細胞上產(chǎn)生空斑形態(tài)的大小?？瞻咝螒B(tài)觀察結(jié)果(圖2)表明，PB2 K627E突變導致古典H1N1亞型SIV在MDCK細胞上的空斑形態(tài)變小，含PB2 627E位點的突變株的空斑明顯小于含PB2 627K位點的拯救株，說明突變株在MDCK細胞上的復制能力弱于拯救株。

2.4拯救株與突變株生長曲線

古典H1N1亞型豬流感病毒拯救株和突變株分別以相同劑量接種MDCK細胞，測定病毒滴度(TCID50)，利用GraphPad Primer 5.0軟件對各時間點的病毒滴度進行差異性分析，結(jié)果(圖3)表明：12 h時突變株與拯救株的病毒滴度差異不顯著(P>0.05)，24、36、48 h時突變株與拯救株的病毒滴度差異極其顯著(P<0.001)，60、72 h差異非常顯著(P<0.01)，表明突變株在細胞上的復制能力較弱。

2.5小鼠肺病理切片的觀察

分別取攻毒后第3天和第5天左肺組織，制作病理切片，HE染色，由圖4可知，拯救株(A、B)具有明顯的炎性細胞灶性浸潤(圖中a黑色箭頭)，在同一視野下可見多個浸潤灶，部分肺泡壁增粗(圖中b紅色箭頭)；突變株(C、D)局部炎性細胞灶性浸潤，炎性細胞較少，肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)正常，支氣管結(jié)構(gòu)正常。病理切片結(jié)果表明，攻毒后第3天和第5天，突變株與拯救株相比，突變株對小鼠肺組織損傷較輕。

2.6小鼠體重變化及存活率

由圖5和圖6可以看出：突變株(627E)組與對照組小鼠體重變化差異不顯著(P>0.05)，說明突變株在小鼠體內(nèi)的復制能力較弱，導致小鼠體重變化不明顯；病毒感染小鼠后第3天至第13天(dpi 3—dpi 13)，與突變株組和對照組小鼠體重變化情況相比，拯救株接種小鼠體重有明顯的下降，差異極其顯著(P<0.001)，表明拯救株在小鼠體內(nèi)的復制能力較強；而拯救株在使小鼠體重明顯下降的同時對小鼠具有致死性，導致小鼠部分死亡。

A.拯救株(rG11)在MDCK細胞不同時間點(12、24、36、48、60、72 h)的CPE；B.突變株(rG11-K627E)在MDCK細胞不同時間點(12、24、36、48、60、72 h)的CPEA.CPE of rescued strain in MDCK at different time；B.CPE of and mutant strain in MDCK at different time圖1　H1N1亞型豬流感病毒G11拯救株與突變株6個時間點MDCK CPE(400×)Fig.1　CPE of rescued and mutant strain of G11 at different time(400×)

A.拯救株空斑形態(tài)；B.突變株空斑形態(tài)A.Plaque morphology of rescued strain；B.Plaque morphology of mutant strain圖2　G11拯救株與突變株空斑形態(tài)的觀察和比較Fig.2　The observation and comparison of plaque morphology of rescued and mutant strain

圖3　G11拯救株與突變株生長曲線的比較Fig.3　The growth curve of the rescued and mutant strain

A.rG11-3 d病理切片；B.rG11-5 d病理切片；C.G11-K627E-3 d病理切片；D.G11-K627E-5 d病理切片；E.對照組；a.炎性細胞灶性浸潤； b.肺泡壁增粗A.rG11-3 d lung pathological；B.rG11-5 d lung pathological；C.G11-K627E-3 d lung pathological；D.G11-K627E-5 d lung pathological；E.Control；a.Focal infiltration of inflammatory cell；b.Thickening of alveolar walls圖4　第3、5天小鼠左肺組織拯救株及突變株病理切片的觀察(200×)Fig.4　The result of the rescued and mutant strains’ left lung pathological(200×)

2.7病毒滴度

利用GraphPad Primer 5.0軟件，對攻毒后小鼠肺組織的病毒滴度(TCID50)進行差異性分析，結(jié)果(圖7)表明：攻毒后第3、5天小鼠右肺組織拯救株和突變株病毒滴度差異極顯著(P<0.001)，說明突變株與拯救株相比在小鼠肺的復制能力差異顯著，且突變株的復制能力明顯低于拯救株，而對照組小鼠未檢測到病毒。

圖5　G11拯救株與突變株小鼠體重變化情況Fig.5　Body weight changes of mice of the rescued and mutant strain

圖6　拯救株及突變株病毒感染小鼠存活率Fig.6　Survival rate of the mice infected by rescued and mutant strain

圖7　第3、5天小鼠右肺組織拯救株及突變株病毒的滴度檢測結(jié)果Fig.7　The result of the rescued and mutant strains’ titer of mice’ right lung

3討論

本研究所選用的古典H1N1亞型SIV拯救株的PB2 627位編碼的氨基酸為K，利用點突變技術(shù)將該位點的氨基酸突變?yōu)镋后，分別在MDCK細胞和小鼠體內(nèi)對突變前后病毒的復制能力進行了比較。MDCK細胞試驗中，分別在CPE、空斑形態(tài)、病毒滴度、生長曲線等幾方面進行其生物學特性的比較，結(jié)果表明突變株與拯救株間在體外的生物學特性差異明顯。與拯救株相比，突變株的CPE較??；在完全相同條件下，突變株所產(chǎn)生的空斑的形態(tài)較??；且突變株與拯救株相比，其病毒滴度較低，生長曲線差異極其顯著。同時，本研究還以BALB/c雌性小鼠為哺乳動物模型，為探索拯救株與突變株在體內(nèi)條件下的差異提供了條件。在小鼠攻毒試驗中，分別在小鼠體重變化、小鼠肺病毒滴度、小鼠肺病理切片等方面對拯救株與突變株生物學特性間的差異進行了比較。試驗結(jié)果表明，拯救株能夠?qū)е滦∈篌w重明顯下降甚至死亡，而突變株使小鼠體重下降不明顯，攻毒至第13天，小鼠的適應(yīng)性增強，體重恢復并不斷增加；小鼠肺病毒滴度差異極其顯著；肺病理切片的結(jié)果表明兩毒株對小鼠致病性差異不顯著，但突變株與拯救株相比致病性較弱。從而表明PB2 627K是影響古典H1N1亞型SIV復制能力的重要因素之一 。

研究發(fā)現(xiàn)，人流感病毒PB2 627位氨基酸為K而禽源流感病毒該位點為E[11]。分離于北美的SIV，于1998年之前分離得到的大多數(shù)PB2 627位氨基酸為K，而1998年之后分離的絕大多數(shù)為E[12]。禽源流感病毒PB2 627位氨基酸為E，但病毒仍具有較強的感染性，究其原因是該位點與其他位點的相互作用[13]有關(guān)。SIV PB2 627位氨基酸由K突變?yōu)镋后，病毒的復制能力及致病性明顯降低，在體內(nèi)及體外試驗中的毒力明顯減弱，究其原因，這可能是由于PB2 627位氨基酸影響著病毒RNA復制的溫度敏感性決定的[14]。不同來源的流感病毒復制時所需的最適宜的溫度不同，人/豬流感病毒在上呼吸道復制，最適宜溫度約33 ℃，而禽流感病毒在禽類腸道中復制的最適宜的溫度為41 ℃左右。也就是說，當PB2 627為E 時，該病毒在哺乳動物的上呼吸道是不能進行復制或者說復制效率很低[15]。有研究報道，PB2 627E之所以對低溫敏感，可能是因為低溫條件下PB2和NP蛋白之間的相互作用受到了破壞[16]，也可能是與細胞內(nèi)某些限制因子[17]或者某些宿主因子有關(guān)[18]，具體機制還需要進一步探索。

目前國內(nèi)外對SIV分子致病機制的研究比較少，主要研究仍然集中于人流感病毒和禽流感病毒。本研究通過對古典H1N1亞型SIV拯救株和突變株在體外和體內(nèi)條件下生物學特性的比較，解析了古典H1N1亞型SIV在體外及體內(nèi)的致病機制，彌補了該方面的不足，同時也為古典H1N1亞型SIV PB2 627位氨基酸的分子致病機制提供了一定的參考依據(jù)。

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(編輯白永平)

The Effect of PB2 K627E Mutation on the Replication Competence of Classical H1N1 Subtype Swine Influenza Virus

WANG Xiu-hui1，GONG Xiao-qian1，RUAN Bao-yang1，2，LIU Xiao-min1，WANG Qi1，ZHANG Peng1，2，LI Ze-jun1，ZHOU Yan-jun1，TONG Wu1，ZHENG Hao1，TONG Guang-zhi1*，YU Hai1*

(1.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai200241，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271000，China)

Abstract:This experiment was conducted to explore the effect of PB2 K627E mutation on the replication competence of classical H1N1 subtype swine influenza virus(A/Swine/Guangdong/1/2011).The rescued and mutant strains of classical H1N1 subtype swine influenza virus were obtained by reverse genetics and point mutation technology，and researches were taken on MDCK cells and mice.The results on MDCK cells showed that，compared with the rescued strain，the mutant virus had a slight degree of CPE；the morphology of plaque of mutant virus was much smaller；the growth curve showed that it had a significant distinct difference.The results of experiments in mice showed that the mutant strain had a low pathogenicity and could not lead the mice loss weight，and virus titer in lung tissues on the 3rd and 5th day post challenge showed that there was a significant distinct difference between the two strains and the pathological damage caused by mutant one was not serious.The results on MDCK and mice both showed that the mutant strain’s replication competence was lower than the rescued one.This conclusion demonstrates that the amino acid of PB2 627 is not only one of the important virulence markers，but also provided the condition to further clarify its pathogenic mechanism.

Key words:classical H1N1 subtype swine influenza；PB2 K627E mutation；vitroexperiment in MDCK cells；vivoexperiment in mice；virus replication

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.03.017

收稿日期：2015-08-04

基金項目：國家青年自然科學基金(31201916)；上海市自然科學基金青年項目(12ZR1453500)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費項目(2015JB07)；中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程科研團隊“動物流感病毒病原生態(tài)學”項目

作者簡介：汪秀會(1988- )，女，山東聊城人，碩士生，主要從事豬流感病毒分子致病機制的研究，E-mail：wangxiuhui123@163.com *通信作者：童光志，研究員，E-mail：gztong@shvri.ac.cn；于海，副研究員，E-mail：haiyu@shvri.ac.cn

中圖分類號：S852.659.5

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)03-0543-06