文/馬雨璇吳可非桑 躍葛紹陽(yáng)張清海劉治麟趙 亮*（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心；2北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室；科迪食品集團(tuán)股份有限公司；北京和益源生物技術(shù)有限公司）

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水牛奶中優(yōu)良乳酸菌的篩選及復(fù)合菌株發(fā)酵研究

文/馬雨璇1，2吳可非1，2桑 躍1葛紹陽(yáng)1張清海3劉治麟4趙 亮1*
（1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市高等學(xué)校畜產(chǎn)品工程研究中心；2北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室；3科迪食品集團(tuán)股份有限公司；4北京和益源生物技術(shù)有限公司）

摘 要：采用傳統(tǒng)分離方法從水牛奶中分離得到50 株乳酸菌，其中22 株為乳球菌，28 株為乳桿菌。對(duì)所有菌株進(jìn)行產(chǎn)酸性能評(píng)價(jià)，篩選了4 株性能較好的菌株：乳桿菌KDL22、KDL29，乳球菌KDS25、KDS27。將乳球菌和乳桿菌以1∶1比例進(jìn)行組合，并對(duì)復(fù)合菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，復(fù)合菌株在發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酸速度高于單菌，能在4 h內(nèi)凝乳，且后酸化較弱，符合工業(yè)化發(fā)酵劑的要求。通過(guò)對(duì)4 種復(fù)合菌株發(fā)酵劑的后酸化能力、產(chǎn)雙乙酰能力、蛋白質(zhì)水解能力以及發(fā)酵乳的感官效果進(jìn)行比較，最后得出KDL22+KDS25復(fù)合菌株發(fā)酵牛乳的效果最佳，可作為發(fā)酵劑用于酸乳的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：水牛奶；乳酸菌；復(fù)合菌株

乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品加工［1，2］。乳酸菌的分離與篩選是其應(yīng)用的前提。我國(guó)是最早利用乳酸菌發(fā)酵食品的國(guó)家之一，有著豐富的傳統(tǒng)發(fā)酵食品資源［3，4］。

乳酸菌的篩選因素主要包括乳酸菌的酸化能力、后酸化能力、產(chǎn)香味物質(zhì)能力［5，6］。產(chǎn)酸能力是乳酸菌的重要性質(zhì)，酸度是影響酸乳加工周期、生產(chǎn)效率及風(fēng)味的一個(gè)重要質(zhì)量指標(biāo)，一般通過(guò)繪制酸乳在制作過(guò)程中酸度隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)來(lái)確定產(chǎn)酸能力的強(qiáng)弱［7］。酸乳的后酸化使酸乳產(chǎn)品在消費(fèi)過(guò)程中酸度升高，導(dǎo)致消費(fèi)者不可接受的過(guò)酸味及感官質(zhì)量下降，嚴(yán)重影響酸乳產(chǎn)品的性質(zhì)［8］。乳酸菌在乳中生長(zhǎng)繁殖，除產(chǎn)生大量乳酸使乳凝固外，還會(huì)產(chǎn)生許多風(fēng)味物質(zhì)，主要有乙醛、丁二酮、雙乙酰等，這些風(fēng)味物質(zhì)的含量和種類(lèi)決定著產(chǎn)品的適口性［9］。乙醛是酸乳的主要風(fēng)味物質(zhì)，其含量決定了成品的風(fēng)味，可以賦予酸乳理想的香味［9，10］，乙醛的濃度應(yīng)該在10～40 μg/mL。另外，雙乙酰會(huì)形成特征性的類(lèi)似“奶油”的堅(jiān)果仁香味［11］，也會(huì)大大改善酸乳的風(fēng)味。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

水牛奶，脫脂乳。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

氫氧化鈉、三氯乙酸、四硼酸鈉、絲氨酸、鄰苯二甲醛、99%二硫蘇糖醇（DTT）等，均為分析純；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基，均由實(shí)驗(yàn)室按參考文獻(xiàn)［12］進(jìn)行配制。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集

水牛奶樣品置于無(wú)菌試管中，低溫保存運(yùn)輸，24 h內(nèi)處理。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

采用MRS培養(yǎng)基分離乳桿菌，M17培養(yǎng)基分離乳球菌。通過(guò)10 倍梯度稀釋得到單克隆菌落，初步根據(jù)菌落形態(tài)，大小，顏色，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)位置（表面、內(nèi)部、底部）挑取不同表觀(guān)特征的菌落，并對(duì)得到的菌落進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 菌株穩(wěn)定性試驗(yàn)

將乳酸菌接種到液體培養(yǎng)基（乳桿菌使用MRS培養(yǎng)基，乳球菌使用M17培養(yǎng)基）中，37 ℃培養(yǎng)15 h后，以3%比例接種于滅菌脫脂乳中，43 ℃發(fā)酵，凝乳后記錄凝乳時(shí)間；并將凝乳以3%比例繼續(xù)接種于新鮮滅菌脫脂乳中，連續(xù)傳代記錄凝乳時(shí)間。

1.2.4 酸度和pH值的測(cè)定

采用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液對(duì)發(fā)酵乳的酸度進(jìn)行滴定，具體方法為：稱(chēng)取10 g左右樣品，置于150 mL錐形瓶中，用40 mL新煮沸冷卻到40 ℃的蒸餾水稀釋均勻，然后滴加3 滴10 g/L酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微紅，并在30 s內(nèi)紅色不消失，記錄所用NaOH溶液的體積，計(jì)算滴定酸度（°T）。滴定酸度（°T）= V（0.1 moL/L的NaOH溶液體積，mL）/M（發(fā)酵乳的質(zhì)量，g）×100。同時(shí)用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。

1.2.5 雙乙酰含量測(cè)定

取一定量的待測(cè)乳樣，加入等體積的16%三氯乙酸溶液，混勻，4 °C下4 500 r/min離心10 min，取上清液過(guò)濾。向試管中移取濾液5 mL，加入0.5 mL 1%鄰苯二胺溶液，于暗處反應(yīng)30 min，然后向試管中加入4 mol/L的鹽酸溶液1 mL，終止反應(yīng)，測(cè)定335 nm處的吸光度值［13，14］，根據(jù)雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品的吸光度值，計(jì)算樣品的雙乙酰含量。

1.2.6 游離氨基酸含量測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法（OPA）測(cè)定游離氨基酸的含量。取0.45 mL發(fā)酵乳樣于離心管中，加入0.75 mol/ L三氯乙酸溶液0.9 mL，室溫靜置反應(yīng)10 min，4 °C下4 500 r/min離心15 min，取上清液0.15 mL，加入3 mL OPA試劑，測(cè)定340 nm處的吸光值，以絲氨酸為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算最終的游離氨基酸含量［15］。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選結(jié)果與分析

以H2O2酶試驗(yàn)呈陰性、菌落乳白、革蘭氏染色鏡檢觀(guān)察G+球菌和桿菌，作為初步判定為乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)，共分離得到50 株乳酸茵，其中22 株為乳球菌，28 株為乳桿菌。

2.2 轉(zhuǎn)接試驗(yàn)及發(fā)酵性能優(yōu)良菌株的篩選

通過(guò)凝乳及穩(wěn)定性試驗(yàn)，篩選出4 株乳酸菌（表1），這4 株乳酸菌發(fā)酵后凝乳性能好，穩(wěn)定性良好，發(fā)酵乳組織狀態(tài)、風(fēng)味均較好。

表1　篩選出單菌株的凝乳情況

2.3 復(fù)合菌株發(fā)酵特性分析

將乳球菌與乳桿菌按照1∶1比例進(jìn)行組合，形成4 株復(fù)合菌株，分別為KDL22+KDS25、KDL22+KDS27、KDL29+KDS25、KDL29+KDS27，測(cè)定復(fù)合菌株的產(chǎn)酸性能、后酸化性能、產(chǎn)香性能及蛋白質(zhì)分解性能。

2.3.1 單菌株及復(fù)合菌株的產(chǎn)酸性能

將篩選出的發(fā)酵性能優(yōu)良的4株菌株活化3 代，以3%接種量接種于脫脂乳中。同時(shí)將復(fù)合菌株以3%接種量接種于脫脂乳中，43 ℃發(fā)酵，每小時(shí)測(cè)定滴定酸度及pH值。從圖1和2可以看出，KDL22單菌發(fā)酵酸度達(dá)到60 °T的時(shí)間在4 h以?xún)?nèi)，而其它3 株KDL29、KDS25及KDS27單菌所用時(shí)間均在6 h以上；除KDL29+KDS25外，其余復(fù)合菌株KDL29+KDS27、KDL22+KDS25及 KDL22+KDS27發(fā)酵酸度達(dá)到60 °T的時(shí)間均在4 h內(nèi)，說(shuō)明復(fù)合菌株初步滿(mǎn)足發(fā)酵劑快速產(chǎn)酸的要求。

2.3.2 后酸化性能

4 種復(fù)合菌株的后酸化能力如圖3所示，經(jīng)過(guò)4 ℃冷藏3 周后，除KDL29+KDS27外，其它復(fù)合菌株的發(fā)酵乳酸度變化均在30 °T以?xún)?nèi)，說(shuō)明后酸化較弱。4 ℃貯藏過(guò)程中酸度變化速度為：KDL22+KDS27 ＜KDL22+KDS25＜KDL29+KDS25 ＜KDL29+KDS27。

2.3.3 產(chǎn)香性能

圖4展示了復(fù)合菌株發(fā)酵劑在發(fā)酵乳發(fā)酵及冷藏過(guò)程中雙乙酰含量的變化趨勢(shì)，除KDL29+KDS27外，其它3 株復(fù)合菌株發(fā)酵乳的雙乙酰含量均在3 天內(nèi)達(dá)到峰值，其中KDL22+KDS27復(fù)合菌株發(fā)酵乳的雙乙酰含量最高。

2.3.4 蛋白質(zhì)分解能力

從圖5可以看出，發(fā)酵及冷藏過(guò)程中游離氨基酸的含量整體上呈上升趨勢(shì)，且游離氨基酸各組之間無(wú)顯著差異。

圖1　單菌產(chǎn)酸曲線(xiàn)

圖2　4種復(fù)合菌株產(chǎn)酸曲線(xiàn)

圖3　4 ℃冷藏過(guò)程中4 種復(fù)合菌株發(fā)酵乳的酸度變化曲線(xiàn)

圖4　4種復(fù)合菌株發(fā)酵乳的雙乙酰含量變化曲線(xiàn)

3 結(jié)論

本研究從水牛奶中分離獲得了50 株乳酸菌，并從單菌株產(chǎn)酸、凝乳性能方面篩選出4 株適合作為酸乳發(fā)酵劑的乳酸菌。將乳球菌和乳桿菌以1∶1比例進(jìn)行組合后，發(fā)現(xiàn)復(fù)合菌株的產(chǎn)酸能力、凝乳效果比單菌株好，且后酸化弱。試驗(yàn)還分別測(cè)定了4 種復(fù)合菌株發(fā)酵乳在4 ℃冷藏過(guò)程中的產(chǎn)香能力和蛋白質(zhì)水解能力，測(cè)得3 種復(fù)合菌株發(fā)酵乳的雙乙酰含量在3 天內(nèi)達(dá)到峰值；蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的游離氨基酸呈上升趨勢(shì)，且各組合之間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。KDL22+KDS25復(fù)合菌株發(fā)酵牛乳的效果最佳，可作為發(fā)酵劑用于酸乳的生產(chǎn)。

圖5　4 種復(fù)合菌株發(fā)酵乳的游離氨基酸含量變化曲線(xiàn)

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Screening for Potential Lactic Acid Bacteria for Excellent Yoghurt Starter

MA Yu-xuan1，2，WU Ke-fei1，2，SANG Yue1，GE Shao-yang1，ZHANG Qing-hai3，LIU Zhi-lin4，ZHAO Liang1*
（1 College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product；2 College of Food Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety；3 Kedi Group Company Limitid；4 Beijing Heyiyuan Biotechnology Company Limitid）

Abstract：Fifty strains of lactic acid bacteria were separated from buffalo milk，including twenty-two of Lactococcus and twenty-eight of Lactobacillus. KDL22，KDL29，KDS25 and KDS27 were selected based on the acidity and flavor test. The Lactococcus and Lactobacillus were mixed with the ratio of 1∶1 as a composite strain，and the fermentation performance of four composite strains were examined. The results showed that the composite strains had the better performance with higher acid production rate，and the clotting time could be as short as 4 h，as well as the post-acidification was not so strong. The composite strains could meet the standard of industrialization. The composite strain KDL22+KDS25 was the most excellent for yoghurt starter.

Key words：buffalo milk；lactic acid bacteria；composite strain

［基金項(xiàng)目：本研究受“奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”“益生菌生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)科技成果轉(zhuǎn)化”項(xiàng)目支持。］

作者簡(jiǎn)介：

馬雨璇（1994-），女，本科，研究方向?yàn)槿槠肺⑸铩?/p>

通訊作者：?趙亮（1983-），男，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院副教授，主要從事益生菌科學(xué)技術(shù)研究。

收稿日期：（2016-04-10）