趙　妮,鄧　毅, 劉　靚,董金香,曼　瓊,楊志軍

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

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甘草內(nèi)生菌20株有效菌株發(fā)酵物與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性對(duì)比研究*

趙妮1,鄧毅2, 劉靚1,董金香1,曼瓊1,楊志軍1

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000)

摘要目的：研究甘肅野生和栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性的差異。方法：采用體外定量抑菌方法觀察20株甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑菌活性。結(jié)果：各組對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，各有效菌株組均弱于宿主組；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，最小抑菌濃度分別為0.125 0 ，0.062 5 g/mL；宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。各組對(duì)肺炎鏈球菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總皂苷對(duì)比，JTZB005抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃度0.062 5 g/mL；有效菌株中JTZB005抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。各組對(duì)大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總黃酮對(duì)比，JTZB018抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃度0.125 0 g/mL；有效菌株中JTZB018抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。結(jié)論：20株甘草內(nèi)生菌發(fā)酵物對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌均有不同程度抑菌活性，JTZB005對(duì)肺炎鏈球菌的抑菌活性強(qiáng)于栽培甘草水煎液、總皂苷，JTZB018對(duì)大腸桿菌的抑菌活性強(qiáng)于栽培甘草水煎液、總黃酮。

關(guān)鍵詞甘草；內(nèi)生菌；水煎液；總黃酮；總皂苷；抑菌活性；對(duì)比

甘草具有補(bǔ)中益氣、清熱解毒、止咳化痰、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效。研究表明：甘草、甘草黃酮和甘草皂苷均有抑菌作用[1-2]。植物內(nèi)生菌在與宿主共生過程中發(fā)生基因重組獲得宿主植物基因，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性，并具有多種生理活性。本實(shí)驗(yàn)將甘肅野生與栽培烏拉爾甘草分離純化，經(jīng)菌餅法篩選20株有效菌株，比較觀察20株有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抑菌活性差異。

1材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器

野生、栽培烏拉爾甘草GlycyrrhizauralensisFisch.于2014年9月購于甘肅省酒泉市金塔縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生藥實(shí)驗(yàn)中心林麗高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為正品。將新鮮的野生與栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鮮膜分開包裝，4 ℃保存。無水乙醇(批號(hào)20140718)、氨水(批號(hào)20141011)、乙酸乙酯(批號(hào)20141124)購自天津市百世化工有限公司；生理鹽水，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)1503217B。9082-B型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LDZX-30FB立體壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW-1F-CJ無菌操作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；BS-110S 型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；CT14RD臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式低速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2菌種

金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)、肺炎鏈球菌(ATCC 6303)、大腸桿菌(CMCC 44102)，均購自蘭州百源基因有限公司。

1.3培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂(NA，批號(hào)20130106)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA，批號(hào)20140812)、營養(yǎng)肉湯(批號(hào)20140923)、馬鈴薯葡萄糖水(批號(hào)20140821)，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.4甘草水煎液的制備

野生及栽培甘草破碎至1～3 mm長度，各取50 g 加5 00 mL水，浸泡30 min，武火加熱，文火煎煮60 min，紗布濾過，濾液水浴濃縮至25 mL含生藥量2 g/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5甘草總黃酮和總皂苷的制備

前期通過正交試驗(yàn)優(yōu)選野生和栽培甘草總黃酮、總皂苷超聲提取工藝結(jié)果。野生甘草總黃酮、總皂苷超聲提取條件：提取溫度50 ℃，提取時(shí)間45 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)600 mL /L，料液比1∶10。栽培甘草總黃酮和總皂苷提取條件：提取溫度40 ℃，提取時(shí)間40 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)800 mL/L，料液比1∶10。將提取液濃縮，加氨水至溶液為堿性，用乙酸乙酯萃取4次，濃縮至固體，即得甘草總黃酮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為750 g/L。收集下層萃取液，加鹽酸至pH值為1～2，冰箱靜置，使甘草總皂苷充分沉淀，離心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草總皂苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為450 g/L[3]。

1.6甘草內(nèi)生菌有效菌株的篩選

參照參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。 將野生和栽培甘草分別分離培養(yǎng)純化[5]。野生甘草分離出63株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌31株，內(nèi)生真菌32株；栽培甘草分離出77株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌63株，內(nèi)生真菌14株。以菌餅法對(duì)分離的內(nèi)生菌中的金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌分別進(jìn)行體外抑菌篩選，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用的有18株(JTYB006，029；JTYF023；JTZB002，005，006，014，016，018，020，043，054，058，059，060，062，063；JTZF011)，對(duì)肺炎鏈球菌抑制作用的3株(JTZB005，043；JTZF014)，對(duì)大腸桿菌抑制作用的3株(JTYB012；JTZB018，020)。

1.7甘草內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的制備

參照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。將甘草內(nèi)生細(xì)菌于營養(yǎng)瓊脂中，25 ℃恒溫培養(yǎng)2 d；將營養(yǎng)肉湯按每瓶100 mL分裝至250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min；將活化的菌株用接種環(huán)各挑去3環(huán)菌種接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)4 d；發(fā)酵完成后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；上清液采用0.22 μm過濾器過濾，60 ℃條件下烘干，備用。

1.8甘草內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備

參照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。將甘草內(nèi)生真菌于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，25 ℃暗箱培養(yǎng)7 d；將馬鈴薯水按每瓶100 mL分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min；將活化后的菌株用打孔器打3個(gè)菌餅接種于馬鈴薯水中，25 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)7 d；發(fā)酵完成后，4 ℃、12 000 r/min離心5 min；上清液采用0.22 μm過濾器過濾，60 ℃條件下烘干，備用。

1.9檢測(cè)指標(biāo)

1.9.1對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌抑菌作用的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。分別將金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌置恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18 h，于試管壁上研磨并溶于2 mL生理鹽水中，配置成相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛鹊木?。用微量移液器吸?00 μL于直徑為90 mm的無菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，三角玻璃棒涂布均勻，用直徑為6 mm的無菌打孔器在涂菌的固體培養(yǎng)基上均勻且垂直打3個(gè)孔，呈正三角形。吸取相應(yīng)藥液于孔中，無菌蒸餾水做對(duì)照，各做3個(gè)平皿。37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算3個(gè)平皿9個(gè)孔的抑菌圈的平均值。

1.9.2各組最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。在96孔板中每孔加入80 μL滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，按二倍稀釋法加入1 g/mL的藥液100 μL至第10孔，之后在第1～11孔中加入20 μL相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡舛鹊木海?2孔中加入20 μL無菌蒸餾水。37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察培養(yǎng)液，澄清者表明有抑菌作用。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的抑制作用

野生與栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株發(fā)酵物、水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)。各有效菌株組抑菌活性均弱于宿主組；有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。見表1。

表1　對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01；與野生甘草水煎液對(duì)比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對(duì)比，△P<0.05，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對(duì)比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對(duì)比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對(duì)比，□□P<0.01；與栽培甘草總皂苷對(duì)比，■■P<0.01。

栽培甘草內(nèi)生菌有效菌株、水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)肺炎鏈球菌均有抑菌活性(P<0.01)。與栽培甘草水煎液、栽培甘草總皂苷比較，JTZB005抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)。有效菌株中JTZB005抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中野生甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。見表2。

表2　對(duì)肺炎鏈球菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對(duì)比，**P<0.01；與野生甘草水煎液對(duì)比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對(duì)比，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對(duì)比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對(duì)比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對(duì)比，□P<0.05；與栽培甘草總皂苷對(duì)比，■■P<0.01。

各有效菌株、水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)。與栽培甘草水煎液、栽培甘草總黃酮對(duì)比，JTZB018抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)。有效菌株中JTZB018抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，宿主中野生、栽培甘草總黃酮抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)。見表3。

表3　對(duì)大腸桿菌抑菌圈值表　　±s

注：JTYB為野生甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTYF為野生甘草內(nèi)生真菌，JTZB為栽培甘草內(nèi)生細(xì)菌，JTZF為栽培甘草內(nèi)生真菌。與無菌水對(duì)比，**P<0.01；與野生甘草水煎液對(duì)比，##P<0.01；與栽培甘草水煎液對(duì)比，△△P<0.01；與野生甘草總黃酮對(duì)比，＊＊P<0.01；與栽培甘草總黃酮對(duì)比，▲▲P<0.01；與野生甘草總皂苷對(duì)比，□P<0.05，□□P<0.01；與栽培甘草總皂苷對(duì)比，■■P<0.01。

2.2各有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的MIC

見表4。

表4　對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌的MIC(48h)測(cè)定表　　g·mL-1

續(xù)表4

注：“—”為無抑菌作用。

3討論

實(shí)驗(yàn)中，從野生與栽培甘草中共分離出140株內(nèi)生菌，由于菌株較多，無法全部發(fā)酵與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷進(jìn)行體外抑菌活性對(duì)比研究；因此，先將140株內(nèi)生菌經(jīng)體外抑菌篩選有效菌種，體外抑菌實(shí)驗(yàn)可簡(jiǎn)單、快捷篩選出有效抑菌受試藥物，能夠準(zhǔn)確、定量地得出供試品的抑菌強(qiáng)度，且不受內(nèi)環(huán)境等多種因素的干擾，重現(xiàn)性好。篩選出20株有效菌種與甘草水煎液、總黃酮、總皂苷分別進(jìn)行二次體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：18株內(nèi)生菌對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑菌活性(P<0.01)，有效菌株中JTZB059、JTYB029抑菌活性相對(duì)較強(qiáng)，最小抑菌濃度分別為0.125 0，0.062 5 g/mL。3株(JTZB005，043；JTZF014)對(duì)肺炎鏈球菌有抑菌活性(P<0.01)；與栽培甘草水煎液、總皂苷對(duì)比，JTZB005抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃度0.062 5 g/mL。3株(JTYB012；JTZB018，020)對(duì)大腸桿菌均有抑菌活性(P<0.01)，與栽培甘草水煎液、總黃酮對(duì)比，JTZB018抑菌活性較強(qiáng)(P<0.01)，最小抑菌濃0.125 0 g/mL。結(jié)果提示：20株甘草內(nèi)生菌對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌均有不同程度抑菌活性，在一定抑菌范圍內(nèi)甘草內(nèi)生菌可替代甘草水煎液或甘草總黃酮、甘草總皂苷。

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(編輯陶珠)

文章編號(hào):1001-6910(2016)05-0066-05·藥學(xué)研究·

中圖分類號(hào):R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

doi:10.3969/j.issn.1001-6910.2016.05.33

通信作者：鄧毅，教授，dengyi@gszy.edu.cn

* 基金項(xiàng)目：國家自然基金(81360633)

收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-14