李敏晶　王旭瑩　張宇　劉遠(yuǎn)

摘要[目的]探討多棘海盤車多肽的抗氧化活性。[方法]對(duì)多棘海盤車中水溶性蛋白進(jìn)行提取，再采用酶解法，以胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別酶解水溶性蛋白，經(jīng)離心、透析、凍干后分別得到多肽樣品TP、PP。通過(guò)分析TP、PP對(duì)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O-2·）、1，1二苯基2三硝基苯肼自由基（DPPH·）的清除能力及在脂質(zhì)體系中的抗氧化能力來(lái)表征其體外抗氧化活性。[結(jié)果]TP、PP對(duì)3種自由基均具有一定的清除作用，對(duì)脂質(zhì)體系的氧化也有一定的抑制作用；PP的抗氧化活性優(yōu)于TP；TP、PP的抗氧化活性均弱于水溶性蛋白。[結(jié)論]研究可為多棘海盤車多肽的深入研究及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 多棘海盤車；多肽；抗氧化活性

中圖分類號(hào) S912 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2016）05-113-03

Abstract[Objective]To discuss the antioxidant activity in vitro of the enzymolysis peptide from Asterias amurensis.[Method]Watersoluble protein was extracted from A. amurensis， and then was enzymolyzed by trypsin and papain using enzyme hydrolysis method. After centrifugation， dialysis and freeze drying， peptide samples TP and PP were obtained. Antioxidant activity in vitro was characterized based on analyzing the scavenging activities of TP and PP to hydroxyl radical （·OH）， superoxide anion free radical （O-2·）， and 1， 1 diphenyl 2 trinitrobenzene hydrazine free radicals （DPPH·）.[Result]TP and PP had certain scavenging action to the three free radicals， and had certain inhibitory effects on the oxidation of lipid system.[Conclusion]Antioxidant activity of PP is superior to that of TP； antioxidant activities of TP and PP were poorer to that of watersoluble protein.

Key words Asterias amurensis； Polypeptide； Antioxidant activity

多棘海盤車是我國(guó)黃海沿岸一種十分常見(jiàn)的海星，它屬于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，棘皮動(dòng)物門、海星綱、鉗棘目、海盤車科。多棘海盤車體呈五星型，口面平坦為淺黃色，反口面較隆起，表面附有較多棘刺，為紫紅色，是我國(guó)北方海域海星的主要品種[1]。近幾十年來(lái)，國(guó)外的科研人員在各種不同種類的海星中獲取了多種活性成分，如：皂苷、甾醇、多糖、蛋白質(zhì)及氨基酸等，因其具有多種生理及藥理活性使得國(guó)內(nèi)也有越來(lái)越多的科研人員關(guān)注到這一領(lǐng)域[2-4]。已有研究證明，很多從天然產(chǎn)物中獲得的多肽具有抗氧化活性[5-7]，但是多棘海盤車酶解多肽抗氧化活性的研究少見(jiàn)報(bào)道。筆者探討了多棘海盤車酶解多肽的抗氧化活性，以期為多棘海盤車多肽的進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。 多棘海盤車，采自遼寧省大連市黃海海域；木瓜蛋白酶（BR，200 000 U/g）；胰蛋白酶（BR，800～2 500 U/mg）；1，1二苯基2三硝基苯肼（DPPH）、VC、鄰苯三酚、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞油酸、硫氰酸銨、無(wú)水乙醇、超純水等試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（OPTIZEN 2620UV型）；恒溫水浴鍋（SY24型）；離心機(jī)（LDZ4型）；真空冷凍干燥機(jī)（SIM FD5型）；恒溫培養(yǎng)箱（SPX250GB型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101G1B型）；磁力攪拌器（FW100型）；pH計(jì)（PB10型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS型）；電子天平（AL204型）；萬(wàn)能粉碎機(jī)（FW100型）；純水制備系統(tǒng)（MilliQ型）。

1.2 方法

1.2.1 酶解多肽的制備。

將多棘海盤車樣品于烘箱中60 ℃恒溫烘干，在粉碎后過(guò)40目篩，備用。

1.2.1.1 水溶性蛋白的制備。采用1∶10 g/mL的固液比用蒸餾水作為溶劑提取多棘海盤車樣品，提取液經(jīng)濃縮、透析、離心、冷凍干燥，得到水溶性蛋白樣品，0～4 ℃冷藏備用。

1.2.1.2

TP的制備。采用1∶15 g/mL的固液比用蒸餾水作為溶劑溶解水溶性蛋白樣品，加入9%的胰蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH 6.0，50 ℃酶解6 h后100 ℃滅活，冷卻、離心、冷凍干燥，得到多肽樣品TP，0～4 ℃冷藏備用。

1.2.1.3 PP的制備。采用1∶15 g/mL的固液比用蒸餾水作為溶劑溶解水溶性蛋白樣品，加入9%的木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)溶液pH 5.5，70 ℃酶解4 h后100 ℃滅活，冷卻、離心、冷凍干燥，得到多肽樣品PP，0～4 ℃冷藏備用。

1.2.2 對(duì)自由基的清除作用的測(cè)定。

對(duì)1，1苯基2三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧陰離子自由基（O-2·）、羥基自由基（·OH）清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.3 脂質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定。

對(duì)多肽的脂質(zhì)抗氧化活性測(cè)定采用FTC[ 9-10]法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)DPPH·的清除作用

由圖1可知，TP、PP對(duì)DPPH·都有較好的清除作用，隨著這2種多肽質(zhì)量濃度的增加，其清除作用也逐漸增強(qiáng)。在濃度較低時(shí)，2種多肽的抗氧化活性較為接近，當(dāng)濃度大于1.0 mg/mL 后，PP對(duì)DPPH·的清除率在相同濃度下顯著高于TP。通過(guò)清除率曲線可以看出，TP的濃度和清除率之間的關(guān)系呈明顯的線性關(guān)系。2種多肽對(duì)比可知，由木瓜蛋白酶酶解所得的多肽抗氧化活性可能優(yōu)于胰蛋白酶酶解所得多肽。

2.2 對(duì)O-2·的清除作用

TP、PP對(duì)O-2·的清除作用如圖2所示，2種多肽對(duì)O-2·的清除活性并不顯著，整體趨勢(shì)仍有隨多肽質(zhì)量濃度的增大而增大的情況，但是在相同濃度下PP對(duì)O-2·的清除率略高于TP。該結(jié)果進(jìn)一步證明了不同酶水解所得的多棘海盤車多肽其抗氧化活性也存在差異，PP的抗氧化活性優(yōu)于TP。

2.3 對(duì)·OH的清除作用

由圖3可知，在試驗(yàn)濃度條件下，TP、PP對(duì)·OH的清除作用效果并不顯著。清除率隨樣品濃度的增大而增大，在相同濃度下PP對(duì)·OH的清除率略高于TP，該結(jié)果與TP、PP對(duì)DPPH·和O-2·的清除作用結(jié)論相同。

2.4 脂質(zhì)抗氧化作用

如圖4所示，TP、PP對(duì)亞油酸乳化體系的抗氧化效果比較顯著，且隨著樣品濃度的增加，抑制能力也在增加；當(dāng)濃度達(dá)到0.8 mg/mL時(shí)，PP的脂質(zhì)體系抗氧化能力有顯著的提升，當(dāng)濃度大于0.8 mg/mL時(shí)，其抗氧化能力增長(zhǎng)緩慢，趨于平衡，整體抑制能力較強(qiáng)并顯著高于TP。TP的脂質(zhì)抗氧化活性隨濃度的增加而逐漸增大，基本呈線性增長(zhǎng)關(guān)系。

2.5 多肽與蛋白抗氧化活性比較

在同一濃度（0.4 mg/mL）時(shí)，水溶性蛋白、TP、PP的抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，水溶性蛋白對(duì)于3種自由基的清除作用顯著高于酶解多肽，特別是對(duì)于·OH的清除效果十分顯著，已超過(guò)90%。該結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于水溶液中的自由基清除活性，水溶性蛋白要比酶解多肽更加顯著。但是，在脂質(zhì)體系中，水溶性蛋白的抗氧化能力表現(xiàn)稍差。分析其原因：水溶性蛋白是水提成分且分子量較大，不溶于脂質(zhì)體系，因此在脂質(zhì)體系中不能更好地分散在溶液中從而不能有效表達(dá)其抗氧化活性所致，而多肽由于分子量較小，相對(duì)溶解度要高于水溶性蛋白，因此脂質(zhì)抗氧化活性優(yōu)于蛋白本身。

3 結(jié)論與討論

該研究表明，采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備的多棘海盤車多肽，對(duì)DPPH·、O-2·和·OH均具有一定的清除作用，對(duì)脂質(zhì)體系的氧化也有一定的抑制作用。根據(jù)清除率計(jì)算結(jié)果可知，TP、PP對(duì)DPPH·清除作用和脂質(zhì)氧化的抑制作用較為顯著，而對(duì)O-2·和·OH的清除作用并不顯著。多肽樣品的濃度越高，其對(duì)自由基清除的效果和對(duì)脂質(zhì)氧化的抑制作用越好，其中由木瓜蛋白酶酶解得到的多肽抗氧化活性要優(yōu)于胰蛋白酶酶解所得多肽；相同濃度下，多棘海盤車水溶性蛋白的清除自由基的能力顯著高于酶解多肽，最高可相差9倍。與前人研究結(jié)果相比，由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解多棘海盤車所得多肽對(duì)3種自由基的清除率及其脂質(zhì)體系的抗氧化活性均低于海參、海藻等海洋生物酶解多肽[11-12]。但是對(duì)多棘海盤車酶解多肽的抗氧化活性的研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道，且海星一般屬于廢棄資源，通過(guò)該研究能夠獲得具有活性的組分，可為海星資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

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