秦鵬　謝鵬　劉廣宇　梁宏基　梁淑娃

摘要[目的]提高羅伊氏乳桿菌在冷凍干燥過程中的存活率。[方法]采用響應曲面法，對羅伊氏乳桿菌凍干保護劑中低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖這3種主要成分進行了研究，探討羅伊氏乳桿菌最優(yōu)化的凍干保護劑配方。[結(jié)果]建立的回歸模型達到極顯著水平，無失擬因素存在。優(yōu)化的保護劑配方為：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，凍干存活率達到89.43%，較優(yōu)化前提高了13.76%。[結(jié)論]響應曲面法可用于羅伊氏乳桿菌冷凍干燥保護劑的工藝參數(shù)配比優(yōu)化，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎。

關(guān)鍵詞 羅伊氏乳桿菌；凍干保護劑；響應曲面法；存活率

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）05-006-02

Abstract[Objective]To increase the survival rate of Lactobacillus reuteri after lyophilization.[Method]Response surface methodology was used to investigate the three main components， such as fructooligosaccharide， dried skim milk and trehalose. The optimum formula of lyophilizing protectants for L. reuteri was obtained.[Result]The regression model reached extremely significant level with no factor of lack of fit. The optimized formula was 2.66% fructooligosaccharide， 10.11% dried skim milk and 5.90% trehalose. The survival rate of L. reuteri after lyophilization was 89.43% ， which increased by 13.76%.[Conclusion]Response Surface Method can be used for the optimization of formula of lyophilizing protectants of L. reuteri， which lays foundation for the industrialized production.

Key words Lactobacillus reuteri； Lyophilizing protectants； Response surface method； Survival rate

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是普遍存在于人類和大部分動物腸道中的益生菌。它可以代謝產(chǎn)生有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素及類細菌素等物質(zhì)[1-2]，能夠有效抑制病原菌和腐敗菌，維持體內(nèi)道微生態(tài)平衡，且安全無毒副作用，具有耐酸、耐膽鹽和腸道定殖等特性。動物試驗結(jié)果表明羅氏乳桿菌沒有安全性方面的問題[3]。目前，羅伊氏乳桿菌已被世界各國批準使用，是國際上公認的新型益生乳酸菌，具有很高的理論研究和生產(chǎn)應用價值[4]。我國衛(wèi)生部于 2003 年批準了羅伊氏乳桿菌作為人類保健品的微生物菌種。

目前，商品化的羅伊氏乳桿菌制劑，具有較高的細胞存活數(shù)量和較高的細胞活力，能更充分地發(fā)揮乳酸菌的功能性質(zhì)[5]，通常使用冷凍干燥的方法來制備。但是，目前對人用羅伊乳桿菌的冷凍干燥技術(shù)研究的報道少之又少。使用適宜的凍干保護劑[6-8]是提高凍干過程菌體存活率的關(guān)鍵之一，也是制備高活性凍干菌劑的重要一環(huán)。

響應面分析法試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精確度高，可以研究幾個因素的交互作用，是降低生產(chǎn)成本，優(yōu)化生產(chǎn)工藝條件的一種有效方法。近年來，響應面分析法受到越來越多的重視，并成功應用到農(nóng)業(yè)、生物、食品等領(lǐng)域[9]。筆者采用響應曲面法對羅伊氏乳桿菌冷凍干燥保護劑進行了研究，探索最優(yōu)化的保護劑組分，以提高凍干過程的菌體存活率。

1 材料與方法

1.1 菌種

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri），由廣州市微生物研究所保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 活化培養(yǎng)基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖 2%、磷酸氫二鉀 0.2%、檸檬酸氫二銨 0.2%、乙酸鈉 0.5%、硫酸鎂 0.05%、瓊脂2%、pH 6.2～6.4。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉1%、葡萄糖 2.5%、磷酸氫二鉀 0.2%、檸檬酸氫二銨 0.2%、乙酸鈉 0.5%、硫酸鎂 0.05%、吐溫80 0.1%、pH 6.2～6.4。

1.3 主要試劑

低聚果糖和海藻糖為生化試劑，購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；脫脂乳粉為食品級，購自新西蘭恒天然集團。

1.4 羅伊氏乳桿菌的培養(yǎng)及凍干

取羅伊氏乳桿菌凍存管，接種于活化培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng) 12～24 h。挑取具有典型形態(tài)的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃下厭氧培養(yǎng) 24 h ，5 000 r/min條件下離心10 min，收集菌泥；加入適量生理鹽水重新懸浮。在上述菌懸液中，加入不同組別的凍干保護劑，充分攪拌溶解后，取樣檢測活菌數(shù)；然后，分裝于西林瓶中，每瓶2 mL，每組5個重復。將各組樣品置于-40 ℃冰箱中預冷4 h，然后置于預冷的冷凍干燥機中冷凍干燥16～18 h。凍干過程中觀察不同凍干劑組水分升華快慢情況，待全部樣品冷凍干燥充分后取出樣品，取樣進行活菌計數(shù)。

1.5 檢測方法

采用稀釋倒平板法測定乳酸菌菌落總數(shù)，具體原理和步驟參考《GB 4789-2010》[10]中乳酸菌菌落總數(shù)的測定方法，按照以下公式計算：

Rc（%）=CtC0×100

式中，Rc為冷凍干燥后羅伊氏乳桿菌的存活率，Ct為冷凍干燥后的活菌數(shù)，C0為冷凍干燥前的活菌數(shù)。

1.6 冷凍干燥保護劑的優(yōu)化

根據(jù)前期的研究結(jié)果，選取低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖這3個因子作為研究對象，進行響應面試驗，以存活率（Rc）作為試驗的響應值，使用Design expert 7.5進行試驗設計與數(shù)據(jù)分析。中心組合試驗實際的因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應面試驗

響應面試驗結(jié)果見表2 。對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析。方差分析表明，所選模型的F=100.255 9，P<0.000 1說明因變量Rc與全體變量之間的回歸關(guān)系顯著，也即模型回歸顯著。R2=0.989，說明因變量Rc與全體變量之間的線性關(guān)系顯著。失擬項F=4.443，P=0.063 7>0.01，差異不顯著，說明試驗預測值和實際值相吻合，試驗擬合性好，試驗誤差小。該研究中的變異系數(shù)為1.52%，而變異系數(shù)反映模型的置信度，其越低模型的置信度越高，說明模型方程能很好地反映真實的試驗值，可用于預測酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液活菌數(shù)。根據(jù)模型得到的回歸方程為 Rc=85.154+4.110×A+3.859×B+5.547×C-2.05×A×B-1.3×A×C-2.15×B×C-2.125×A2-4.282×B2-2.532×C2。

對回歸方程的方差分析表明，因素A（低聚果糖）和B（脫脂乳粉）的交互作用（P=0.000 7<0.01）及因素B（脫脂乳粉）和C（海藻糖）的交互作用（P=0.000 5<0.01）對冷凍干燥后羅伊氏乳桿菌的存活率的影響顯著。

從圖1～3可以看出，響應曲面呈傘形，中心凸起，說明2因素之間的影響基本呈拋物線型關(guān)系，均有一個極大值點，呈先增大后減小的趨勢。如果體系中保護劑的添加量過低，會有大量細胞裸露在介質(zhì)中，在凍干時就可能改變細胞通透性，不能起到保護菌體的作用；反之，體系中保護劑太多，細胞的滲透壓和通透性也會受影響，進而導致存活率下降。

以上分析表明，存在適宜的低聚果糖、脫脂乳粉和海藻糖濃度使得冷凍干燥過程中菌存活率Rc最高。最優(yōu)化條件為：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%，在此條件下預測的響應值（Rc）可達89.13%。

2.2 驗證試驗

為驗證預測值與真實值之間的擬合程度，使用上述優(yōu)化條件在搖瓶水平上進行了重復驗證試驗：低聚 果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%。試驗按優(yōu)化前和優(yōu)化后的配方進行，3次重復。驗證試驗結(jié)果表明，優(yōu)化前羅伊爾乳桿菌的存活率分別為75.8%、77.3%和73.9%（平均值為75.7%）；優(yōu)化后羅伊爾乳桿菌的存活率為89.4%、88.7%和90.2%（平均89.4%），較優(yōu)化前提高了13.76%，說明試驗值與軟件預測值的擬合性良好。

3 討論與結(jié)論

國內(nèi)對羅伊氏乳桿菌凍干保護劑的研究較少。朱戰(zhàn)波等[11]使用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計法對1株豬源羅伊氏乳桿菌進行了凍干保護劑的優(yōu)化研究，凍干存活率達到71.6%。

筆者以乳桿菌制劑的冷凍干燥工藝中的凍干存活率為研究對象，通過響應曲面法建立了凍干保護劑低聚果糖、低脂乳粉和海藻糖與存活率Rc的關(guān)系，并實現(xiàn)條件優(yōu)化。最優(yōu)條件如下：低聚果糖 2.66%、脫脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%，存活率預測值為89.13%。通過驗證試驗證實該設計方法是切實可行的，優(yōu)化后羅伊爾乳桿菌的存活率達到89.43%，且與模型預測值非常接近；羅伊爾乳桿菌的存活率較優(yōu)化前提高了13.76%，優(yōu)于朱戰(zhàn)波等[11]的試驗結(jié)果，為羅伊氏乳桿菌冷凍干燥工藝的開發(fā)與優(yōu)化提供了研究基礎。

參考文獻

[1]王成濤，曹雁平，孫國寶，等.產(chǎn)類細菌素乳酸菌的篩選及其生物學特性研究[J].中國釀造，2008（23）：50-53.

[2]SUSAN F B，CATHERINE G N.Antibiosis revisited：Bacteriocins produced by dairy starter cultures[J].Journal of dairy science，1993，76（8）：2366-2379.

[3]ADAMS M R.Safety of industrial lactic acid bacteria[J].Biotechnol，1999，68：171-178.

[4]龐潔，周娜，劉鵬，等.羅伊氏乳桿菌的益生功能[J].中國生物工程雜志，2011，31（ 5）：131-137.

[5] CARVALHO A S， SILVA J， HO P，et al. Relevant factors for the preparation of freezedried lactic acid bacteria[J].International dairy journal，2004，14（10）：835-847.

[6]蒲麗麗，劉寧，張英華，等. 乳酸菌凍干保護劑及保護機理的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技，2004，21（1）：147-149，153.

[7]張英華，霍貴成，郭鸰. 乳酸菌冷凍干燥保護劑的篩選及加速儲存穩(wěn)定性試驗[J].中國乳品工業(yè)，2007，35（2）：8-10.

[8]WASSERMAN A E，HOPKINS W J.Studies in the recovery of viable cells of freeze-dried Serratia marcescens[J].Appl Microbiol，1957，5（5）：295-300.

[9]曹小紅，哈志瑞，王春玲，等.應面法對Bacllius natto TK-2產(chǎn)聚-γ-谷氨酸（γPGA）發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，9（1）：24-26.

[10]中國人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準食品微生物學檢驗：GB 4789.3-2010[S].北京：中國標準出版社，2010.

[11]朱戰(zhàn)波，劉存霞，劉宇，等.二次正交旋轉(zhuǎn)組合設計優(yōu)化豬源羅伊乳桿菌冷凍干燥保護劑[J].中國生物制品學雜志，2009，22（11）：1091-1092.

安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anhui Agri. Sci.2016，44（5）：15-17