薛 丹，倪 健，張 鵬，楊春靜，趙 陽(yáng)，夏振文，尹興斌，李友林（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 000；.中日友好醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，北京0009）

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多指標(biāo)正交設(shè)計(jì)優(yōu)選芪防鼻敏顆粒水提醇沉工藝*

薛 丹1，倪 健1，張 鵬1，楊春靜1，趙 陽(yáng)1，夏振文1，尹興斌1，李友林2
（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中日友好醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室，北京100029）

摘要：［目的］多指標(biāo)綜合優(yōu)選芪防鼻敏顆粒的水提醇沉工藝。［方法］以黃芪甲苷、芍藥苷提取率為指標(biāo)，考察提取工藝條件；以黃芪甲苷、芍藥苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，考察醇沉條件。［結(jié)果］最佳水提醇沉工藝為飲片加12倍加水量，提取3次，每次1.5 h；濃縮液相對(duì)密度為1.15～1.20（60℃）時(shí)，加乙醇為60%。［結(jié)論］該工藝穩(wěn)定可行，可為芪防鼻敏顆粒的工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃芪甲苷；芍藥苷；水提醇沉；多指標(biāo)

過敏性鼻炎（Allergic Rhinitis，AR）又叫變應(yīng)性鼻炎，是最常見的過敏性疾病之一，在全球的發(fā)病率為10%～25%［1］，在中醫(yī)屬于鼻鼽的范疇，以突然和反復(fù)發(fā)作的鼻癢、鼻塞、噴嚏、流清涕為特征［2-3］，大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為本病是肺脾腎三臟虛損，風(fēng)寒異氣之邪乘襲［4］。西醫(yī)對(duì)過敏性鼻炎的治療主要是對(duì)癥治療，常用藥物為抗組胺藥、減充血?jiǎng)⒖鼓憠A藥、糖皮質(zhì)類固醇激素、肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑、白三烯受體拮抗劑等［5-7］。中醫(yī)藥辨證治療過敏性鼻炎具有遠(yuǎn)期療效穩(wěn)定，復(fù)發(fā)率低等特點(diǎn)，標(biāo)本兼治，從根本上治愈疾?。?］。

芪防鼻敏方是臨床經(jīng)驗(yàn)方，全方由黃芪、桂枝、白芍等12味藥組成，具有健脾益肺，溫陽(yáng)固表，宣通鼻竅之效，用于肺脾兩虛，胃陽(yáng)不固，肺竅不利所致的鼻鼽，癥見噴嚏、鼻塞、鼻癢、流清涕，畏寒惡風(fēng)，動(dòng)則喘乏，食少便溏；過敏性鼻炎見上述癥狀者。長(zhǎng)期以湯藥及配方顆粒形式用于治療過敏性鼻炎，且具有較好的療效。該方重用黃芪補(bǔ)脾益肺、實(shí)衛(wèi)固表為君藥；藥理研究表明黃芪具有類激素樣和免疫促進(jìn)作用，提高機(jī)體免疫力，減少疾病復(fù)發(fā)［9］；桂枝、白芍調(diào)和營(yíng)衛(wèi)，發(fā)表解肌為臣藥。本研究結(jié)合顆粒劑性質(zhì)穩(wěn)定、生物利用度高、便于工業(yè)化生產(chǎn)和攜帶服用方便的優(yōu)點(diǎn)，擬將其制成顆粒劑，為過敏性鼻炎患者提供一種新的中成藥。根據(jù)處方中藥物所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及藥理作用，采用正交實(shí)驗(yàn)法，以黃芪甲苷、芍藥苷為指標(biāo)，優(yōu)選芪防鼻敏顆粒的水提醇沉工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司；Agilent1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（奧泰公司）；BT125D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；ZDHW型調(diào)溫電熱套（北京市中興偉業(yè)儀器有限公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；DZ-28BC型真空干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-4型恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.2 試藥 黃芪甲苷（中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110781-201314）；芍藥苷（月旭材料科技（上海）有限公司，批號(hào)：23180-57-6）；黃芪、白芍等飲片均購(gòu)自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)檢驗(yàn)符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版）標(biāo)準(zhǔn)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 安捷倫Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水（30∶70）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）參數(shù)：漂移管溫度100℃，載氣（壓縮空氣）流速2.7 L/min，進(jìn)樣量10 μL（圖1）。

圖1 黃芪甲苷液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of astragaloside IV

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.513 g/L的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取干膏適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱定，加水50 mL超聲使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次50 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制備工藝制備不含黃芪的干膏，按照2.1.3供試品制備方法制備樣品即得陰性對(duì)照液。

2.2 芍藥苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量5 μL（圖2）。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.042 96 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取干膏適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇35 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 KHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

圖2 芍藥苷液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of paeoniflorin

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例及制備工藝制備不含白芍的干膏，按照2.2.3供試品制備方法制備樣品即得陰性對(duì)照液。

2.3 水提工藝優(yōu)選

2.3.1 水提正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)研究參考相關(guān)文獻(xiàn)［10-13］，選取加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，以黃芪甲苷提取率、芍藥苷提取率、干膏得率為考察指標(biāo)優(yōu)選最佳水提工藝，因素水平見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Orthogonal experimental factors and levels

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法 按處方比例稱取黃芪、白芍等藥材共9份，按L9（34）正交表進(jìn)行水煎煮提取，提取液濾過，濃縮，真空干燥（65℃，-0.08 MPa）至恒重，精密稱定重量，計(jì)算干膏得率。按照2.1.3、2.2.3供試品制備方法制備供試品，分別測(cè)定其中黃芪甲苷、芍藥苷的提取率。

2.3.3 水提正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法［14］，以各指標(biāo)提取率最大值為參照，將數(shù)據(jù)歸一化分析，根據(jù)處方配比，黃芪（X）的權(quán)重系數(shù)為7/9，白芍（Y）的權(quán)重系數(shù)為2/9，綜合評(píng)分（M）=（7X/9× 74.93+2Y/9×79.47）×100。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of variance analysis

以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，直觀分析表明，各因素影響大小順序?yàn)镃＞A＞B＞D，最佳提取組合為A3B2C3，即藥材加12倍量水煎煮3次，每次1.5 h；方差分析表明，提取次數(shù)C具有顯著性差異，其余影響因素均無顯著性差異，故確定水提取工藝為A3B2C3，即12倍量水，提取3次，每次1.5 h。

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步考察最佳提取工藝的穩(wěn)定性與可靠性，按處方比例稱取藥材3份，按最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，操作方法同前述，測(cè)定黃芪甲苷、芍藥苷提取率，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of verification experiment

結(jié)果表明，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交表中最優(yōu)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果相當(dāng)，說明該提取工藝穩(wěn)定可行。

2.4 醇沉工藝優(yōu)選

2.4.1 相對(duì)密度對(duì)醇沉工藝的影響 影響醇沉的主要因素有藥液濃縮相對(duì)密度、醇濃度，查閱相關(guān)文獻(xiàn)顯示，黃芪、白芍等藥的水提液醇沉濃度多為60%［15-16］。以黃芪甲苷、芍藥苷轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，考察相對(duì)密度對(duì)60%醇沉工藝的影響。按處方稱取藥材以最佳提取工藝提取，藥液濃縮至相對(duì)密度分別為（60℃）1.05～1.10、1.10～1.15、1.15～1.20左右，加入乙醇至60%，冷藏靜置過夜，減壓過濾，上清液濃縮得干浸膏，按照2.1.3、2.2.3供試品制備方法制備供試品，分別測(cè)定其中黃芪甲苷、芍藥苷的轉(zhuǎn)移率。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過綜合評(píng)分法直觀分析醇沉最佳相對(duì)密度為1.15～1.20（60℃），在此條件下黃芪甲苷、芍藥苷均有較高的轉(zhuǎn)移率，故確定最佳醇沉工藝為提取液濃縮至相對(duì)密度1.15～1.20（60℃），醇沉濃度為60%，冷藏靜置過夜。相對(duì)密度對(duì)醇沉工藝影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 不同相對(duì)密度對(duì)醇沉工藝影響Tab.5 Effects of different relative density to alcohol precipitation process

2.4.3 醇沉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取處方量藥材，按照最優(yōu)水提醇沉工藝驗(yàn)證3批，驗(yàn)證結(jié)果見表6，與醇沉實(shí)驗(yàn)最優(yōu)實(shí)驗(yàn)比較，說明該醇沉工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

3.1 處方中藥味較多，成分復(fù)雜，若以單一成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選最優(yōu)提取條件，不能保證其整體質(zhì)量，故本實(shí)驗(yàn)以君藥黃芪的主要有效成分黃芪甲苷、臣藥白芍主要有效成分芍藥苷為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察芪防鼻敏顆粒的最優(yōu)水提醇沉工藝，使其更具有代表性、全面性。

表6 醇沉驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of alcohol precipitation process

3.2 確定的水提醇沉條件與文獻(xiàn)［15-18］基本一致。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)，以黃芪甲苷、芍藥苷提取率綜合評(píng)分為指標(biāo)，優(yōu)選出芪防鼻敏顆粒的最優(yōu)水提醇沉工藝，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該工藝穩(wěn)定可行，可用于指導(dǎo)制劑生產(chǎn)。

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（本文編輯：高 杉，張震之）

Optimization of aqueous extraction-alcohol precipitation technology for Qifang Bimin granules with multi-index orthogonally designed experiments

XUE Dan1，NI Jian1，ZHANG Peng1，YANG Chun-jing1，ZHAO Yang1，XIA Zhen-wen1，YIN Xing-bin1，LI You-lin2
（1. College of Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China；2. China-Japan Friendship Hospital and Key Laboratory of the State Pharmaceutical Administration，Beijing 100029，China）

Abstract:［Objective］To investigate the technology of optimal water extraction and alcohol precipitation for Qifang Bimin granules with Multi-index.［Methods］The study employed the extraction rate of astragaloside IV and paeoniflorin as evaluation indexes to investigate extraction conditions. We also investigate alcohol precipitation condition in the metastatic rate of astragaloside IV and paeoniflorin as detective index.［Results］The optimal water extraction and alcohol precipitation was extracted 3 times，with 12 folds the amount of water，1.5 h for each time. The extracts were concentrated to the relative density of 1.15～1.20（60℃）with the concentration of alcohol precipitation 60%.［Conclusion］Optimized water extraction and alcohol precipitation technology was reasonable and feasible and it could provide a reference for industrial production of Qifang Bimin granules.

Key words:astragaloside IV；paeoniflorin；water extraction and alcohol precipitation；multi-index

中圖分類號(hào)：R223.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1519（2016）01-0039-04

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.01.10

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81173563）；北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)“十病十藥”研發(fā)項(xiàng)目（Z141100002214018）。

作者簡(jiǎn)介：薛 丹（1991-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴幮聞┬团c新技術(shù)。

通訊作者：尹興斌，E-mail：yxbtcm@163.com；李友林，E-mail：gjzdyjs2009@163.com。

收稿日期：（2015-10-05）