何雪瑩，楊錦芬，張敏玲，鐘志敏，于安民，徐暉，詹若挺，陳蔚文

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州　510006；2.嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州　510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州　510006；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)所級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明　650201）

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水楊酸及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)在陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中的變化

何雪瑩1，2，楊錦芬1，2，張敏玲1，2，鐘志敏3，于安民4，徐暉1，2，詹若挺1，2，陳蔚文1，2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心，廣東廣州510006；2.嶺南中藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；4.中國科學(xué)院昆明植物研究所資源植物與生物技術(shù)所級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201）

摘要：【目的】對陽春砂發(fā)育過程中內(nèi)源水楊酸含量及轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因的關(guān)系進(jìn)行深入分析?！痉椒ā恳?月、8月采集的陽春砂新鮮果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，采用液相質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）的方法測定陽春砂種子團(tuán)及果皮中水楊酸的含量并結(jié)合幼果期、成熟中期、成熟末期的陽春砂果實(shí)的高通量測序表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分析3個(gè)發(fā)育時(shí)期中水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中相關(guān)基因的表達(dá)模式?！窘Y(jié)果】陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中，種子團(tuán)及果皮內(nèi)水楊酸的含量變化一致，且與水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化基本一致，均呈上升趨勢。【結(jié)論】內(nèi)源水楊酸與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因之間存在密切的關(guān)系。推測為種子團(tuán)內(nèi)合成水楊酸后運(yùn)輸至果皮。

關(guān)鍵詞：陽春砂；果實(shí)發(fā)育；水楊酸；轉(zhuǎn)錄因子；病程相關(guān)基因非表達(dá)子1

姜科植物陽春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實(shí)是中藥砂仁的重要來源之一，其氣味芳香而濃烈，味辛涼、微苦，歸脾、胃、腎經(jīng)，能化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎。主要用于濕濁中阻，脘痞不饑，脾胃虛寒，嘔吐泄瀉，妊娠惡阻，胎動(dòng)不安等證［1］。陽春砂富含揮發(fā)油是其氣味濃烈芳香的主要原因。其揮發(fā)油的主要成分包含乙酸龍腦酯、檸檬烯、月桂烯、芳樟醇、β-蒎烯、坎烯等揮發(fā)性萜類。揮發(fā)性萜類化合物作為植物次生代謝產(chǎn)物，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，亦為陽春砂的主要藥用成分［2］。

植物激素（phytohormone）是植物自身合成的一種痕量的信號(hào)分子，通常從合成部位運(yùn)往作用部位，對果實(shí)生長發(fā)育過程起重要的作用。而水楊酸是一種簡單的酚類化合物，被認(rèn)為是一種植物激素和內(nèi)源信號(hào)分子，能調(diào)控植物體內(nèi)的一些重要的代謝過程［3］。據(jù)報(bào)道，在不同品種的蘋果果實(shí)成熟期間種子中水楊酸（salicylic acid，SA）含量明顯高于果肉中的含量。水楊酸是乙烯合成的抑制劑，能夠抑制1 -氨基環(huán)丙烷1 -羧酸（1 -aminocyclopro -panecarboxylic acid，ACC）氧化酶的活性，具有延緩果實(shí)成熟衰老的功能［4］。在蘋果果實(shí)成熟前，種子一直產(chǎn)生低水平的乙烯，到成熟期乙烯開始在子房室內(nèi)積累，濃度逐漸增加，乙烯生成量按種子、果肉、果皮的順序遞增［4］。在不同的蘋果中，均發(fā)現(xiàn)果實(shí)成熟過程中水楊酸水平基本呈先升后降的趨勢。此外，水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也是現(xiàn)今關(guān)注的熱點(diǎn)。水楊酸通過與水楊酸結(jié)合蛋白（salicylic acidbinding-proteins，SABP）結(jié)合形成“SA-SABP”復(fù)合體，將信息傳遞給胞內(nèi)第二信使如H2O2等，信號(hào)通過自我反饋機(jī)制放大后在胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)過敏反應(yīng)［5］，同時(shí)引起胞內(nèi)氧化還原態(tài)改變，激活病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（non-expresser of PR1，NPR1），TGA轉(zhuǎn)錄因子（TGA transcription factor）和WRKY轉(zhuǎn)錄因子（WRKY transcription factor）等的活化與互作［6-7］，最終誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins，PR）基因表達(dá)及系統(tǒng)獲得性抗性的產(chǎn)生。但在植物正常的生長發(fā)育過程中，水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)情況如何？是否與水楊酸的含量變化一致？這些問題暫無相關(guān)記載。高通量測序（RNA-Seq）技術(shù)能有效地揭示生物在轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)變化，可為重要基因的挖掘提供有利的手段［8］。本研究借助高通量測序技術(shù)挖掘水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，并深入了解水楊酸含量變化與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因之間的關(guān)系，分析陽春砂果實(shí)在發(fā)育過程中水楊酸的分子調(diào)控機(jī)制，挖掘調(diào)控陽春砂內(nèi)水楊酸代謝途徑的關(guān)鍵基因，為日后利用基因工程等手段調(diào)控陽春砂水楊酸代謝奠定理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1植物材料陽春砂Amomum villosum Lour.新鮮果實(shí)分別于幼果期（2014年6月6日）及成熟期（2014年8月12日）在廣東省陽春市蟠龍鎮(zhèn)采集，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源科學(xué)與工程研究中心楊錦芬研究員鑒定為陽春砂Amomum villosum Lour.。同一時(shí)期采收的果實(shí)由于發(fā)育程度不同，即同一果穗中不同部位的果實(shí)由于開花先后不同，造成果實(shí)大小差異，因此同一時(shí)期采收的果實(shí)按大小（發(fā)育程度）不同分為6月小果（果實(shí)直徑≤1.0 cm）、6月大果（果實(shí)直徑＞1.0 cm）和8月小果（果實(shí)直徑≤1.5 cm）、8月大果（果實(shí)直徑＞1.5 cm）。采樣時(shí)選擇無裂口、傷痕及蟲蛀的果實(shí)。果實(shí)表面簡單清潔后，液氮速凍，干冰低溫運(yùn)輸，-80℃冷凍保存。

1.2儀器與試劑TSQ Quantum Access液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)，配Surveyor自動(dòng)進(jìn)樣器、Xcalibur 2.0色譜工作站（美國Thermo Fisher公司）；Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm× 2.1 mm，3 μm）；Millipore-Q超純水儀（美國Millipore Corporation）；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。水楊酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院（批號(hào)：100106-201104）；色譜純甲醇、甲酸購于美國TEDIA公司。

1.3水楊酸的測定激素提取參考文獻(xiàn)［9］的方法并加以改進(jìn)，取不同發(fā)育時(shí)期的陽春砂果實(shí)，于液氮下敲開，完全分離果皮與種子團(tuán)，在液氮下研磨至粉末狀。分別精密稱定果皮與種子團(tuán)0.400 g溶于2 mL溶劑（體積比為甲醇∶水∶甲酸=15∶4∶1）中，-20℃冷浸24 h。在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，每份樣品吸取上清液1.8 mL，低溫減壓離心濃縮90 min，濃縮液以色譜級(jí)甲醇定容至1 mL，以0.22 μm的微孔濾膜濾過，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶備用（此操作全程避光），每種樣品制備2次生物重復(fù)，3次儀器重復(fù)。

色譜條件以甲醇為有機(jī)相，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液（調(diào)pH=2.9）為水相；從10%有機(jī)相開始，35 min內(nèi)梯度升到100%，保持5 min，在6 s內(nèi)調(diào)回初始梯度，平衡6 min。柱溫為30℃；流速為0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；樣品盤溫度為4℃。

1.4水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)量分析利用Amomum villosum Lour.幼果期（開花后30 d，6月采集）、成熟中期（開花后60 d，7月采集）、成熟末期（開花后90 d，8月采集）的新鮮果實(shí)進(jìn)行表達(dá)譜分析。幼果期、成熟中期、成熟末期果實(shí)總RNA的提取、cDNA文庫構(gòu)建，進(jìn)行高通量測序數(shù)據(jù)比對委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成。根據(jù)所獲得3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，采用Blastx將Unigene序列比對到公共數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG（E-value＜10-5），得到與給定Unigene具有最高序列相似性的蛋白即為該Unigene的蛋白功能注釋信息。根據(jù)KEGG注釋，得到Unigene的代謝路徑注釋。在表達(dá)譜中，利用唯一比對上基因的reads數(shù)目和比對上參考序列的總reads數(shù)來計(jì)算基因表達(dá)量，基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM法（reads per Kb per million reads）［10］，參照Audic等［11］發(fā)表在Genome research上的基于測序的差異基因檢測方法，篩選2組表達(dá)譜的差異表達(dá)基因。然后，對差異檢驗(yàn)的p-value作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過控制FDR（false discovery rate）來決定p-value的域值。假設(shè)挑選了R個(gè)差異表達(dá)基因，其中S個(gè)是真正有差異表達(dá)的基因，另外V個(gè)是沒有差異表達(dá)的基因，為假陽性結(jié)果，希望假陽性比例Q=V/R不能超過某個(gè)給定的值（如1%），則在統(tǒng)計(jì)時(shí)預(yù)先設(shè)定的FDR不能超過0.01［11］。獲得差異檢驗(yàn)FDR值的同時(shí)，還根據(jù)基因的表達(dá)量（RPKM值）計(jì)算該基因在不同樣本間的差異表達(dá)倍數(shù)，以FDR≤0.001且差異倍數(shù)不低于2的基因定義為兩表達(dá)譜中的差異基因，并對相關(guān)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

利用幼果期、成熟中期、成熟末期陽春砂果實(shí)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，篩選在兩兩樣品比較中顯示差異表達(dá)的水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵基因。對候選基因在各表達(dá)譜中的表達(dá)量（RPKM值）進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析及其表達(dá)譜分析。使用R語言，調(diào)用gplots程序，根據(jù)表達(dá)量建立矩陣，然后歸一化，最后建立相關(guān)基因的系統(tǒng)聚類表達(dá)譜。使用Microsoft excel分析工具對NPR1與TGA的基因在不同發(fā)育時(shí)期陽春砂果實(shí)中的表達(dá)量（RPKM值）進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)用平均數(shù)表示，組內(nèi)及組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVE），以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中水楊酸含量的變化利用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）檢測技術(shù)測定水楊酸的含量變化，結(jié)果如圖1所示。陽春砂果實(shí)由果皮和種子團(tuán)組成，在種子團(tuán)中，從6月小果的0.12 ng/mg FW（fresh weight）增加至8月大果的0.86 ng/mg FW，水楊酸的含量顯著增加6倍以上（P＜0.01）。幼果期（6月）及成熟期（8月）發(fā)育較早的果實(shí)（大果）種子團(tuán)中水楊酸含量顯著高于發(fā)育較晚的果實(shí)（小果）（P＜0.05）。

果皮內(nèi)水楊酸從6月小果的0.56 ng/mg FW勻速增加至8月小果的0.82 ng/mg FW，但8月大果中水楊酸反略微下降至0.79 ng/mg FW，僅比8月小果減少了0.03 ng/mg FW（P＞0.05），故可認(rèn)為果皮內(nèi)水楊酸含量隨著果實(shí)的成熟主要呈上升的趨勢。成熟果實(shí)（8月）的果皮內(nèi)水楊酸含量均比6月多12%以上，增長速率較緩慢。在幼果期（6月）大果果皮水楊酸含量是小果的1.19倍（P＜0.01），揭示了在幼果期發(fā)育至成熟期果皮內(nèi)水楊酸含量發(fā)生了劇烈的變化。

在陽春砂果實(shí)中果皮與種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量并不均一，且兩部位的含量變化呈極強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系（r=0.92），均呈現(xiàn)上升的趨勢，表明內(nèi)源水楊酸在各組織不是均勻分布的。種子團(tuán)中水楊酸含量增加的速率較快，尤其在果實(shí)發(fā)育的初期（從6月至8月）種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量迅速增加，當(dāng)果實(shí)成熟時(shí)增長趨于平緩。而果皮中水楊酸含量增長速率較種子團(tuán)慢。但在幼果期（6月）果皮內(nèi)水楊酸的含量均較種子團(tuán)多4倍以上。果實(shí)發(fā)育至8月時(shí)，果皮及種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量相當(dāng)。

圖1　陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中水楊酸的含量?。?±s，N=2）Figure 1 Contents of SA during the fruit development of A.villosum

2.2陽春砂3個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜中水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析本課題組前期研究已獲得不同發(fā)育時(shí)期的陽春砂轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)［12］，以KEGG數(shù)據(jù)庫作為參考，根據(jù)代謝通路可以將陽春砂轉(zhuǎn)錄組中的21 254個(gè)Unigenes分為270類，其中屬于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Pathway：ko04075）的Unigenes 793個(gè)，占總數(shù)的3.73%，也是所占比例最大的一組。隨后進(jìn)行陽春砂幼果期、成熟中期、成熟末期果實(shí)的表達(dá)譜測序，如圖2所示植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中幼果期與成熟末期果實(shí)的表達(dá)譜相比差異基因一共有167個(gè)，占所注釋的差異基因的3.55%，也是3組兩兩比較的表達(dá)譜中差異基因數(shù)量最多的一組。此外，幼果期與成熟中期的表達(dá)譜相比較，存在154個(gè)差異基因，占所注釋的差異基因的3.55%。成熟中、末期與幼果期表達(dá)譜中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中差異基因較多，表明在幼果期發(fā)育至成熟期，該通路中基因表達(dá)具有較大的差異。

以KEGG數(shù)據(jù)庫作參考，在陽春砂果實(shí)3個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Pathway：ko0407）內(nèi)水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中顯示差異表達(dá)基因分別為NPR1和TGA。Unigene 0051224在陽春砂不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)譜中注釋為NPR1基因，是水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控子。在表達(dá)譜中，TGA也在水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中顯示顯著差異表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子TGA屬于bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，參與植物防御病害及生長發(fā)育過程［13］。在3個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)譜中對應(yīng)的Unigene有7個(gè)之多，分別為TGA1（Unigene 0107072）、TGA2（Unigene0065204、Unigene0062600、Unigene012642、Unigene0070461）及TGA4（Unigene 0107074、Unigene 0117869），其相似度均達(dá)64%以上（見表1）。在3個(gè)發(fā)育時(shí)期陽春砂果實(shí)兩兩比較的表達(dá)譜的差異基因中，水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中NPR1在果實(shí)成熟中、末期與幼果期比較均顯著上調(diào)（見圖3）。而成熟中期與成熟末期的表達(dá)譜差異基因比較，則無差異表達(dá)，反映了NPR1在陽春砂幼果期與成熟期相比表達(dá)量具明顯差異。成熟中期與幼果期比較，5個(gè)TGA的Unigene上調(diào)，1個(gè)下調(diào)。而成熟末期與幼果期比較，也是5個(gè)TGA的Unigene上調(diào)。但成熟末期與成熟中期比較，則僅有2個(gè)TGA的Unigene上調(diào)。在陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中，NPR1、TGA基因數(shù)量上的差異變化從宏觀上初步描繪了水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的差異表達(dá)過程。

圖2　3個(gè)發(fā)育時(shí)期陽春砂果實(shí)表達(dá)譜中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中差異基因統(tǒng)計(jì)圖Figure 2 Charts of the differential genes involved in phytohormone signal transduction at the three development stages of A.villosum

表1　不同發(fā)育時(shí)期陽春砂果實(shí)表達(dá)譜中水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)差異表達(dá)基因信息表Table 1 Information of SA signal transduction pathway genes during the fruit development of A.villosum

2.3TGA、NPR1基因系統(tǒng)聚類表達(dá)譜分析基于樣本間兩兩比較的差異表達(dá)分析，無法反映多樣本間的全局水平變化。故針對多個(gè)連續(xù)型樣本（至少3個(gè)）的特點(diǎn)（樣品間的時(shí)間順序）而對基因的表達(dá)模式進(jìn)行基因系統(tǒng)聚類表達(dá)譜分析（見圖4）。經(jīng)過系統(tǒng)聚類分析，把基因表達(dá)模式相似的分成一組，而相似的基因表達(dá)模式往往其功能也有一定的相關(guān)性。從水楊酸信號(hào)通道的TGA與NPR1基因的系統(tǒng)聚類表達(dá)譜分析，橫坐標(biāo)經(jīng)系統(tǒng)聚類分析把成熟中、末期果實(shí)基因表達(dá)譜聚成一支，表明在陽春砂果發(fā)育過程中，成熟中、末期水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)基因的表達(dá)模式相似。此外，可觀察到陽春砂果實(shí)從幼果期發(fā)育至成熟末期相關(guān)基因的表達(dá)量變化較劇烈。

圖4中把TGA及NPR1的8個(gè)Unigene在陽春砂3個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況系統(tǒng)聚類分成3組。第1組為TGA1（Unigene0107072）在幼果期表達(dá)量較高，而在成熟中期及末期則相對較低。第2組包括2個(gè)TGA4的Unigene（Unigene0117869、Unigene 0107074），在果實(shí)成熟末期中表達(dá)量最高，而幼果期及成熟中期則相對較低。第3組包括1個(gè)NPR1 的Unigene（Unigene0051224）及4個(gè)TGA2 Unigene （Unigene0070461、Unigene0062600、Unigene0065204、Unigene0126425）。其中NPR1（Unigene0051224）與TGA2（Unigene0062600）表達(dá)模式極度相似，其他的TGA2（Unigene0070461、Unigene0065204、Unigene 0126425）則聚為一支。第3組TGA2與NPR1基因表達(dá)模式一致，主要在果實(shí)成熟中期基因表達(dá)量最高，成熟末期次之，幼果期則相對最低。此外，利用Pearson相關(guān)系數(shù)計(jì)算NPR1（Unigene 0051224）與TGA2（Unigene0070461、Unigene0065204、Unigene0062600、Unigene0126425）的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)度極強(qiáng)（r≥0.89）（見表2）。NPRl作為增強(qiáng)子能增強(qiáng)TGA2對PR啟動(dòng)子的結(jié)合并誘導(dǎo)PR基因表達(dá)［14］，本研究進(jìn)一步證實(shí)了TGA2與NPR1具有較強(qiáng)的相關(guān)性，兩者共同調(diào)控同一生理功能。NPR1與TGA4（Unigene0117869、Unigene0107074）相關(guān)性較低（r≤0.47），而與TGA1（Unigene0107072）則呈極強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.96）。TGA1和TGA4在細(xì)胞內(nèi)有類似NPR1的單體—寡聚體的變化。自然狀態(tài)下，TGA1、TGA4在2個(gè)保守的半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵，不與NPR1相結(jié)合［13］。因此，NPR1與TGA4相關(guān)性極低，與TGA1呈負(fù)相關(guān)。TGA1與TGA2也具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r≤-0.71），可推測TGA1與TGA2功能相關(guān)但具有時(shí)效性，一者啟動(dòng)后，另一者則關(guān)閉。由此可知，NPR1與TGA2、TGA1關(guān)系密切?？偠灾?，NPR1、TGA是陽春砂果實(shí)的水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中下游的重要關(guān)鍵基因，在陽春砂幼果期表達(dá)量較低，而在果實(shí)成熟中、末期時(shí)基因表達(dá)相對活躍。這與2.1項(xiàng)關(guān)于陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中SA的含量變化情況基本一致。

圖4　TGA與NPR1基因的系統(tǒng)聚類表達(dá)譜Figure 4 Hierarchical clusters of TGA and NPR1 expression profile

表2　NPR1與TGA之間表達(dá)量的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficients between NPR1 and TGA expression levels

3　討論

目前水楊酸調(diào)控果實(shí)成熟衰老的研究尚處于起步階段。本研究發(fā)現(xiàn)陽春砂內(nèi)水楊酸總體水平較高，與Silverman等［15］報(bào)道的水稻內(nèi)水楊酸含量也較高相一致。由于陽春砂與水稻均為單子葉植物，因此兩者的水楊酸代謝模式較為相似。本研究發(fā)現(xiàn)陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中內(nèi)源水楊酸的含量總體呈上升趨勢，與鄢洪海等［16］報(bào)道的隨著花生生育期發(fā)展，其葉片及根內(nèi)的水楊酸含量也相應(yīng)地增加一致。再者，陽春砂是蒴果，果皮薄且硬，質(zhì)輕脆，內(nèi)含多數(shù)種子，種子團(tuán)質(zhì)硬。隨著陽春砂果實(shí)的發(fā)育，其果實(shí)的硬度也增加，水楊酸含量不斷增加，這與張玉等［17］報(bào)道的獼猴桃果實(shí)中水楊酸含量變化與果實(shí)后熟硬度呈極顯著的正相關(guān)（r=0.906 7）相一致。

陽春砂果實(shí)成熟時(shí)，種子團(tuán)水楊酸含量較果皮高，這與卓鷹［18］報(bào)道的在成熟期種子中水楊酸含量明顯高于果肉中的含量相一致。陽春砂從幼果（6月）發(fā)育至成熟果實(shí)（8月）的過程中果皮內(nèi)水楊酸含量一直較高，這可能與果皮的保護(hù)功能有關(guān)，由于陽春砂果皮比一般果實(shí)的果皮堅(jiān)硬，所以其果皮內(nèi)水楊酸也保持相對較高的水平。陽春砂的果皮與種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量的變化基本一致，均呈上升趨勢。而陽春砂幼果（6月）果皮內(nèi)水楊酸比種子團(tuán)多4倍以上，當(dāng)果實(shí)發(fā)育至成熟（8月）時(shí)，果皮與種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量相當(dāng)，這揭示了陽春砂果實(shí)內(nèi)水楊酸含量具有明顯的部位差異性。果實(shí)是一個(gè)營養(yǎng)儲(chǔ)存庫，種子作為激素源產(chǎn)生水楊酸并運(yùn)輸至果皮，并在果皮累積，因此在幼果期果皮內(nèi)水楊酸比種子團(tuán)多4倍以上。當(dāng)果皮內(nèi)水楊酸積累達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)，種子團(tuán)運(yùn)輸至果皮的水楊酸含量逐漸減少，為滿足種子自身的生長發(fā)育需要，也逐漸在種子團(tuán)積累水楊酸，隨著果實(shí)成熟（8月），種子團(tuán)內(nèi)水楊酸含量也漸漸趨于飽和，此時(shí)與果皮內(nèi)水楊酸水平相當(dāng)。本研究為深入地了解陽春砂激素合成及運(yùn)輸途徑、作用途徑提供了參考。

另一方面，水楊酸是啟動(dòng)水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的重要信號(hào)分子。在擬南芥和煙草中，水楊酸含量的提高以及病程相關(guān)蛋白基因（pathogenesis-related proteins，PR）的表達(dá)升高是植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性的重要指標(biāo)。當(dāng)植物受到病原菌侵染或受其他刺激后引發(fā)植物體內(nèi)一系列信號(hào)響應(yīng)，植物體內(nèi)水楊酸含量提高，病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（NPRI）蛋白由多聚體變?yōu)閱误w，從胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核當(dāng)中，與TGAs結(jié)合調(diào)節(jié)下游PR基因的表達(dá)，提高植物的抗病性［19］。Alvarez等［20］用水楊酸處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥的病程相關(guān)基因非表達(dá)子1基因（AtNPR1）的表達(dá)量較未處理前增加2～3倍，水楊酸的積累可激活NPR1與TGA的互作，從而引起下游抗病基因的表達(dá)。而李博勛等［21］也發(fā)現(xiàn)水楊酸能誘導(dǎo)橡膠樹的病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（HbNPR1）基因的表達(dá)，在處理24 h時(shí)表達(dá)豐度最高。高麗娟等［22］發(fā)現(xiàn)水楊酸處理后梨葉片中內(nèi)源水楊酸含量升高，其中游離態(tài)水楊酸含量隨處理濃度增大而逐漸升高，但均顯著低于對照；結(jié)合態(tài)水楊酸隨處理增大而逐漸降低，但均顯著高于對照。經(jīng)0.200 mmol/L水楊酸誘導(dǎo)后梨葉片中NPR1表達(dá)量明顯升高，但NPR1在莖中的表達(dá)卻受到抑制，與本研究的結(jié)果基本一致，本研究中水楊酸的增加同樣也能誘導(dǎo)NPR1活躍表達(dá)。而TGA成員主要通過直接結(jié)合和間接結(jié)合2種方式與NPR1互作，從而調(diào)控PR基因表達(dá)和抗性產(chǎn)生。當(dāng)沒有誘導(dǎo)因子處理時(shí)，TGA2能夠抑制水楊酸抗病信號(hào)傳遞。采用誘導(dǎo)因子處理植物時(shí)候，水楊酸含量上升，導(dǎo)致NPR1單體化，并進(jìn)入細(xì)胞核與TGA2直接作用，解除TGA2對抗病信號(hào)傳遞的抑制作用，正向調(diào)控PR基因表達(dá)和抗性的產(chǎn)生［13，23-24］。與本研究結(jié)果中TGA2與NPR1具有極強(qiáng)的相關(guān)性（r≥0.89）高度一致。NPR1與自然狀態(tài)下TGA1、TGA4不結(jié)合［23］，這與本研究結(jié)果也相對一致。由此可推測在陽春砂果實(shí)發(fā)育過程，水楊酸含量逐漸增加，隨著內(nèi)源水楊酸含量的增加能逐漸調(diào)控NPR1的表達(dá)量增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)TGA2的表達(dá)量增加，為植物產(chǎn)生抗逆奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示：陽春砂正常發(fā)育的表達(dá)譜中TGA1、TGA2、TGA4及NPR1基因呈現(xiàn)低峰度表達(dá)。與本課題組其他成員所完成的茉莉酸甲酯（methyjasmonate，MeJA）誘導(dǎo)陽春砂的表達(dá)譜數(shù)據(jù)中水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的差異基因比較，差異表達(dá)基因數(shù)量相對較少，且表達(dá)量較低（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。此外，從MeJA誘導(dǎo)后的陽春砂表達(dá)譜數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)PR-1 Unigenes呈現(xiàn)差異表達(dá)［25］，在本研究中PR-1卻并無差異表達(dá)。在水楊酸含量方面，正常發(fā)育的陽春砂果實(shí)內(nèi)水楊酸含量較受MeJA誘導(dǎo)后的果實(shí)低（數(shù)據(jù)待發(fā)表），與最佳防御假說相符［26］。根據(jù)最佳防御假說，本研究中植物正常發(fā)育的TGA、NPR1等多處于低峰度水平，PR-1無差異表達(dá)是為了避免冗余的防御。同時(shí)，在果實(shí)發(fā)育過程中，TGA、NPR1的低豐度表達(dá)能為植物系統(tǒng)抗逆性獲得奠定基礎(chǔ)。內(nèi)源水楊酸的含量能促進(jìn)水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)，在果實(shí)正常發(fā)育過程中植物防御能力增強(qiáng)，但并未產(chǎn)生植物抗逆反應(yīng)。但當(dāng)植物受到誘導(dǎo)劑（MeJA）誘導(dǎo)或其他刺激后，在轉(zhuǎn)錄水平上反映SAR的指標(biāo)TGA、NPR1的表達(dá)水平較高，提示植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。

本研究結(jié)合水楊酸代謝途徑中相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TGA、NPR1的轉(zhuǎn)錄水平與水楊酸代謝水平，為構(gòu)建水楊酸從轉(zhuǎn)錄水平到代謝水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供線索。在陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中水楊酸作為信號(hào)分子從轉(zhuǎn)錄水平至代謝水平調(diào)控均具有一致性，為深入研究陽春砂果實(shí)發(fā)育過程中內(nèi)源激素的含量與其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的關(guān)系提供了研究思路，也為今后更全面探討陽春砂其他激素的調(diào)控機(jī)制，挖掘調(diào)控陽春砂水楊酸代謝途徑的關(guān)鍵基因奠定基礎(chǔ)。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Changes of Salicylic Acid Content and Expression of Salicylic Acid Signal Transduction Pathway Genes During Fruit Development of Amomum villosum Lour.

HE Xueying1，2，YANG Jinfen1，2，ZHANG Minling1，2，ZHONG Zhimin3，YU Anmin4，XU Hui1，2，ZHAN Ruoting1，2，CHEN Weiwen1，2
（1.Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；2.Ministry of Education Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；3.School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China；4.Key Laboratory of Economic Plants and Biotechnology，Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650201 Yunnan，China）

Abstract：Objective To analyze the relationship between the content of endogenous salicylic acid（SA）and the expression of the key SA signal transduction pathway genes during fruit development of Amomum villosum Lour..Methods Using the fruits of Amomum villosum Lour.collected in June and August as the experimental materials，we adopted the liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method to determine the contents of SA from the seeds and peels of A.villosum.Based on the high-throughput sequencing data of A.villosum fruits at young fruit stage and middle- and late-maturation stage，we analyzed the expression of SA signal transduction pathway genes at different fruit development stages.Results The changes of SA content in seeds of A.villosum were similar to those of the peels during the fruits development of A.villosum，and were also similar to those of the expression of SA signal transduction pathway genes，showing an upward trend.Conclusion There is a close relationship between the contents of endogenous SA and the expression levels of signal transduction pathway genes，which suggested that SA was biosynthesized in the seeds and transported to the peels of the A.villosum.

Key words：Amomum villosum Lour.；fruit development；salicylic acid；transcription factor；non-expresser of pathogenesis-related genes 1

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0404 - 07

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．027

收稿日期：2015-12-07

作者簡介：何雪瑩（1989-），女，碩士研究生；E- mail：893997154@qq.com

通訊作者：楊錦芬（1978-），女，研究員；E- mail：yangjf@gzucm.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81303163）；廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：Yq2013042）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)青年英才培養(yǎng)項(xiàng)目（編號(hào)：AAC414124A08）