郭殷銳，蘇雪芬，張廣唱，王劍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州　510006）

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正交試驗(yàn)法優(yōu)選吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的閃式提取工藝

郭殷銳，蘇雪芬，張廣唱，王劍

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】?jī)?yōu)選吳茱萸藥材最佳閃式提取工藝。【方法】采用閃式提取技術(shù)，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿的得率為指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定。選擇乙醇濃度、提取時(shí)間和提取電壓為考察因素，選用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選吳茱萸藥材最佳閃式提取工藝?！窘Y(jié)果】吳茱萸藥材的最佳閃提工藝條件為提取電壓40 V，提取時(shí)間3 min，乙醇濃度體積分?jǐn)?shù)75%和料液比1∶20?！窘Y(jié)論】閃式提取吳茱萸藥材效率高、時(shí)間短，可成為提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿的方法。

關(guān)鍵詞：吳茱萸/化學(xué)；吳茱萸堿/分析；吳茱萸次堿/分析；閃式提??；正交試驗(yàn)；色譜法，高壓液相

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.），具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉之功效，臨床常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣、經(jīng)行腹痛、脘腹脹痛、嘔吐吞酸、五更泄瀉等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)心、保護(hù)心臟、抗心律失常、降壓、抗血栓、抗腫瘤、抗過(guò)敏和抗炎鎮(zhèn)痛等作用［1］。吳茱萸堿（evodiamine，EVO）和吳茱萸次堿（rutaecarpine，RUT）是其主要的有效活性成分，研究［2-3］表明EVO和RUT有良好的強(qiáng)心、降壓、抗炎、鎮(zhèn)痛功效。閃式提取法也稱為閃提法，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新提取方法，它依據(jù)組織破碎提取的原理，利用適當(dāng)溶劑在閃式提取器里將物料快速破碎至適當(dāng)粒度，同時(shí)通過(guò)高速攪拌、超強(qiáng)振動(dòng)、負(fù)壓滲濾等功能來(lái)達(dá)到提取目的。由于一次提取一般在數(shù)秒至幾分鐘之內(nèi)即可完成，其提取速度為傳統(tǒng)方法的百倍以上，因此被稱之為閃式提?。?］。本研究采用閃提法提取吳茱萸，并以正交試驗(yàn)法優(yōu)選，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器AUI220分析天平（廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本，島津公司）；QYYS-20A超純水機(jī)（重慶前沿水處理設(shè)備有限公司）；JHBE-50閃式提取器（鄭州眾德實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司）；KQ-500VDE臺(tái)式三頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BQ-MW3H實(shí)驗(yàn)微波萃取儀（杭州耀博生物科技有限公司）

1.2試藥乙醇（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150212）；乙腈（色譜純，Dikma，批號(hào)：608001003）；四氫呋喃（天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20150206）；冰醋酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140908）；吳茱萸（廣州南北行中藥飲片有限公司，批號(hào)：20150306G352，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)王劍教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸）。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）；以乙腈—水—四氫呋喃—冰醋酸（體積比41∶59∶1∶0.2）為流動(dòng)相，流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量：10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm。在此條件下，測(cè)得吳茱萸堿峰的保留時(shí)間約16.7 min（1號(hào)峰），吳茱萸次堿峰的保留時(shí)間約為19.5 min（2號(hào)峰）。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取吳茱萸堿0.75 mg、吳茱萸次堿0.50 mg，加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇定容至10 mL，搖均，超聲30 min，0.45 μm微孔濾膜法濾過(guò)即得質(zhì)量濃度吳茱萸堿為75 μg/mL和吳茱萸次堿為50 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取吳茱萸藥材約50.0 g，加20倍量乙醇，閃提3 min，濾過(guò)，倒置1 000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，吸取2 mL用以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得供試品溶液。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密稱定吳茱萸堿（75 μg/mL）和吳茱萸次堿（50 μg/mL）混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量依次為10、20、30、40、50 μL，按上述色譜條件分別測(cè)定，記錄色譜峰，以峰面積Y對(duì)含量X進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得吳茱萸堿的線性回歸方程為：Y = 7309.873X+418542.000，r = 0.999，線性范圍為：0.75～3.75 μg；吳茱萸次堿的線性回歸方程為：Y= 4572.071X-67912.700，r = 0.991，線性范圍為：0.5～2.5 μg。

2.5方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1精密度試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件，取吳茱萸堿和吳茱萸次堿混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（sR）分別為0.19%、0.32%。

2.5.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件，取同一供試樣品溶液，分別于制備后0、3、6、9、12 h進(jìn)樣，計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的sR分別為0.46%和0.25%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下色譜條件，取吳茱萸粉末6份，每份50.0 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的峰面積值，計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的質(zhì)量濃度的sR分別為0.31%和0.39%。

2.6加樣回收率試驗(yàn)精密吸取已測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量的供試液6份，各1 mL，分別準(zhǔn)確加入1 mL吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液（吳茱萸堿濃度75 μg/mL，吳茱萸次堿濃度50 μg/mL），重復(fù)3次，按照2.1項(xiàng)下色譜條件方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的平均回收率分別為97.2%和98.6%。sR分別為0.45%和0.58%。

2.7樣品測(cè)定精密稱取吳茱萸藥材粉末50.0 g，投入閃式提取器的容器中，然后加入20倍乙醇，按L9（34）正交試驗(yàn)表安排試驗(yàn)，提取完后真空抽濾，倒置1000 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣10 μL測(cè)定，并以外標(biāo)法計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量。吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品混合溶液與供試品溶液的HPLC圖譜見(jiàn)圖1。

圖1　對(duì)照品混合溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC圖譜Figure 1 HPLC result for mixed solution reference（A）and Fructus Evodiae samples（B）

2.8吳茱萸閃提提取工藝考察

2.8.1提取時(shí)間考察精密稱取吳茱萸藥材50.0 g，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，提取電壓40 V，按提取時(shí)間分別為30 s、1 min、2 min、4 min、6 min提取后抽濾，以相應(yīng)溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按2.7項(xiàng)下方法測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結(jié)果提取時(shí)間為2 min時(shí)提取率較高。

2.8.2提取電壓考察精密稱取吳茱萸藥材50.0 g，以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，分別以20、40、60、80、100 V為提取電壓，提取時(shí)間為1 min，提取后抽濾，以相應(yīng)溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按2.7項(xiàng)下方法測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結(jié)果提取電壓為40 V時(shí)提取率較高。

2.8.3乙醇濃度考察精密稱取吳茱萸藥材粉50.0 g，分別以體積分?jǐn)?shù)20%、40%、60%、75%、95%乙醇為提取溶媒，溶媒用量為20倍，提取電壓為40 V，提取時(shí)間為1 min，提取后抽濾，以相應(yīng)溶媒定容于1 000 mL量瓶中，精密吸取藥液1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，按2.7項(xiàng)下方法測(cè)定吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，結(jié)果乙醇濃度為95%的提取率較高。

2.9正交試驗(yàn)選取提取時(shí)間、提取電壓、乙醇濃度3個(gè)因素，吳茱萸藥材用量每組50.0 g，料液比為1∶20，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)2.8項(xiàng)考察結(jié)果設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：影響吳茱萸堿和吳茱萸次堿總得率的因素依次為A＞C＞B，以D因素為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，影響因素A（提取時(shí)間）是影響吳茱萸閃提工藝的主要因素，C因素（乙醇濃度）為次要因素，B因素（提取電壓）影響不顯著，結(jié)合直觀分析結(jié)果，確定正交試驗(yàn)優(yōu)選制備工藝為A3B2C1，即提取電壓40 V，提取時(shí)間3 min，乙醇濃度為體積分?jǐn)?shù)75%和料液比1∶20。

2.10最佳工藝條件驗(yàn)證以優(yōu)選的工藝條件制備3批樣品，測(cè)定其吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表1　因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

3　討論

閃式提取器根據(jù)組織破碎原理而設(shè)計(jì)，其核心部分是破碎刀具和動(dòng)力部分，通過(guò)內(nèi)外刀刃間歇控制破碎粒度，外刃固定，內(nèi)刃在高速電機(jī)帶動(dòng)下旋轉(zhuǎn)，對(duì)中藥材產(chǎn)生破碎作用。因其提取速度極快，因此稱為閃式提取。傳統(tǒng)的溶劑提取法，如煎煮法、回流法、浸漬法等，大多以熱為推動(dòng)力，或依靠濃度差將有效成分提出，存在能耗高、周期長(zhǎng)、工序多、收率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大，高溫破壞熱敏性成分等不足。隨著工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，傳統(tǒng)提取技術(shù)的種種缺陷，越來(lái)越制約了人們對(duì)中藥資源的開(kāi)發(fā)利用。閃式提取具有提取溫度低、速度快、操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，對(duì)提取熱敏性物質(zhì)更具有優(yōu)勢(shì)，在中藥提取和天然化學(xué)成分研究等方面具有廣泛的應(yīng)用前景，將為中藥研究開(kāi)辟一個(gè)新的途徑。閃式提取不僅適用于不同質(zhì)地的動(dòng)植物材料，還可有效地應(yīng)用于不同類(lèi)型的化學(xué)物質(zhì)。目前已經(jīng)應(yīng)用且已取得成功經(jīng)驗(yàn)的有鞣質(zhì)類(lèi)、多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)等生物活性成分。中藥在臨床上大多是以復(fù)方的形式應(yīng)用，閃式提取所具有高效、快速、節(jié)能、環(huán)保的特點(diǎn)，將為中藥復(fù)方的提取工藝研究帶來(lái)極大的便利，但將其應(yīng)用于中藥方劑的提取僅剛剛開(kāi)始，創(chuàng)新研究的空間和前景很大［5-8］。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果與直觀分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal test?。∟=3）

本研究結(jié)果表明：閃式提取吳茱萸藥材在提取電壓40 V，提取時(shí)間3 min，乙醇濃度體積分?jǐn)?shù)75%和料液比1∶20的條件下，吳茱萸堿的得率為16.1 mg/g，吳茱萸次堿的得率為7.5 mg/g。另取同批藥材等量，依據(jù)婁方明等［8］記載的最佳微波提取條件進(jìn)行提取，所得吳茱萸堿得率為8.22 mg/g，吳茱萸次堿得率為4.81 mg/g；依據(jù)甄攀等［9］采用超聲提取的最佳條件進(jìn)行提取，所用溶劑改為體積分?jǐn)?shù)75%乙醇而不使用乙酸乙酯，所得吳茱萸堿得率為6.43 mg/g，吳茱萸次堿得率為3.33 mg/g。閃式提取可以省卻藥材干燥和粉粹的步驟，對(duì)于一些難以干燥以及質(zhì)地稍軟的中藥材有特殊的優(yōu)勢(shì)，且提取效率和時(shí)間都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法。綜上所述，閃式提取為吳茱萸藥材的較佳提取方法。

從本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間是影響閃式提取吳茱萸堿和吳茱萸次堿得率最顯著的因素，主要是因?yàn)楫?dāng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，藥材被打成較細(xì)的粉，藥粉越細(xì)可能就越容易與藥效成分發(fā)生物理吸附作用，影響有效成分的釋放，所以閃式提取要掌握好最佳的提取時(shí)間。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

·基礎(chǔ)研究·

Optimization of Flash Extraction Process for Evodiamine and Rutaecarpine from Fructus Evodiae by Orthogonal Test

GUO Yinrui，SU Xuefen，ZHANG Guangchang，WANG Jian
（Basic Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To optimize the flash extraction process for evodiamine and rutaecarpine isolated from Fructus Evodiae.Methods We used the flash extraction process to extract evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae，and performed high performance liquid chromatography（HPLC）with their yields as the observation indexes.Selecting ethanol concentration，extraction time and extraction voltage as the examination factors，we adopted L9（34）orthogonal test to screen the optimum flash extraction process.Results The optimum flash extraction process conditions were as follows：extracting voltage at 40 V，extracting for 3 min，ethanol at the volume fraction of 75%，and solid to liquid ratio being 1∶20.Conclusion The flash extraction process for Fructus Evodiae medicinal materials has the advantage of higher yield and shorter time，and can be used for extracting evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae .

Key words：Fructus Evodiae/chemistry；evodiamine/analysis；rutaecarpine/analysis；flash extraction；orthogonal test；chromatography，high performance liquid

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0380 - 04

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．023

收稿日期：2015-11-07

作者簡(jiǎn)介：郭殷銳（1988-），男，在讀碩士研究生；E-mail：75706868@qq.com

通訊作者：王劍，男，博士，碩士研究生導(dǎo)師；E-mail：zswj@gzucm.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81173150）