賴日明，朱原，鄭麗嫻，張繼平

（1.廣州市增城區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州　510000；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州　510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東佛山　528000）

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補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠GSK3β mRNA的影響

賴日明1，朱原2，鄭麗嫻2，張繼平3

（1.廣州市增城區(qū)中醫(yī)院，廣東廣州510000；2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)附屬佛山醫(yī)院，廣東佛山528000）

摘要：【目的】探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）mRNA表達(dá)與CD63的影響?！痉椒ā繉PF級(jí)雄性SD大鼠60只隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，氫氯吡格雷組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、低劑量組，每組12只。氫氯吡格雷組灌胃給予氫氯吡格雷水溶液6.8 mg·kg-1·d-1，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、低劑量組分別給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯水溶液26、6.5 g·kg-1·d-1，其余各組給予生理鹽水；連續(xù)給藥14 d后，采用右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法復(fù)制大鼠急性局灶性腦缺血再灌注模型；測(cè)定各組大鼠血漿CD63含量與海馬組織GSK3β mRNA表達(dá)情況。【結(jié)果】與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積顯著增加（P< 0.05），與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與氫氯吡格雷組均能顯著減少腦梗死體積（P<0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織GSK3β mRNA表達(dá)與血漿中CD63表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、低劑量組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制海馬組織GSK3β mRNA表達(dá)與血漿中CD63表達(dá)（P＜0.05），而補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組抑制作用更明顯?！窘Y(jié)論】補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用可能與下調(diào)GSK3β mRNA過(guò)表達(dá)及抑制CD63表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)陽(yáng)還五湯/藥理學(xué)；腦缺血/中藥療法；基因表達(dá)調(diào)控；血小板活化；GSK3β mRNA；CD63；疾病模型，動(dòng)物；大鼠

糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的絲/蘇氨酸磷酸激酶，在細(xì)胞增殖分化、凋亡、炎癥及血小板活化過(guò)程中具有重要作用［1］。有研究［4-6］證實(shí)，GSK3β在缺血性腦血管疾病、血小板活化進(jìn)程中亦具有重要作用［2-3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抗血小板與抗腦缺血等多重作用。本研究通過(guò)復(fù)制急性局灶性腦缺血模型，在檢測(cè)大鼠海馬組織中GSK3β mRNA表達(dá)的同時(shí)，測(cè)定大鼠血漿中血小板活化特異性指標(biāo)CD63含量的變化，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯預(yù)處理對(duì)腦梗死體積、GSK3β mRNA及CD63的影響，探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路及血小板活化的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施由廣東藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)為：SYXK（粵）2012-0125。

1.2藥物與制劑補(bǔ)陽(yáng)還五湯顆粒劑水溶液按照《醫(yī)林改錯(cuò)》所載的藥味用量進(jìn)行制備。處方為：生黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，地龍、桃仁、紅花、川芎各3 g（黃芪顆粒劑，批號(hào)：311001T；當(dāng)歸顆粒劑，批號(hào)：1307117；赤芍顆粒劑，批號(hào)：309081T；地龍顆粒劑，批號(hào)：1308206；川芎顆粒劑，批號(hào)：1308137；桃仁顆粒劑，批號(hào)：309127T；紅花顆粒劑，批號(hào)：1307190），取相當(dāng)于飲片等量的各味藥顆粒劑（由廣東一方制藥有限公司提供）混合后，用100℃蒸餾水配制成補(bǔ)陽(yáng)還五湯水溶液置于4℃冰箱冷藏備用，用前混勻；硫酸氫氯吡格雷片（賽諾菲制藥有限公司，批號(hào)：2A782）。

1.3儀器與試劑LAUDA Aqualine恒溫水浴箱（德國(guó)Lauda公司）；ABI 7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Hema9600型基因擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；1524R型低溫冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；JS-power300電泳儀與培清JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）；K2800紫外核酸分析儀（北京凱奧科技有限公司）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：10296 -010）；三甲基十六烷基溴化銨（CTAB）（美國(guó)BBI公司，批號(hào)：CB0108）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：472565）；瓊脂糖（美國(guó)Hydragene公司，批號(hào)：R9012TAB）；CD63試劑盒（華美生物公司，批號(hào)：CSB -E14117r）；SYBRPremix Ex TaqTM日本TAKARA公司，批號(hào)：DRR420A），Reverse Transcriptase莫洛尼氏鼠白血病毒（M-MLV）試劑盒（日本TAKARA公司，批號(hào)：D2639A）；其余所需試劑由廣州化學(xué)制劑總廠提供。

1.4動(dòng)物分組使用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成5組，每組12只。即假手術(shù)組，模型組（均生理鹽水灌胃），氫氯吡格雷組（劑量為6.8 mg·kg-1·d-1），補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組、低劑量組（中藥高、低劑量組；劑量分別為26，6.5 g·kg-1·d-1），以上各組所用劑量均參照課題組前期實(shí)驗(yàn)［4］，即參照動(dòng)物與人體等效換算標(biāo)準(zhǔn)換算；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，再給予相應(yīng)的藥物（即高劑量組以2.6 g/mL，低劑量以0.65 g/mL補(bǔ)陽(yáng)還五湯水溶液灌胃，氫氯吡格雷組以0.68 mg/mL氫氯吡格雷水溶液灌胃，其他組按100 g/mL生理鹽水灌胃給藥），每天2次，連續(xù)2周。

1.5局灶性腦缺血再灌注模型制作大鼠造模參照Longa［7］報(bào)道的方法，采用大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈線栓法（MCAO）復(fù)制局灶性腦缺血模型。大鼠以100 mg/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)操作臺(tái)上，消毒后其余步驟參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。假性手術(shù)組用僅作皮膚切開(kāi)和血管剝離，不做栓線處理，其余操作同其他組。

1.6觀察指標(biāo)

1.6.1紅四氮唑（TTC）染色測(cè)腦梗死體積每組取4只大鼠，以100 mg/L水合氯醛麻醉后，斷頭取大腦，置于-20℃冷凍20 min后，將腦組織切成2 mm薄的腦片放入20 g/L TTC溶液，37℃水浴鍋溫孵30 min后放入體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液，15 min后取出腦組織；數(shù)碼相機(jī)對(duì)腦片進(jìn)行照相后，采用Image-Pro軟件計(jì)算腦梗死體積（即梗死面積乘以腦片厚度）。

1.6.2酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿CD63含量眼球摘除取血約2 mL置于真空肝素鈉抗凝管中，4℃、3 000 r/min，離心30 min，吸取血漿，放置于-20℃冰箱，備測(cè)。采用酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)大鼠血漿CD63的含量；操作過(guò)程均嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）測(cè)定海馬組織GSK3β mRNA表達(dá)大鼠經(jīng)100 mg/L水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg），生理鹽水灌洗，以40 g/L多聚甲醛固定后迅速取腦組織，分離海馬，用RNA later溶液預(yù)處理海馬組織。Trizol法進(jìn)行總RNA提取海馬組織總RNA，引物設(shè)計(jì)與合成由廣州貝奧吉因生物科技有限公司完成，GSK3β上游引物序列：5’-GGACAGTGGTGTGGAT CAGT-3’，GSK3β下游引物序列：5’-CCGAAAGA CCTTCGTCCAA-3’；GADPH內(nèi)參上游引物序列：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’；GADPH內(nèi)參下游引物序列：5’-TGATGGCAACAA TGTCCACT-3’。使用RNase-free的DNaseⅠ配置反應(yīng)液，37℃消化30 min，65℃滅活10 min RNA去除基因組，檢測(cè)純度提示：28S、18S電泳條帶邊緣清晰，5S條帶邊緣欠清晰，28S與18S條帶比值介于1.8～2.0之間，說(shuō)明RNA未降解（見(jiàn)圖1）。反轉(zhuǎn)錄：在PCR管中加入模板RNA、引物混合物，70℃保溫10 min后迅速在冰上冷卻2 min，按說(shuō)明書(shū)在該管中加入相應(yīng)試劑后42℃保溫60 min；72℃保溫15 min；-20℃保存?zhèn)溆?。定量：cDNA稀釋3倍，使用7500 software 95℃、30 s；95℃、3 s，60℃、34 s收集熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線（見(jiàn)圖2、圖3），由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算出反應(yīng)體系中待測(cè)樣本cDNA達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)（cycle count，Ct）。實(shí)驗(yàn)中各個(gè)樣本均做2個(gè)復(fù)孔。以假手術(shù)組做對(duì)照，使用2-△△Ct值計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)情況。

圖1　RNA電泳圖Figure 1 RNA electrophoresis results

圖2　PCR擴(kuò)增曲線Figure 2 Amplification plot of GSK3β and GADPH

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-T檢驗(yàn)；等級(jí)資料比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3　PCR熔解曲線Figure 3 Melting curve of GSK3β and GADPH

2　結(jié)果

2.1各組對(duì)腦梗死體積的影響表1結(jié)果顯示：模型組大鼠腦梗死體積較假手術(shù)組顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著減少腦梗死體積（P＜0.05），其中以中藥高劑量組效果更好。

2.2各組對(duì)血漿CD63含量的影響表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組血漿中CD63表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著抑制血漿中CD63表達(dá)（P＜0.05），表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著抑制血小板活化，其效果與氫氯吡格雷比較無(wú)顯著性差異。

表1　各組對(duì)腦梗死體積、CD63的影響Table 1 Comparison of infarction volume and CD63 expression in various groups?。ā纒）

表1　各組對(duì)腦梗死體積、CD63的影響Table 1 Comparison of infarction volume and CD63 expression in various groups?。ā纒）

①P<0.05，與假手術(shù)組比較；②P<0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組氫氯吡格雷組中藥低劑量組中藥高劑量組N 12 12 12 12 12 V腦梗死/mm30 258.96±14.80①184.97±10.50②214.49±9.86②173.93±15.81②ρCD63/（ng·mL-1）0.736±0.197 1.448±0.752①0.821±0.151②1.038±0.156②0.916±0.123②

2.3各組對(duì)海馬組織中GSK3β mRNA表達(dá)的影響表2結(jié)果顯示：模型組GSK3β mRNA表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥組與氫氯吡格雷組均能顯著下調(diào)GSK3β mRNA的病理性過(guò)表達(dá)（P＜0.05），其中以中藥高劑量組調(diào)節(jié)作用明顯。

表2　各組對(duì)海馬組織中GSK3β mRNA表達(dá)的影響Table 2 Comparison of GSK3β mRNA expression in various groups?。ā纒，n2-△△Ct）

表2　各組對(duì)海馬組織中GSK3β mRNA表達(dá)的影響Table 2 Comparison of GSK3β mRNA expression in various groups　（±s，n2-△△Ct）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組氫氯吡格雷組中藥低劑量組中藥高劑量組N 12 12 12 12 12 GSK3β mRNA 1.027±0.286 6.689±1.113①3.746±0.599②3.378±0.629②1.810±0.457②

3　討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，在血栓性疾病防治中應(yīng)用廣泛。前期研究［4-6］發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有改善血液流變、抗血栓、抗腦缺血及再灌注損傷等作用，并認(rèn)為其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)蛋白激酶B （Akt）信號(hào)通路有關(guān)；此外，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯預(yù)處理能顯著改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，并下調(diào)人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN基因）過(guò)表達(dá)及抑制CD62P的表達(dá)，認(rèn)為補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與下調(diào)PTEN基因過(guò)表達(dá)與抑制CD62P表達(dá)有關(guān)［9］；而Chen［10］關(guān)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血小鼠的多重蛋白組學(xué)作用的分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能抑制GSK與Tau蛋白活性，但其對(duì)GSK3β的影響仍待進(jìn)一步闡明。GSK3β是一種絲/蘇氨酸磷酸激酶，不僅可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt信號(hào)細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子-κB（NF-κB）、toll樣受體（TLR）參與炎癥反應(yīng)［1，11］；本研究結(jié)果顯示：補(bǔ)陽(yáng)還五湯能下調(diào)海馬組織中GSK3β mRNA的病理性過(guò)表達(dá)，認(rèn)為其可能通過(guò)下調(diào)GSK3β表達(dá)干預(yù)不同信號(hào)通路進(jìn)而起到抗凋亡、抗炎、抗腦缺血的作用。

此外，GSK3β在血小板活化進(jìn)程中亦有重要作用，多項(xiàng)研究表明：GSK3β可調(diào)節(jié)血小板活化進(jìn)程［11-13］。血小板活化是復(fù)雜的過(guò)程，血小板的活化除了參與溶栓與凝血的正常生理功能外，還可能與腫瘤血管新生、疼痛等進(jìn)程有關(guān)，研究認(rèn)為血小板可通過(guò)CD62P等血小板膜糖蛋白與白細(xì)胞反應(yīng)參與炎癥反應(yīng)進(jìn)程［14］。此外，CD62P、CD63在腦缺血疾病進(jìn)展中亦具有一定作用［15-16］。綜上所述，GSK3β在血小板活化、細(xì)胞凋亡、抗炎、抗腦缺血作用中有重要作用，其可通過(guò)干預(yù)不同信號(hào)通路發(fā)揮作用，而CD63作為血小板膜糖蛋白，在血小板活化及腦缺血中亦具有重要意義［10-15］。因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上檢測(cè)腦梗死體積、GSK3β mRNA及CD63表達(dá)情況，結(jié)果提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著減少腦梗死體積，其機(jī)制可能與抑制GSK3β mRNA及CD63表達(dá)有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能下調(diào)過(guò)表達(dá)的GSK3β基因和抑制CD63分子的表達(dá)，與本課題組前期研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抗血小板作用并可能通過(guò)干預(yù)Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗腦缺血再灌注損傷的作用相吻合［4-5］；與補(bǔ)陽(yáng)還五湯下調(diào)PTEN基因過(guò)表達(dá)與抑制CD62P表達(dá)的結(jié)果亦相吻合；雖然本課題組發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；但PI3K/Akt作為體內(nèi)重要的通路之一，亦可能通過(guò)Akt下游信號(hào)干預(yù)NF-κB炎性信號(hào)通路發(fā)揮作用；因此，其神經(jīng)保護(hù)作用是否仍與調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路干預(yù)炎癥通路，減輕腦細(xì)胞炎性損害有關(guān)，仍待進(jìn)一步研究。未來(lái)將通過(guò)Western-blot進(jìn)一步觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)GSK3β及其他相關(guān)蛋白的表達(dá)以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)論。此外，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能抑制CD63分子表達(dá)而抑制血小板活化，與目前抑制GSK3β可促進(jìn)血小板活化的結(jié)果有一定差異，其可能與補(bǔ)陽(yáng)還五湯的多種成分有關(guān)，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能通過(guò)多靶點(diǎn)調(diào)控實(shí)現(xiàn)其抗栓、抗腦缺血的作用；但補(bǔ)陽(yáng)還五湯同時(shí)抑制血小板活化與下調(diào)GSK3β mRNA表達(dá)的確切原因仍待進(jìn)一步探討。

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【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Buyang Huanwu Decoction on Glycogen Synthase Kinase 3β mRNA Expression in Cerebral Ischemia-reperfusion Injury Rat Model

LAI Riming1，ZHU Yuan2，ZHENG Lixian2，ZHANG Jiping3
（1.Zengcheng District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510000 Guangdong，China；
2.College of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515 Guangdong，China；
3.Foshan Hospital Affiliated to Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528000 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction（BHD）on the expression of glycogen synthase kinase 3β（GSK3β）mRNA and CD63 in cerebral ischemia-reperfusion injury rat model.Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats at specific-pathogen free level were evenly randomized into 5 groups，shamoperation group，model group，clopidogrel group，high- and low-dose BHD groups.Clopidogrel group was intragastrically administrated with 6.8 mg·kg-1·d-1of clopidogrel，high- and low-dose BHD groups were given intragastric administration with 26，6.5 g·kg-1·d-1of BHD respectively.The other two groups were given normal saline.After pre-treatment for 14 days，transient focal cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by right middle cerebral artery occlusion with thread.The plasma content of CD63 and the mRNA expression of GSK3β in hippocampus were determined.Results The cerebral infarction volume of model group was increased（P<0.05 compared with sham operation group），while was reduced by BHD and clopidogrel（P< 0.05）.The expression levels of CD63 and GSK3β mRNA in model group were enhanced（P<0.05 compared with sham operation group），while were decreased in high-，low-dose BHD groups and clopidogrel group，particularly in high-dose BHD group.Conclusion The protective effect of BHD on acute cerebral ischemiareperfusion model is related with the down-regulation of GSK3β mRNA overexpression and with the inhibition of CD63 expression.

Key words：Buyang Huanwu Decoction/pharmacology，cerebral ischemia/TCD therapy；gene expression regulation；platelet activation；GSK3β mRNA；CD63；disease models，animal；Rats

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-3213（2016）03 - 0362 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．019

收稿日期：2015-11-10

作者簡(jiǎn)介：賴日明（1963-），男，副主任中藥師；E-mail：3355089934@qq.com

通訊作者：張繼平（1964-），男，碩士研究生導(dǎo)師，研究員，主任中藥師；E-mail：fszjping@163.com

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：S2013010012284）；廣東省中醫(yī)藥局建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省資助課題（編號(hào)：20132029）