鄭彥懿，溫如燕，羅霞，周聯(lián)（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州　510006）

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大黃牡丹湯對腸道菌群的體外作用

鄭彥懿，溫如燕，羅霞，周聯(lián)
（廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州510006）

摘要：【目的】觀察大黃牡丹湯對腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的影響?！痉椒ā糠謩e采用16S rDNA測序法、平板計數(shù)法和氣相色譜法考察大黃牡丹湯對腸道菌群及其分泌短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）功能的影響?！窘Y(jié)果】16S rDNA測序結(jié)果表明擬桿菌屬、埃希菌屬細菌明顯減少，乳桿菌屬、乳球菌屬、變形菌屬細菌增多。平板計數(shù)結(jié)果表明大黃牡丹湯能顯著抑制脆弱擬桿菌體外增殖（P＜0.001）。氣相色譜法檢測結(jié)果表明大黃牡丹湯可顯著抑制SCFAs的分泌（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）?！窘Y(jié)論】腸道菌群及其代謝產(chǎn)物可能是大黃牡丹湯發(fā)揮藥效的靶點。

關(guān)鍵詞：大黃牡丹湯/藥理學；擬桿菌屬；脆弱擬桿菌；短鏈脂肪酸；16S rDNA測序；色譜法，氣相

研究［1-4］發(fā)現(xiàn)，肥胖、Ⅱ型糖尿病、腸應激綜合征、炎癥性腸病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展均與腸道菌群密切相關(guān)，據(jù)此推測腸道菌群可以作為藥物治療疾病的作用靶點。傳統(tǒng)中藥多為復方湯劑，其成分復雜，故中藥作用機制常受到質(zhì)疑。大黃牡丹湯出自《金匱要略》，是治療腸癰的經(jīng)典方。該方由大黃、牡丹皮、桃仁、冬瓜仁和芒硝組成，現(xiàn)代臨床常用于治療潰瘍性結(jié)腸炎［5］、急性闌尾炎［6］等炎癥疾病。本研究通過觀察大黃牡丹湯對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的體外影響，為闡明大黃牡丹湯作用機制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1動物SPF級BALB/c小鼠2只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

1.2藥物與試劑大黃（四川產(chǎn)，批號：HX14B01）、牡丹皮（安徽產(chǎn)，批號：VPA4G001）、桃仁（四川產(chǎn)，批號：131201921）、冬瓜仁（廣東產(chǎn)，批號：150308721）、芒硝（青海產(chǎn)，批號：150403621）均均購于廣東省中醫(yī)院；標準品：乙酸（200 mmol/L，批號：E1430023）、丙酸（100 mmol/L，批號：E1413034）、丁酸（100 mmol/L，批號：F1508160）、大黃素（≥960 mg/g，批號：L1408020）均購于美國Aladdin公司；脆弱擬桿菌（編號：ATCC 25285）購于上海復祥生物科技有限公司；腦心浸液肉湯（批號：20140708）、胰蛋白大豆瓊脂（批號：20141118）購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；硫氰酸胍（批號：G6636）、N-月桂酰肌氨酸（批號：L9150）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP，批號：PB0436）購于美國Sigma公司；Tris-HCl（批號：TB0194）、乙二胺四乙酸（EDTA，批號：15575-038）、醋酸鈉（批號：AM9740）、醋酸鉀（批號：AM9610）購于美國Ambion公司；Phusion High-Fidelity PCR Master Mix購于美國NEB公司；Agencourt Ampure XP beads購于美國Beckman Coulter公司；Eva Green qPCR Master Mix購于美國Biotium公司；MiSeq Reagent Kit購于美國Illumiina公司；無菌去纖維羊血（批號：150729）購于廣州蕊特生物科技有限公司。

1.3儀器及其他材料BSA224S電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇凈安泰公司）；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；tissue lyserⅡ樣品破碎系統(tǒng)（德國Qiagen公司）；5427R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；2100生物芯片分析系統(tǒng)（美國Agilent公司）；麥氏比濁管（批號：5103184，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；GC2010 Plus氣相色譜儀配備：AOC-20i自動進樣器、GH-400氫氣發(fā)生器（日本島津公司）。

1.4藥液的制備大黃牡丹湯原方除芒硝外加水600 mL浸泡20 min，武火煎煮1 h，過濾，再加水300 mL，煎煮30 min，合并藥液后加入芒硝，待其充分溶解后濃縮至生藥量1 g/mL，4℃儲存。

1.5大黃牡丹湯對腸道菌群多樣性的影響

1.5.1小鼠盲腸內(nèi)容物的培養(yǎng)無菌取小鼠盲腸內(nèi)容物約0.1 g于EP管中，加9倍量無菌生理鹽水，渦旋均勻，此腸菌液稀釋度為10-1，稀釋10倍得到10-2腸菌液，備用。配制腦心浸液肉湯，分為需氧菌組和厭氧菌組（液面添加液體石蠟）。以上2組試管又各分為給藥組和空白組，給藥組加入大黃牡丹湯（終濃度分別為2、4、8 mg/mL），空白組加入等量磷酸鹽緩沖液（PBS）。定量接種10-2腸菌液至試管中，混勻，封口；37℃培養(yǎng)48 h后，吸棄液體石蠟，等比例混合需氧菌菌液和厭氧菌菌液，離心（3 500 r/min，10 min，4℃），棄上清，于-80℃保存，備用。

1.5.2腸道菌群DNA的提取從-80℃冰箱取出細菌樣品，加入適量硫氰酸胍和N-月桂酰肌氨酸，70℃水浴1 h后，加入玻璃珠，震蕩分散，離心（12 000 r/min，5 min，4℃）。轉(zhuǎn)移上清至EP管中，加TENP buffer，渦旋，離心（12 000 r/min，5 min，4℃）。吸上清至新Ep管中，沉淀重復上一步操作，共4次。收集所有上清至2個異丙醇管中，置4℃過夜，離心（12 000 r/min，15 min，4℃）。棄上清，在其中1個異丙醇管中加入磷酸緩沖液和醋酸鉀，混勻后轉(zhuǎn)入另1個異丙醇管，混勻，于冰上靜置1.5 h，離心（12 000 r/min，30 min，4℃），加無水乙醇和醋酸鈉，于-20℃放置1 h，離心（13 260 r/min，10 min，4℃）。棄上清后加入體積分數(shù)70%乙醇，常溫離心（12 000 r/min，5 min）并重復此步驟。加入TE buffer混勻，得到DNA模板樣品。

1.5.316S rDNA擴增及測序取樣品模板DNA30 ng，按試劑盒說明書進行PCR。反應條件：預變性：94℃，3 min；變形：94℃，10 s；退火：56℃，30 s；30個循環(huán)。按試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物。檢測DNA分子長度并按試劑盒說明書進行定量后，經(jīng)MiSeq系統(tǒng)進行基因測序。

1.6大黃牡丹湯對腸道菌群短鏈脂肪酸（SCFAs）的影響

1.6.1氣相色譜條件色譜柱：RTX-WAX毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：230℃；載氣：氮氣，純度≥99.999%；載氣流速3.0 mL/min；進樣方式：無分流進樣，進樣量為2.0 μL；檢測器溫度（FID）：250℃；柱溫程序：。

1.6.2標準曲線的制備分別吸取乙酸、丙酸、丁酸對照品2.5、5、25、50、100 μL，等體積混合于進樣瓶中并標記，加乙醚至1 mL，共5瓶。另取乙酸對照品500 μL，加乙醚至1 mL，共1瓶。又分別取乙酸、丙酸、丁酸對照品各1 mL，共3瓶，以上9個樣品均上機檢測。根據(jù)乙酸、丙酸、丁酸的濃度與峰面積關(guān)系制備標準曲線。

1.6.3樣品的制備取1.5.1項下培養(yǎng)后的厭氧菌菌液，吸棄液體石蠟，混勻培養(yǎng)基，離心（3500r/min，10 min，4℃）。取2 mL上清，加入10 mol/L的H2SO4200 μL進行酸化，加入2 mL無水乙醚，混勻后靜置15 min，室溫離心（3 000 r/min，15 min）。轉(zhuǎn)移上清至氣相進樣瓶中，按1.6.1色譜條件上機檢測。

1.7大黃牡丹湯對脆弱擬桿菌增殖的影響常規(guī)方法復蘇脆弱擬桿菌菌株后，采用比濁法［7］調(diào)整菌液濃度為106個/mL。在培養(yǎng)基中加入大黃牡丹湯（終濃度為2、4、8 mg/mL），空白組加入等量PBS。定量接種菌液，涂布均勻后，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，進行菌落計數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位（CFU）的對數(shù)值表示。

1.8大黃牡丹湯對脆弱擬桿菌SCFAs的影響配制腦心浸液肉湯（液面添加液體石蠟），加入大黃牡丹湯（終濃度分別為2、4、8 mg/mL），空白組加入等量PBS。加入脆弱擬桿菌菌液（106個/mL），混勻后37℃厭氧培養(yǎng)48 h。按1.6.3項下方法處理后，上機檢測。

2　結(jié)果與分析

2.116S rDNA測序結(jié)果利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads組裝，得到高變區(qū)的Tags。這些Tags在97%相似度下聚類為OTU（operational taxonomic units）。與數(shù)據(jù)庫比對后，對OTU進行物種分類，并根據(jù)細菌種類的相對豐度（relative abundance）作物種柱狀百分比堆積圖，著重分析門、屬等級的結(jié)果表明：體外給予RPD后，擬桿菌門（Bacteroidetes）隨給藥濃度增加而明顯減少，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）細菌均有不同程度的增加（圖1-A）。在屬水平的層面，在豐度較高的幾種腸道細菌中，擬桿菌屬（Bacteroides）、埃希菌屬（Escherichia）減少，乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、變形菌屬（Proteus）增加。其中，擬桿菌屬明顯減少（圖1-B）。

圖1　門（A）、屬（B）水平細菌相對豐度圖Figure 1 The relative abundance of intestinal flora at phylum（A）and genus（B）level

根據(jù)16SrDNA測序結(jié)果，本研究挑選被抑制最明顯的擬桿菌屬細菌，觀察大黃牡丹湯對擬桿菌屬多樣性的改變情況，共檢測到5種擬桿菌屬細菌。表1結(jié)果顯示：OTU2、OTU6、OTU31隨給藥濃度減少，表明大黃牡丹湯對這3種擬桿菌屬細菌有抑制作用。而OTU11、OTU26則在一定濃度范圍內(nèi)有所增加。但此結(jié)果只能確定到屬水平，無法確定具體的細菌種類。

表1　擬桿菌屬變化情況Table 1 OTU of Bacteroides in various groups

2.2大黃牡丹湯對腸道菌群短鏈脂肪酸的影響

2.2.1SCFAs線性范圍考察按1.6.2項下方法，以峰面積（μV×min）為縱坐標，乙酸、丙酸、丁酸的濃度（μmol/mL）為橫坐標，分別求得乙酸、丙酸、丁酸對照品的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2　SCFAs對照品線性關(guān)系考察Table 2　The linear relationship of SCFAs reference

2.2.2精密度試驗精密吸取乙酸、丙酸、丁酸對照品50 μL，混合于進樣瓶中，加乙醚至1 mL，按1.6.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次。測得乙酸、丙酸、丁酸相對標準偏差（sR）分別為1.42%、2.36%、0.52%。

2.2.3重現(xiàn)性試驗取1.6項下空白組樣品，按1.6.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測得乙酸、丙酸、丁酸sR分別為2.46%、2.76%、2.50%。

2.2.4大黃牡丹湯體外對腸道菌群短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響表3結(jié)果顯示：在一定濃度范圍內(nèi)，大黃牡丹湯可體外抑制腸道菌群整體短鏈脂肪酸的分泌，其中，對丙酸的抑制作用顯著（P＜0.01或P＜0.001），對丁酸的影響較緩和，而8 mg/mL大黃牡丹湯對乙酸抑制顯著（P＜0.001）。

表3　大黃牡丹湯體外對腸道菌群短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of DMD on SCFAs secretion of intestinal flora in vitro?。ā纒，N=3）

表3　大黃牡丹湯體外對腸道菌群短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of DMD on SCFAs secretion of intestinal flora in vitro?。ā纒，N=3）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白組比較

cSCFAs/（μmol·mL-1）組別　ρ/（mg·mL-1）空白組大黃牡丹湯低劑量組大黃牡丹湯中劑量組大黃牡丹湯高劑量組0248乙酸17.22±1.65 17.44±6.72 14.70±3.94 12.55±1.37③丙酸1.21±0.08 1.10±0.53 0.64±0.32②0.21±0.20③丁酸0.65±0.00 0.64±0.00②0.64±0.00①0.64±0.00②

2.3大黃牡丹湯對脆弱擬桿菌的體外影響

2.3.1平板計數(shù)法考察脆弱擬桿菌增殖情況脆弱擬桿菌（B.fragilis）作為擬桿菌屬模式菌種，被用于進一步驗證大黃牡丹湯對擬桿菌屬細菌的影響。圖2結(jié)果表明：大黃牡丹湯對脆弱擬桿菌的抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.001）。

圖2　大黃牡丹湯體外對脆弱擬桿菌增殖的影響Figure 2 Effect of DMD on proliferation of Bacteroides fragilis in vitro?。ā纒，N=3）

2.3.2大黃牡丹湯體外對脆弱擬桿菌短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響表4結(jié)果顯示：大黃牡丹湯對脆弱擬桿菌分泌的乙酸、丙酸、丁酸均有顯著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01或P＜0.001）。

表4　大黃牡丹湯體外對脆弱擬桿菌短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of DMD on SCFAs secretion of Bacteroides fragilis in vitro?。ā纒，N=3）

表4　大黃牡丹湯體外對脆弱擬桿菌短鏈脂肪酸產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of DMD on SCFAs secretion of Bacteroides fragilis in vitro　（±s，N=3）

①P＜0.05，②P＜0.01，③P＜0.001，與空白組比較

cSCFAs/（μmol·mL-1）組別　ρ/（mg·mL-1）空白組大黃牡丹湯低劑量組大黃牡丹湯中劑量組大黃牡丹湯高劑量組0248乙酸8.46±0.89 7.69±0.66 7.43±1.21 6.70±0.29①丙酸1.83±0.13 1.53±0.07①1.50±0.43①1.18±0.03②丁酸0.75±0.02 0.62±0.01③0.58±0.01③0.70±0.03③

3　討論

腸道菌群是定植在機體腸道中的細菌、古生菌、病毒和一些單細胞真核生物的統(tǒng)稱［3］。宏基因組測序顯示腸道菌群基因數(shù)量是人基因數(shù)量的150倍，其中超過99%的基因均來自細菌，且每個個體腸道中所攜帶的細菌至少超過160種［8］。目前為止，至少有40個菌屬約400～500個菌種被認識［9］。近年來，越來越多的研究表明腸道菌群與人體免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面的疾病密不可分［10］。

大黃牡丹湯瀉熱破結(jié)、散結(jié)消腫，是治療腸癰的經(jīng)典方藥，但其作用機制尚不完全明確。方中的有效成分主要為總蒽醌、結(jié)合蒽醌和丹皮酚［11］，這些成分均具有顯著的抗菌消炎作用，與現(xiàn)代醫(yī)學所認為的“細菌感染是腸癰的主要發(fā)病原因之一”相聯(lián)系，為大黃牡丹湯治療腸道炎癥奠定了物質(zhì)基礎。結(jié)合本研究中對整體腸道菌群的研究，發(fā)現(xiàn)大黃牡丹湯體外可增加乳桿菌屬、乳球菌屬、變形菌屬，而減少埃希菌屬，說明大黃牡丹湯可能通過改變腸道菌群發(fā)揮其藥效作用。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)腸道菌群中的一類條件致病菌——擬桿菌屬受到大黃牡丹湯的影響較大。擬桿菌屬是一類主要常住于哺乳動物腸道的革蘭陰性、無芽孢、專性厭氧的桿菌，也是機體中主要分泌丙酸的細菌。但當機體出現(xiàn)免疫功能紊亂或炎癥狀態(tài)時，擬桿菌屬細菌便會成為加重炎癥癥狀、導致內(nèi)源性感染的條件致病菌［12］。脆弱擬桿菌作為擬桿菌屬模式菌種，學界對其研究較多。在人的結(jié)腸組織中，脆弱擬桿菌只占正常菌群的不到1%，而在由厭氧菌引起的感染中則占60%～90%［13］。本研究結(jié)果表明，大黃牡丹湯可明顯抑制擬桿菌屬、脆弱擬桿菌，進一步證明腸道菌群可以作為大黃牡丹湯治療疾病的作用靶點。

除研究大黃牡丹湯對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響外，本研究還初步觀察了大黃牡丹湯對腸道菌群代謝產(chǎn)物——短鏈脂肪酸的影響。短鏈脂肪酸是腸道厭氧菌酵解未消化的碳水化合物而產(chǎn)生的一類有機酸，其中乙酸、丙酸和丁酸約占短鏈脂肪酸總量約90%～95%［14］。其中，輕度和中度UC患者糞便中，短鏈脂肪酸總量較正常組高；而重度UC患者糞便中，短鏈脂肪酸總量較正常組明顯降低［15］。本研究結(jié)果顯示：大黃牡丹湯可抑制腸道菌群短鏈脂肪酸的分泌，推測大黃牡丹湯在治療輕度和中度UC時可能更有優(yōu)勢。研究［16］發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酸對炎癥因子干擾素γ（IFN-γ）的表達有增強作用，丁酸明顯抑制抑炎因子白細胞介素10（IL-10）的表達，推測短鏈脂肪酸可通過影響細胞因子進而影響炎癥。本研究結(jié)果顯示：大黃牡丹湯可抑制短鏈脂肪酸的分泌，提示大黃牡丹湯治療炎癥疾病的機制之一可能是通過抑制短鏈脂肪酸而影響細胞因子的表達，從而緩解炎癥癥狀。

本研究結(jié)果表明大黃牡丹湯對腸道菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物有一定影響，表明腸道菌群或其代謝產(chǎn)物可能是中藥治療疾病的作用靶點之一，這不僅可為進一步闡明中藥復方作用機制提供研究基礎，也可為開發(fā)中藥新藥和疾病治療新方法提供線索。

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【責任編輯：黃玲】

In-vitro Effect of Dahuang Mudan Decoction on Intestinal Flora

ZHENG Yanyi，WEN Ruyan，LUO Xia，ZHOU Lian
（School of Chinese Herbal Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of Dahuang Mudan Decoction（DMD）on structure and function of interstinal flora.Methods 16S rDNA sequencing method，plate counting assay，and gas chromatography（GC）were used to evaluate the effect of DMD on the function of intestinal flora and short-chain fatty acids（SCFAs）secretion in vitro.Results The 16S rDNA sequencing results showed that the relative abundance of Bacteroides and Escherichia was decreased，and that of Lactocacillus，Labtococcus and Proteus was increased.Plate count results showed that the proliferation of Bacteroides fragilis was inhibited by DMD（P＜0.001）.The GC results showed that secretion of short-chain fatty acids of intestinal flora was inhibted by DMD（P＜0.05，P＜0.01 or P＜0.001）.Conclusion Intestinal flora and its metabolites may be the therapeutic target of DMD.

Key words：Dahuang Mudan Decoction/pharmacology；Bacteroides；Bacteroides fragilis；short-chain fatty acids；16S rDNA sequencing；chromatography；gas chromatography

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0357 - 05

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．018

收稿日期：2015-12-07

作者簡介：鄭彥懿（1991-），女，碩士研究生；E-mail：373866263@qq.com

通訊作者：周聯(lián)，男，教授，博士研究生導師；E-mail：zl@gzucm.edu.cn

基金項目：廣東省自然科學基金資助項目（編號：2015A030313344）；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目（編號：20124425110010）