黃曾慰，吳兆鵬，常國(guó)煒，黎志德，張九花，曾練強(qiáng)，梁達(dá)奉,2*

（1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2廣西糖業(yè)研發(fā)中心，廣西南寧530002）

重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的放大研究

黃曾慰1，吳兆鵬1，常國(guó)煒1，黎志德1，張九花1，曾練強(qiáng)1，梁達(dá)奉1,2*

（1廣州甘蔗糖業(yè)研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316；2廣西糖業(yè)研發(fā)中心，廣西南寧530002）

研究了畢赤酵母高密度發(fā)酵組成型表達(dá)α-葡聚糖酶，從6.8 L發(fā)酵罐逐級(jí)放大至5000 L發(fā)酵罐的放大工藝。采用恒定pH和控制甘油殘留濃度和溶解氧相結(jié)合的調(diào)控策略，進(jìn)行了多批次的發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明：三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的α-葡聚糖酶的生成具有生長(zhǎng)偶聯(lián)特征，集中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。6.8 L發(fā)酵罐中上清酶活達(dá)1253 U/mL，中試放大至50 L發(fā)酵罐中產(chǎn)酶最高達(dá)1300 U/mL，500 L發(fā)酵罐中酶活為740 U/mL。5000 L規(guī)模發(fā)酵罐中產(chǎn)酶達(dá)到589 U/mL。建立了以甘油作為碳源，發(fā)酵調(diào)控簡(jiǎn)單的工藝，避免了使用甲醇帶來的安全問題，適合放大生產(chǎn)。

α-葡聚糖酶；畢赤酵母；組成型表達(dá)；發(fā)酵放大

0 前言

甘蔗制糖生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的α-葡聚糖是高分子粘性多糖，又稱右旋糖酐，俗稱“蔗飯”。其存在導(dǎo)致粘度增大，澄清過濾、蒸發(fā)結(jié)晶受影響，收回降低，質(zhì)量下降。在制糖工業(yè)中應(yīng)用α-葡聚糖酶(Dextranase)能快速高效清除蔗汁等物料中的α-葡聚糖，提高糖分收回和產(chǎn)品質(zhì)量，具有安全高效、用量小的特點(diǎn)[1-2]。

通過基因工程菌異源表達(dá)是量產(chǎn)α-葡聚糖酶的較為可行的途徑。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)能夠高效分泌表達(dá)外源蛋白，背景蛋白少，分離純化容易，培養(yǎng)成本低。因此，畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)在近20年來獲得了廣泛應(yīng)用，數(shù)百種基因在該系統(tǒng)中成功表達(dá)[3-4]。多位學(xué)者報(bào)道了在畢赤酵母中以AOX（醇氧化酶）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)α-葡聚糖酶基因表達(dá)，此類工程菌須以甲醇作為誘導(dǎo)物[5-7]。然而利用甲醇作為碳源進(jìn)行較大規(guī)模的發(fā)酵時(shí)，存在生產(chǎn)安全和食品安全隱患。

畢赤酵母的GAP（三磷酸甘油醛脫氫酶）啟動(dòng)子可以不依賴誘導(dǎo)物，利用葡萄糖或甘油等碳源組成型表達(dá)外源蛋白[8]。目前基于GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)還未形成通用的發(fā)酵調(diào)控策略。Kirsten等采用間歇補(bǔ)料，以葡萄糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)疏水蛋白[9]。Fei等通過恒速流加葡萄糖胞內(nèi)表達(dá)谷胱甘肽合成相關(guān)酶[10]。Goodrick等在補(bǔ)料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵過程中恒速流加甘油或葡萄糖[11]。Guan等通過維持DO（溶解氧）25%～40%之間進(jìn)行發(fā)酵[12]。組成型表達(dá)在大規(guī)模生產(chǎn)方面有很好的應(yīng)用前景，但是有關(guān)中試放大的研究報(bào)道較少。Zhao等通過調(diào)控pH和指數(shù)流加，中試放大至800 L發(fā)酵罐[13]。江學(xué)斌采用分段控制工藝使木聚糖酶10 m3發(fā)酵水平比50 L發(fā)酵罐提高了23%[14]。本研究對(duì)畢赤酵母工程菌產(chǎn)α-葡聚糖酶進(jìn)行高密度發(fā)酵，探索了從6.8 L至5000 L發(fā)酵罐的中試放大工藝。

1 材料與方法

1.1材料和儀器

1.1.1菌株

組成型表達(dá)α-葡聚糖酶的重組畢赤酵母(Pichia pastoris)，菌株名為KM71H/pGAPZα-dex，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。其整合表達(dá)載體為pGAPZαA，分泌信號(hào)肽序列為α-MF，外源基因來源為根據(jù)朱黃青霉(Penicillium minioluteum) α-葡聚糖酶氨基酸序列(GenBank GI:37927147)，經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成。

1.1.2主要試劑和儀器

Dextran T2000購(gòu)自Pharmacia公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；紫外可見分光光度計(jì)為北京普析通用公司產(chǎn)品；全溫度培養(yǎng)振蕩器為上海蘇坤公司產(chǎn)品；LDZS型立式壓力蒸汽滅菌器為上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；6.8 L BIOSTAT Aplus發(fā)酵罐為B.BRAUN公司產(chǎn)品；pH 和DO電極為METTLER TOLEDO公司產(chǎn)品；程序可調(diào)式蠕動(dòng)泵為河北蘭格公司生產(chǎn)。

1.1.3培養(yǎng)基

YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：20 g/L葡萄糖，10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，20 g/L瓊脂。

YPG（酵母浸出粉胨甘油培養(yǎng)基）：10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨，50 g/L甘油。

PTM1（微量元素）溶液成分為：6.0 g/L CuSO4·5H2O, 0.08 g/L KI，3.0 g/L MnSO4·H2O，0.2 g/L Na2MoO4·2H2O，0.02 g/L H3BO3，0.5 g/L CoCl2，20 g/L ZnCl2，65 g/L FeSO4·7H2O, 0.2 g/L Biotin，5 mL/L 98% H2SO4。

BSM（基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基）：100 g/L Glycerol，0.93 g/L CaSO4·2H2O，18.2 g/L K2SO4，14.9 g/L MgSO4·7H2O，4.13 g/L KOH，26.7 mL/L 85% H3PO4。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：100%甘油，12 mL/L PTM1微量元素溶液。流加25%氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH以及補(bǔ)充氮源。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1種子培養(yǎng)

一級(jí)種子：將重組畢赤酵母于YPD斜面劃線活化，30℃培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)接入裝有50 mL YPG培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，搖床培養(yǎng)至OD600=15。

二級(jí)種子：取50 mL一級(jí)種子接入裝有450 mL YPG培養(yǎng)基的2500 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，培養(yǎng)至OD600=15。

1.2.26.8 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

一級(jí)種子培養(yǎng)至OD600=15，將300 mL 種子液接入裝有2.7 L BSM培養(yǎng)基的6.8 L發(fā)酵罐中，起始體積為3 L。每升BSM培養(yǎng)基中加入4 mL PTM1微量元素溶液。培養(yǎng)條件為30℃，pH 5.5。隨著菌體生長(zhǎng)，溶氧逐漸降低，此時(shí)開始逐步調(diào)整通氣量與攪拌轉(zhuǎn)速，控制DO 20%～30%。當(dāng)培養(yǎng)基中甘油濃度低于1% 時(shí)，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持甘油濃度為1%～2.5%，適時(shí)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量維持DO 10%～20%，直至發(fā)酵終點(diǎn)。

1.2.350 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

27 L BSM培養(yǎng)基裝于50 L發(fā)酵罐中，按10%接種量，將3 L二級(jí)種子接入50 L發(fā)酵罐，起始體積為30 L。每升培養(yǎng)基中加入4 mL PTM1微量元素溶液。培養(yǎng)條件為30℃，pH 5.5，發(fā)酵調(diào)控同6.8 L發(fā)酵罐。

1.2.4500 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

50 L發(fā)酵罐接入二級(jí)種子后作為三級(jí)種子罐，培養(yǎng)至OD600=15即為種子液。270 L BSM培養(yǎng)基裝于500 L發(fā)酵罐中，按10%接種量，將30 L種子液接入，起始體積為300 L。每升培養(yǎng)基中加入4 mL PTM1微量元素溶液。培養(yǎng)條件為30℃，pH 5.5，發(fā)酵調(diào)控同6.8 L發(fā)酵罐。

1.2.55000 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

以500 L發(fā)酵罐作為四級(jí)種子罐，培養(yǎng)至OD600=15即為種子液。2700 L BSM培養(yǎng)基裝于5000 L發(fā)酵罐中，按10%接種量，將300 L種子液接入，起始培養(yǎng)體積為3000 L。每升培養(yǎng)基中加入4 mL PTM1微量元素溶液。培養(yǎng)條件為30℃，pH 5.5，發(fā)酵調(diào)控同6.8 L發(fā)酵罐。

1.2.6發(fā)酵液細(xì)胞濕重測(cè)定

取1.0 mL發(fā)酵液置于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心5 min，棄上清，小心擦去管壁附著的清液后稱得總重?？傊乜鄢针x心管質(zhì)量即為細(xì)胞濕重。

1.2.7酶活測(cè)定

酶活定義：采用DNS法，在45℃、pH 5.5條件下，每分鐘催化底物水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U表示。發(fā)酵液經(jīng)12000 r/min離心5 min，取上清液，經(jīng)稀釋適當(dāng)倍數(shù)后作為待測(cè)定酶液。取900 μL 0.02 g/mL的Dextran T2000溶液作為反應(yīng)底物，置于45℃恒溫水浴中預(yù)熱5 min，加入100 μL酶液，反應(yīng)10 min。加入2 mL DNS試劑以終止反應(yīng)，沸水浴5 min，然后迅速將其冷卻，用蒸餾水定容至25 mL，于540 nm測(cè)定吸光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得相對(duì)應(yīng)的葡萄糖的量，并計(jì)算出酶活。

1.2.8甘油濃度的測(cè)定

采用高碘酸法。甘油被過量高碘酸氧化后，高碘酸被還原為碘酸。過剩的高碘酸及產(chǎn)物碘酸與碘化鉀反應(yīng)析出碘。用硫代硫酸鈉滴定碘，經(jīng)計(jì)算求得甘油含量。

2 結(jié)果與分析

圖1　6.8 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和酶活曲線

表1　6.8 L發(fā)酵罐3批發(fā)酵結(jié)果

2.250L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

50 L發(fā)酵罐的中試放大結(jié)果如圖2所示。細(xì)胞于30 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，70 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。至90 h發(fā)酵結(jié)束，濕重達(dá)到709 g/L，發(fā)酵上清液中酶活達(dá)到1048 U/mL。表2顯示了2個(gè)批次的50 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與6.8 L發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相比，酶活水平接近，但菌體濕重明顯提高。

表2　50 L發(fā)酵罐2批發(fā)酵結(jié)果

2.3500L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

圖3顯示了500 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)過程。細(xì)胞生長(zhǎng)于20 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，65 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。至92 h發(fā)酵結(jié)束，濕重達(dá)到469 g/L，發(fā)酵上清液中酶活達(dá)到640 U/mL。表3顯示了3個(gè)批次的500 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與6.8、50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相比，濕重和酶活均降低。

圖2　50 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和酶活曲線

圖3　500 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和酶活曲線

表3　500 L發(fā)酵罐3批發(fā)酵結(jié)果

2.45000L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

5000 L工業(yè)發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果如圖4所示。至94 h發(fā)酵結(jié)束，濕重達(dá)到492 g/L，發(fā)酵液酶活達(dá)到505 U/mL。表4列出了3個(gè)批次的5000 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果，工藝總體上比較穩(wěn)定。

表4　5000 L發(fā)酵罐3批發(fā)酵結(jié)果

GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基本劃分為2個(gè)階段。首先是分批發(fā)酵階段，通常以葡萄糖或甘油作為碳源，從接種至初始碳源耗竭，通常持續(xù)20～30 h。此后進(jìn)入補(bǔ)料流加階段，流加碳源類型一般與初始碳源相同，不作變動(dòng)。同時(shí)流加氨水以調(diào)節(jié)pH和補(bǔ)充氮源。細(xì)胞逐漸進(jìn)入高密度發(fā)酵階段，大部分目標(biāo)產(chǎn)物也在這一階段產(chǎn)生。高密度發(fā)酵后期，細(xì)胞的死亡率大幅提高，蛋白酶在發(fā)酵液中積累可使產(chǎn)物不同程度地降解。至發(fā)酵結(jié)束，流加階段通常持續(xù)50～80 h。

綜合比較從6.8 L放大至5000 L發(fā)酵罐多批次的結(jié)果（圖5），畢赤酵母工程菌在6.8 L和50 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，細(xì)胞濕重均值達(dá)600 g/L以上，酶活均值超過1100 U/mL。而500 L和5000 L發(fā)酵罐中細(xì)胞濕重則所有下降，介于450～500 g/L之間，相對(duì)應(yīng)的酶活水平有較大幅度降低。這個(gè)變化趨勢(shì)表明畢赤酵母組成型表達(dá)的產(chǎn)物生成水平依賴于生物量的積累。在發(fā)酵調(diào)控上傾向于獲得較高的生物量來提高產(chǎn)量。注意到50 L發(fā)酵罐中細(xì)胞濕重超過650 g/L，但是酶活相比5 L發(fā)酵罐卻未見提高，表明過高的生物量積累在后期不利于產(chǎn)物積累，產(chǎn)物增長(zhǎng)與生物量增長(zhǎng)已不再成正相關(guān)。為獲得高生物量而進(jìn)行的高密度發(fā)酵將使細(xì)胞面臨氧受限和環(huán)境脅迫，可能導(dǎo)致代謝途徑改變、存活率下降和自溶等問題，最終使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率下降[13]。

圖4　5000 L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和酶活曲線

圖5　不同發(fā)酵規(guī)模結(jié)果比較

發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量下降，無法重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的結(jié)果，這種普遍存在的“放大效應(yīng)”，一般被認(rèn)為是隨著反應(yīng)器的放大，物料的流動(dòng)、傳熱、傳質(zhì)等因素發(fā)生了變化所導(dǎo)致。具體到畢赤酵母組成型發(fā)酵的放大過程中表達(dá)水平出現(xiàn)的差異，其原因尚不明朗。溶氧傳質(zhì)可能是最重要的限制因子，規(guī)模放大之后培養(yǎng)液變得不均勻，大型反應(yīng)器局部可能處于低氧或缺氧狀態(tài)。500 L和5000 L發(fā)酵罐在低密度發(fā)酵階段通入空氣可以維持溶氧在20%以上，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入高密度階段，設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與通氣量至上限也往往無法維持設(shè)定的溶氧濃度，某些時(shí)段溶氧降低到5%以下，局部細(xì)胞在低溶氧甚至缺氧條件下生長(zhǎng)。通入富氧空氣可能在一定程度緩解缺氧問題，但是大規(guī)模發(fā)酵的生產(chǎn)成本隨之提高。

高密度發(fā)酵在放大過程中面臨反應(yīng)器的混合傳遞性能不能滿足工藝需求的問題，組成型較誘導(dǎo)型表現(xiàn)得更為突出[14]。通過指數(shù)流加，控制更低的比生長(zhǎng)速率也許能達(dá)到更好的效果。Zhao等認(rèn)為將細(xì)胞生長(zhǎng)率維持在較低水平有利于提高產(chǎn)物水平[13]。此外，Kristin等通過限制溶氧，使畢赤酵母以葡萄糖為碳源兼性厭氧發(fā)酵，結(jié)果生物量降低，培養(yǎng)周期縮短，比生產(chǎn)速率提高了數(shù)倍[15]。這些報(bào)道給畢赤酵母組成型表達(dá)調(diào)控提供了新的思路。

3 結(jié)論

在已獲得穩(wěn)定表達(dá)α-葡聚糖酶畢赤酵母工程菌基礎(chǔ)上，進(jìn)行了從6.8 L發(fā)酵罐逐級(jí)放大至5000 L發(fā)酵罐的中試研究。產(chǎn)物的生成在各個(gè)規(guī)模發(fā)酵中均顯示出生長(zhǎng)偶聯(lián)特征，集中在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期。6.8 L發(fā)酵罐中酶活達(dá)1253 U/mL，50 L發(fā)酵罐中產(chǎn)酶達(dá)1300 U/mL，超過搖瓶產(chǎn)量的6倍以上。500、5000 L發(fā)酵罐中產(chǎn)酶分別達(dá)到740、589 U/mL。以甘油作為碳源的組成型表達(dá)發(fā)酵工藝相對(duì)簡(jiǎn)單易控，可避免甲醇的使用，適合放大生產(chǎn)。

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(本篇責(zé)任編校：朱滌荃)

Scale-up Fermentation of Recombinant Dextranase Expressed in Pichia Pastoris

HUANG Zeng-wei1, WU Zhao-peng1, CHANG Guo-wei1, LI Zhi-de1, ZHANG Jiu-hua1, ZENG Lian-qiang1, LIANG Da-feng1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316;2Guangxi Sugarcane Industry R & D Center, Nanning 530002)

The high density fermentation of dextranase in the constitutive Pichia pastoris expression system scaled up from 6.8 to 5000 L in series was studied. By controlling residual concentration of glycerol and dissolved oxygen combined with pH-stat, multi batches of fermentation were performed. Results showed that the dextranase synthesis under GAP promoter is growth-associated and mainly in exponential phase and stationary phase. Activity of dextranase in 6.8 L, 50 L, 500 L and 5000 L fermenter reached 1253, 1300, 740 and 589 U/mL, respectively. A simple and convenient fermentation method using glycerol as carbon source has been developed, which obviates problems related with methanol safety concerns and is suitable for large scale production.

Dextranase; Pichia pastoris; Constitutive expression; Fermentation scale-up

TS244

A

1005-9695(2016)02-0020-07

2016-02-15；修回日期：2016-03-23

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-20-4-5)；八桂學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

黃曾慰(1984-)，男，工程師，主要從事食品生物技術(shù)和制糖工藝研究工作；E-mail: zengwei.huang@gmail.com

*梁達(dá)奉(1964-)，男，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，主要從事制糖生物技術(shù)研究工作；E-mail: ldfjt@126.com

引文格式：黃曾慰，吳兆鵬，常國(guó)煒，等. 重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)α-葡聚糖酶的放大研究[J]. 甘蔗糖業(yè)，2016(1)：20-26.