程 姣，黃 弈，任春梅，2*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙4028；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙4028）

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擬南芥CWINV1啟動(dòng)子GUS表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

程 姣1，黃 弈1，任春梅1，2*
（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128；2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128）

摘 要：CWINV是編碼細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶的基因。為深入探討CWINV基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理，構(gòu)建了擬南芥CWINV1基因啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。GUS染色的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了重組表達(dá)載體的正確性和實(shí)用性。

關(guān)鍵詞：擬南芥；CWINV1；載體構(gòu)建；GUS染色

蔗糖轉(zhuǎn)化酶是一種最常見(jiàn)的酶，存在于酵母、細(xì)菌和植物中，在植物中能夠不可逆地催化蔗糖的水解反應(yīng)，生成葡萄糖和果糖，因此，蔗糖轉(zhuǎn)化酶在高等植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵的作用。轉(zhuǎn)化酶參與了植物的生長(zhǎng)、器官建成、糖分運(yùn)輸、韌皮部卸載及調(diào)節(jié)庫(kù)組織糖分構(gòu)成及水平［1］。根據(jù)其最適pH、亞細(xì)胞定位和溶解度等方面的不同，蔗糖轉(zhuǎn)化酶可進(jìn)一步細(xì)分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶［2］。細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因最先從胡蘿卜中分離得到［3］，隨后在馬鈴薯、擬南芥、番茄和葡萄等植物中也分離到編碼該酶的全長(zhǎng)或部分的cDNA序列。細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因在質(zhì)外體中表達(dá)最活躍，并通過(guò)增加蔗糖的濃度梯度加快蔗糖卸載［4］。

目前，在擬南芥中分離出了4個(gè)編碼細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶的相關(guān)基因，其中CWINV1基因的表達(dá)水平最高［5］，但其確切的生理生化功能和作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)構(gòu)建CWINV1基因啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入擬南芥Col - 0野生型中，并通過(guò)抗性篩選和GUS染色鑒定，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，為深入研究CWINV1基因的表達(dá)特征提供基礎(chǔ)材料。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Col -0，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，根癌農(nóng)桿菌（Agro bacterium tumefactions）GV3101，載體pCAMBIA1301，由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)傳導(dǎo)課題組保存。

1.2植物培養(yǎng)條件

將擬南芥種子用消毒液浸泡10 min后，無(wú)菌水清洗3次，播種于含1%蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，避光4℃春化3 d后，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度（22±2）℃；光周期為16 h光照/8 h黑暗。待其生長(zhǎng)7 d后，移栽到盛有浸透營(yíng)養(yǎng)液的人工土壤（東北黑土與蛭石的體積比為1∶1）中，移栽后蓋透明塑料薄膜1～2 d，生長(zhǎng)條件同上。

1.3pCWINV1：：GUS表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1引物設(shè)計(jì)及CWINV1啟動(dòng)子片段的克隆

根據(jù)TAIR網(wǎng)站上公布的擬南芥CWINV1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增引物PCWIN - F/ PCWIN -R，并在上下游引物的5′端分別加上PstⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增預(yù)期目的片段大小約為1800 bp?？寺∫镄蛄袨椋?/p>

PCWIN - F，5′- AACTGCAGACTTTGATGCCCT G -3′（下劃線標(biāo)記為PstⅠ酶切位點(diǎn)）；

PCWIN - R，5′- CATGCCATGGCTTTGTGGCTT -3′（下劃線標(biāo)記為NcoⅠ酶切位點(diǎn)）。

根據(jù)合成引物的預(yù)測(cè)退火溫度，確定引物PCWIN - F/ PCWIN - R的最適退火溫度為58℃。用SDS法［6］提取擬南芥葉片總DNA，以此為模板，用引物PCWIN - F/ PCWIN - R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段并純化。

1.3.2載體連接及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

用PstⅠ和NcoⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)目的片段和pCAMBIA1301載體進(jìn)行雙酶切，回收目的片段和目的載體。用T4連接酶將CWINV1基因啟動(dòng)子連接至pCAMBIA1301載體的相應(yīng)位點(diǎn)。通過(guò)熱激法將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，取陽(yáng)性克隆送上海鉑尚公司測(cè)序。提取測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，進(jìn)行菌落PCR鑒定和質(zhì)粒PCR驗(yàn)證。

1.4擬南芥的轉(zhuǎn)化與GUS染色

挑選經(jīng)驗(yàn)證已轉(zhuǎn)入重組載體的農(nóng)桿菌陽(yáng)性菌落置于含有卡那霉素（50 mg/ L）、慶大霉素（100 mg/ L）、利福平（50 mg/ L）的YEB液體培養(yǎng)基中活化擴(kuò)大。采用浸花法［7］轉(zhuǎn)化擬南芥Col - 0野生型。收獲T0代種子播種于含有潮霉素（25 mg/ L）的MS固體培養(yǎng)基上，長(zhǎng)日照培養(yǎng)2周后將抗性植株移栽至含有營(yíng)養(yǎng)液的人工土壤中正常生長(zhǎng)。為了檢測(cè)目的片段是否已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子的基因組上，設(shè)計(jì)1對(duì)載體檢測(cè)引物pC1301 - F/ pC1301 - R，預(yù)期片段大小約為2000 bp。檢測(cè)引物序列為：

用SDS［6］法提取抗性植株葉片的總DNA，以此為模板，用檢測(cè)引物pC1301 - F/ pC1301 - R進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)取擬南芥Col - 0野生型做對(duì)照，鑒定轉(zhuǎn)化子。

選取抗性植株的幼苗進(jìn)一步進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色鑒定，同時(shí)取相同生長(zhǎng)狀況的轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒的擬南芥幼苗以及Col - 0野生型做對(duì)照。取新鮮組織，置于GUS染液中完全浸泡，37℃染色過(guò)夜，染色后去除GUS染液，用卡諾固定液脫色5～10 h后75%無(wú)水乙醇洗滌1～2次，用顯微鏡觀察染色結(jié)果并拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1CWINV1啟動(dòng)子的GUS表達(dá)載體構(gòu)建

利用PlantCARE對(duì)CWINV1基因上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，其包含了大量核心啟動(dòng)子元件TATA - box以及在啟動(dòng)子和增強(qiáng)區(qū)域常見(jiàn)的順式作用元件CAAT - box。此外，該啟動(dòng)子還包含了與光響應(yīng)有關(guān)的元件Box 4、G - Box、I - Box等以及一些熱誘導(dǎo)和調(diào)控植物激素的元件。這表明CWINV1基因啟動(dòng)子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中有著重要的作用。為了進(jìn)一步確定擬南芥CWINV1基因啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)模式，利用PCR克隆了CWINV1基因上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，約有1800 bp，用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和NcoⅠ雙酶切CWINV1基因啟動(dòng)子片段和pCAMBIA1301載體，用T4連接酶將目的片段連接到帶有報(bào)告基因GUS的pCAMBIA1301載體上，構(gòu)建成了pCWINV1：：GUS融合表達(dá)載體（圖1）。為了驗(yàn)證載體的正確性，對(duì)pCWINV1：：GUS進(jìn)行PstⅠ和NcoⅠ雙酶切（圖2）。結(jié)果顯示：目的片段與預(yù)期結(jié)果相符，表明pCWINV1：：GUS表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1　pCWINV1：：GUS表達(dá)載體示意圖Fig.1 Schematic diagram of pCWINV1：：GUS vector

圖2　pAtCWINV1：：GUS表達(dá)載體雙酶切檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Identification of pAtCWINV1：：GUS vector by restriction enzyme digestion

2.2擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定

將構(gòu)建好的pCWINV1：：GUS表達(dá)載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)入擬南芥Col -0野生型中，獲得4株帶有潮霉素抗性的植株，移至人工土壤正常生長(zhǎng)，提取葉片總DNA，用檢測(cè)引物pC1301 - F/ pC1301 - R對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖3）顯示，Col - 0野生型沒(méi)有出現(xiàn)條帶（1號(hào)泳道），而4株抗性植株（2～5號(hào)泳道）的PCR產(chǎn)物條帶大小與質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照（6號(hào)泳道）一致。這表明，轉(zhuǎn)基因植株基因組序列中導(dǎo)入了目的片段。

圖3　GUS轉(zhuǎn)化子PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR identification of GUS transformed Arabidopsis

2.3轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS染色檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體的正確性和實(shí)用性，將轉(zhuǎn)基因擬南芥繼代培養(yǎng)并通過(guò)PCR檢測(cè)后的T2代播種于含潮霉素（25 mg/ L）的MS固體培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)7 d后對(duì)幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色檢測(cè)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察染色結(jié)果。結(jié)果顯示：GUS基因在未轉(zhuǎn)入重組載體的擬南芥Col -0野生型陰性對(duì)照幼苗中沒(méi)有表達(dá)（圖4A），而在轉(zhuǎn)入重組載體的Col -0野生型幼苗（圖4B）以及轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照（圖4C）中，GUS基因在幼苗中都有明顯表達(dá)，進(jìn)一步證明了CWINV1基因成功啟動(dòng)了GUS基因的表達(dá)，故pCWINV1：：GUS重組載體成功轉(zhuǎn)入了擬南芥植株。

圖4　GUS轉(zhuǎn)化子染色檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Stain identification of GUS transformants

3　結(jié)論與討論

本研究成功構(gòu)建了擬南芥細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因CWINV1啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，并通過(guò)轉(zhuǎn)化Col -0野生型的方式獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究CWINV1基因的表達(dá)特征提供了可靠的遺傳材料。

本研究中構(gòu)建的載體，目的是使CWINV1啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因的表達(dá)，GUS染色的結(jié)果證明了CWINV1基因啟動(dòng)子已轉(zhuǎn)入擬南芥中，而其表達(dá)調(diào)控機(jī)理有待于進(jìn)一步的分析。高等植物細(xì)胞壁上的轉(zhuǎn)化酶是β-呋喃果糖苷酶類(lèi)的一種，這種細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶可以與單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)同調(diào)控細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)［8］?，F(xiàn)有的研究表明，擬南芥細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶至少由4個(gè)基因編碼，分別是CWINV1、CWINV2、CWINV4、CWINV5，其中CWINV1基因被普遍認(rèn)為是蔗糖在韌皮部卸載的一個(gè)主效基因［9］。由于植株的生長(zhǎng)發(fā)育全過(guò)程都受控于基因表達(dá)，本研究中重組表達(dá)載體的成功構(gòu)建為研究CWINV1基因的表達(dá)提供了重要材料，也為深入研究植物細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶的分子機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

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The GUS Expression Vector Construction of Arabidopsis CWINV1 Promoter and Identification of Transgenic Plants

CHENG Jiao1，HUANG Yi1，REN Chunmei1，2*
（1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：CWINV gene encoding the cell wall invertase.CWINV play an important role in plant growth and development，especially blooming，fruit setting，seed formation and other reproductive development period.But its function has not been elucidated in detail.In order to further exploring the mechanism of CWINV gene expression and regulation，the plant expression vectors of CWINV1 gene promoter was constructed with GUS fused report genes，and then transformed into Arabidopsis，transgenic plants were obtained.GUS staining results further verifies the correctness and practicability of the recombinant expression vector.

Keywords：Arabidopsis；CWINV1；vector construction；GUS staining

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5280（2016）03-0237-04

DOI：10.16848/ j.cnki.issn.1001-5280.2016.03.01

收稿日期：2015- 12- 08

作者簡(jiǎn)介：程 姣（1995 -），女，Email：1196864786@ qq.com；并列第一作者：黃 弈（1990 -），男，碩士研究生，Email：435399406@ qq.com。*通信作者：任春梅，博士，教授，Email：rencm66@163.com。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671121）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（（G）SCX1512）。