王文喜，陳麗娜，黃新炎

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒的制備和評(píng)價(jià)

王文喜1，陳麗娜1，黃新炎2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310009)

摘要：制備米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒，評(píng)價(jià)其質(zhì)量并考察其體外透皮情況.采用高壓均質(zhì)法制備米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒，硬脂酸作為固體脂質(zhì)，吐溫80和司盤(pán)80作為乳化劑，用激光粒度儀測(cè)定納米粒的粒徑和電位，用離心法測(cè)定納米粒的包封率和載藥量，用透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀考察藥物的體外釋放及透皮情況.結(jié)果表明：所得米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒的平均粒徑為(422.2±10.2) nm，PDI為(0.210±0.024)，平均Zeta電位為(-31.29±3.20) mV，包封率為(66.34±1.42)%，載藥量為(8.12±0.23)%.此外，MXD-SLN具有良好的緩釋性能，并適合經(jīng)皮給藥.因此，所得MXD-SLN制劑性能良好，在局部用藥上具有良好的發(fā)展前景.

關(guān)鍵詞：米諾地爾；高壓均質(zhì)法；固體脂質(zhì)納米粒；透皮實(shí)驗(yàn)

米諾地爾(Minoxidil, MXD)是近年來(lái)使用較多的生發(fā)藥物，廣泛用于治療雄性激素性脫發(fā)[1-2].但米諾地爾在水中的溶解度很小，市售制劑常包含較高濃度的乙醇或丙二醇，頻繁使用易導(dǎo)致頭屑增加、頭皮瘙癢、頭發(fā)容易油膩、皮膚紅腫、皮膚干燥、過(guò)敏性接觸性皮炎以及系統(tǒng)毒性等不良反應(yīng).為降低市售制劑不良反應(yīng)，考慮制備不含有機(jī)溶劑的MXD固體脂質(zhì)納米粒[3].固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)是20世紀(jì)90年代初迅速發(fā)展起來(lái)的第一代脂質(zhì)納米粒給藥系統(tǒng)[4]，是將固態(tài)的脂質(zhì)或類(lèi)脂質(zhì)加入到含有乳化劑的水相中，通過(guò)合適的工藝條件，包裹藥物進(jìn)入脂質(zhì)，形成粒徑范圍為10～1 000 nm的固體脂質(zhì)納米粒給藥體系[5].固體脂質(zhì)納米粒在局部用藥方面展現(xiàn)了突出的優(yōu)勢(shì)，它能保護(hù)敏感性藥物，有較好的靶向作用，無(wú)有機(jī)溶劑制備工藝，系統(tǒng)毒性低，生物相容性好，SLN是一種極具發(fā)展前景的給藥系統(tǒng)[6].

1儀器與材料

1.1儀器

Beckman Delsa Nano激光粒度儀(美國(guó)Beckman公司)；FJ200數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)(美國(guó)Newton公司)；JEM-1400透射電鏡(日本JEOL公司)；Micro Ultracentrifuge高速離心機(jī)(日本Hitachi Koki有限公司)；TPY-2型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；島津高效液相色譜(日本Shimadzu公司)；AR-1140型電子分析天平(美國(guó)奧毫斯公司).

1.2材料

油酸(杭州雙林化工試劑廠)；硬脂酸(浙江溫州化學(xué)用料廠)；吐溫80和司盤(pán)80(溫州清明化工有限公司)；米諾地爾(臺(tái)州晟欣醫(yī)藥化工有限公司)；甲醇(西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)；磺基丁二酸鈉二辛酯(阿拉丁股份有限公司)，其他試劑皆為分析純.

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1米諾地爾含量測(cè)定方法

2.1.1色譜條件

色譜柱：ODS-C18柱；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)∶V(冰醋酸)=700∶300∶10)，1 000 mL流動(dòng)相中含有3.0 g磺基丁二酸鈉二辛酯，并用高氯酸調(diào)節(jié)pH=3.0；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；流速1 mL /min；進(jìn)樣體積10 μL.

2.1.2方法專屬性

精密移取MXD-SLN懸液，加甲醇溶液，超聲條件下破乳溶解，用甲醇稀釋定容至刻度，即得MXD-SLN供試品溶液.同法制得空白SLN供試品溶液.按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，考察方法的專屬性.

2.1.3線性關(guān)系考察

精密稱取米諾地爾適量，純化水溶解后，置于容量瓶中，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為498 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別1.99，4.98，9.96，19.92，39.84，59.76，79.68 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各溶液的峰面積.

2.2米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒的制備

采用高壓均質(zhì)法制備米諾地爾SLN.精密稱取6 g硬脂酸，0.25 g司盤(pán)80和0.75 g吐溫80，80 ℃下加熱熔融形成油相，精密稱取1 g米諾地爾溶解于油相中.另取純化水加熱至85 ℃作為水相.在2 000 r/min攪拌下，將水相快速加入油相中，繼續(xù)攪拌5 min，即可形成初乳.制備所得初乳在10 000 r/min下高速分散1 min，再用高壓均質(zhì)機(jī)在20 000 psi壓力下作用2個(gè)循環(huán)，冰水浴冷卻過(guò)夜即得2%米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒(MXD-SLN).

2.3粒徑和Zeta電位

室溫條件下，取新制備的MXD-SLN適量，純化水適當(dāng)稀釋后，采用Beckman激光粒度測(cè)定儀測(cè)定其平均粒徑、粒徑分布和Zeta電位[7].

2.4包封率和載藥量的測(cè)定

采用高速離心法和低速離心法相結(jié)合的方法測(cè)定[8].精密移取MXD-SLN懸液1mL置于離心管中，在100 000r/min，4 ℃條件下高速離心5h.移取上清液，用甲醇適當(dāng)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離藥量W1；精密移取MXD-SLN懸液1mL置于離心管中3 000r/min離心15min，取沉淀并用甲醇適當(dāng)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算游離藥量W2.另精密移取MXD-SLN懸液按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定藥物濃度，計(jì)算總藥量W3.包封率(EE)和載藥量(DL)計(jì)算公式分別為

式中：W1，W2分別為游離藥量；W3為總藥量；W4為脂質(zhì)質(zhì)量.

2.5體外釋藥

將處理好的半透膜固定于Franz擴(kuò)散池中間，于供給室加入1mL的MXD-SLN懸液，接收室加入磷酸緩沖液(pH=7.4)，半透膜與接收液完全接觸.藥物擴(kuò)散透皮儀轉(zhuǎn)速為200r/min，擴(kuò)散面積2.8cm2，接收池總體積為6.5mL，37 ℃下循環(huán)水浴.在固定時(shí)間間隔取出全部接收液并立即補(bǔ)加等量同溫磷酸緩沖液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算藥物累積釋放百分率(Q)[9].

2.6透皮實(shí)驗(yàn)

將健康大鼠處死，剪取適當(dāng)大小的腹部皮膚，剝離皮下組織，用生理鹽水沖洗干凈，檢查鼠皮完整性后保存在4 ℃冰箱.藥物擴(kuò)散透皮儀其接收液為磷酸緩沖液，32 ℃下循環(huán)水浴.實(shí)驗(yàn)時(shí)，取出處理好的完整鼠皮，固定于Franz擴(kuò)散池中間，將磁力攪拌子裝入接收室中，注滿磷酸緩沖液，小心排出氣泡使接收液和鼠皮充分接觸.移取MXD-SLN懸液緩慢加入到供給室中的皮膚表面，供給室上用保鮮膜封口.開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器和恒溫水浴，在固定時(shí)間間隔取出全部接收液，立即重新注滿新鮮接收液，樣品10 000 r/min離心15 min后取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定.

3結(jié)果與討論

3.1米諾地爾含量測(cè)定方法

3.1.1線性關(guān)系

以峰面積(A)對(duì)米諾地爾的質(zhì)量濃度(C，μg/mL)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=56 176C-17 111(r=0.999 7)，表明在1.99～79.68 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與米諾地爾質(zhì)量濃度的線性關(guān)系良好.

3.1.2專屬性

米諾地爾對(duì)照品、空白SLN和MXD-SLN供試液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1，從圖1中可看出：輔料對(duì)藥物的測(cè)定無(wú)干擾.

圖1　HPLC色譜圖Fig.1　The chromatogram of HPLC

3.2MXD-SLN粒徑，Zeta電位測(cè)定

目前，制備SLN的方法主要有高壓均質(zhì)法、超聲法、乳化溶劑法、熔融法以及微乳化法等[10-11].溶劑擴(kuò)散法制備SLN，其制備工藝難控制，且粒徑分布過(guò)寬[12].高壓均質(zhì)法是制備SLN最常用的方法，通過(guò)高壓乳勻法能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，極具發(fā)展前景，故本研究采用高壓乳勻法來(lái)制備MXD-SLN.采用Beckman激光粒度測(cè)定儀測(cè)得按2.2所示最佳工藝制得MXD-SLN懸液的平均粒徑為(422.2±10.2) nm(圖2)，PDI為(0.210±0.024)，平均Zeta電位為(-31.29±3.20) mV，從圖2中可以看出：本法所得的MXD-SLN粒徑較均一，基本呈正態(tài)分布，且制備所得納米懸液的電位較大，表明具有較高的穩(wěn)定性.

圖2　MXD-SLN粒徑分布圖Fig.2　The particle distribution of MXD-SLN

3.3MXD-SLN包封率和載藥量

通過(guò)分離包裹在SLN中的藥物和游離的藥物測(cè)定包封率和載藥量.分離方法通常有超速離心法、低速離心法、葡聚糖凝膠過(guò)濾法以及透析法[13].超速離心法操作簡(jiǎn)單快速而被廣泛應(yīng)用，在超速離心管中加入懸液，利用高速旋轉(zhuǎn)下產(chǎn)生的離心力將納米粒和游離藥物分離[14].由于米諾地爾在介質(zhì)中的溶解度較小，當(dāng)藥物的包封率小于83%時(shí)，有部分游離的藥物將會(huì)析出，可通過(guò)低速離心將其沉淀下來(lái).因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將低溫超速離心法和低速離心法相結(jié)合的方法來(lái)測(cè)定包封率.該法測(cè)得按2.2所示最佳工藝制得MXD-SLN包封率為(66.34±1.42)%，載藥量為(8.12±0.23)%，表明所得產(chǎn)品的包封率和載藥量均較高.

3.4體外釋藥

MXD-SLN在Franz擴(kuò)散池中的藥物釋放如圖3所示.從圖3中可以看出：MXD-SLN具有良好的緩釋效果，在24 h內(nèi)僅釋放19.0%的藥物.前5 h的藥物釋放較快，主要是由于SLN中的游離藥物及吸附在SLN表面的藥物首先釋放[14].分別采用不同的方程對(duì)MXD-SLN的體外釋放曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)表1.從表1中可以看出：Higuchi模型擬合R值最優(yōu)，MXD在SLN中的體外釋藥行為符合Higuchi模型[15].

表1藥物釋放模型擬合

Table 1Mathematical models used to describe the in vitro release of drug

模型擬合方程R零級(jí)動(dòng)力學(xué)Q=0.0073t+0.03170.9642一級(jí)動(dòng)力學(xué)ln(1-Q)=-0.0081t-0.03110.9718HiguchiQ=0.0411t1/2-0.01190.9982Ritger-peppaslnQ=0.6705lnt-3.65710.9923

圖3　藥物在磷酸緩沖液中從MXD-SLN中的釋放曲線Fig.3　In vitro release profiles of MXD from MXD-SLN in PBS

3.5大鼠透皮實(shí)驗(yàn)

米諾地爾治療脫發(fā)的傳統(tǒng)劑型常含有較高的有機(jī)溶劑，頻繁使用易導(dǎo)致不良反應(yīng).SLN是用于經(jīng)皮給藥的良好載體，其采用生物相容性好、易降解、載藥能力強(qiáng)的類(lèi)脂材料為載體，無(wú)有機(jī)溶劑制備工藝，相較于傳統(tǒng)劑型能顯著降低皮膚刺激性.并且通過(guò)脂類(lèi)的包裹可以保護(hù)化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的藥物，其特殊的性能結(jié)構(gòu)能使藥物較多地滯留在皮膚內(nèi)，從而避免藥物的系統(tǒng)毒副作用.MXD-SLN懸液大鼠透皮累積釋放曲線見(jiàn)圖4.MXD-SLN主要通過(guò)融合和穿透機(jī)制進(jìn)入皮膚，需要一定的分配和透過(guò)時(shí)間.在滲透前期藥物的滲透速率較快，12 h后藥物的滲透速率減慢，與體外釋放結(jié)果一致，可能由于SLN中游離藥物及吸附在SLN表面的藥物首先透過(guò)導(dǎo)致.

圖4　藥物從MXD-SLN中透過(guò)大鼠皮膚的累積透過(guò)量Fig.4Percutaneous permeation profiles of MXD-SLN through the excised rat skins

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高壓均質(zhì)法成功制備了米諾地爾固體脂質(zhì)納米粒，實(shí)驗(yàn)確定的處方為6 g硬脂酸，0.25 g司盤(pán)80，0.75 g吐溫80和2%米諾地爾.所制得的MXD-SLN平均粒徑為(422.2±10.2) nm，PDI為(0.210±0.024)，平均Zeta電位為(-31.29±3.20) mV，包封率為(66.34±1.42)%，載藥量為(8.12±0.23)%.MXD-SLN具有良好的緩釋性能，其體外釋藥行為符合Higuchi模型.大鼠透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MXD-SLN能透過(guò)大鼠皮膚，適合經(jīng)皮給藥.本實(shí)驗(yàn)的研究為該類(lèi)新劑型的進(jìn)一步研究和改進(jìn)提供了一些有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：陳石平)

The preparation and evaluation of minoxidil loaded solid lipid nanoparticles

WANG Wenxi1, CHEN Lina1, HUANG Xinyan2

(1.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;2.Dermatology Department, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310014, China)

Abstract:In order to prepare minoxidil loaded solid lipid nanoparticles(MXD-SLN) and evaluate its quality and skin permeation, the MXD-SLN was prepared by a hot high pressure homogenization method, in which stearic acid was used as solid lipid while tween 80 and span 80 were used as surfactant. The particle size and zeta potential of SLN was measured with a DelsaTM Nano C Particle Analyzer. The entrapment efficiency (EE) and drug loading capacity (DL) of MXD in SLN dispersions were determined by a centrifugation method. In vitro drug release and skin permeation were conducted using transdermal diffusion test apparatus. The average particle size was (422.2±10.2) nm with PDI of (0.210±0.024) and the zeta potential was (-31.29±3.20) mV. The average EE and DL of MXD-SLN dispersions were (66.34±1.42)% and (8.12±0.23)%, respectively. The in vitro drug release test indicated that the MXD-SLN has a sustained-release performance. Moreover, the skin permeation study showed that SLN is suitable for the transdermal administration. All these results demonstrate the developed MXD-SLN possesses satisfactory qualities and a better application prospect.

Keywords:minoxidil; high pressure homogenization method; solid lipid nanoparticles; skin permeation test

收稿日期：2015-11-20

作者簡(jiǎn)介：王文喜(1977—)，男，浙江蒼南人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究，E-mail：yjw@zjut.edu.cn.

中圖分類(lèi)號(hào)：R944

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-4303(2016)04-0427-04