錢俊青，黃　琪，竺少敏

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

楊梅素脂質體的體外釋放及體內(nèi)吸收實驗研究

錢俊青，黃琪，竺少敏

(浙江工業(yè)大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

摘要：為考察楊梅素脂質體體外釋放度及體內(nèi)吸收狀況，采用薄膜-超聲分散法制備楊梅素脂質體，以質量分數(shù)為5%的SDS為溶出介質進行楊梅素脂質體體外釋放度實驗，以大鼠腸灌流法進行楊梅素脂質體的體內(nèi)藥代動力學研究.實驗表明：楊梅素脂質體體外釋放遵循Higuchi模型，有緩釋作用；大鼠腸灌流楊梅素吸收狀況為被動吸收，與楊梅素原料藥相比，楊梅素脂質體吸收速率和消除速率均顯著提高，藥物的半衰期減小.因此楊梅素脂質體制劑相比原料藥能更好地發(fā)揮藥效.

關鍵詞：楊梅素;脂質體;體外釋放;腸灌流

楊梅素存在于楊梅樹葉和樹皮中[1]，具有抗菌、降血糖、降血壓、抗炎、防止血小板聚集、抗突變和抗氧化[2-8]等多種功效.歐洲一些國家已經(jīng)將楊梅素作為保健食品上市；美國FDA也批準楊梅素應用于醫(yī)藥、保健食品和化妝品；歐美國家將楊梅素用作適合特殊人群消炎的添加劑[9].但由于楊梅素的穩(wěn)定性差、水溶困難和味苦等缺陷，對其應用帶來很大局限性，因此將楊梅素制備成適宜的劑型，提高穩(wěn)定性，能夠改善楊梅素的應用.脂質體是將功能成分包封于類脂質雙分子層薄膜中所制成的超微型球狀載體劑型[10]，可以防止成分的失活以及提高生物利用度[11].目前制備固體脂質體有多種方法[12]，其中薄膜-超聲分散法制備脂質體工藝過程簡單、能耗小及成本低，更易于工業(yè)化[13].現(xiàn)在脂質體已經(jīng)被廣泛應用于傳統(tǒng)中藥、抗生素、食品及化妝品[14-17]中.脂質體因其類細胞膜結構，使得脂質體口服制劑具有更好的安全性和生物相容性[18].

口服脂質體在胃腸道的釋放度直接影響藥物的生物利用度，一般采用藥物體外釋放度實驗來模擬人體內(nèi)胃腸道消化條件下測定藥物釋放速率,預測藥物在體內(nèi)的釋放和吸收[19]，是幫助了解制劑的生物藥劑學特點，篩選緩控釋制劑處方的重要手段[20].因此測定藥物釋放度對控制藥物的質量具有重要的意義.口服脂質體的主要吸收部位是小腸，腸道中的吸收也是決定藥物生物利用度的重要因素[21]，藥物吸收不僅依賴藥物理化性質，還有很多影響因素[22].因此探討藥物在小腸內(nèi)吸收機制對提高藥物的生物利用度和藥效具有重要意義.評價藥物在腸道吸收的方法有離體法、在體法和體內(nèi)法[23-24]，在眾多方法中,在體法因不損害研究部位的淋巴和循環(huán)系統(tǒng)且方法簡單而明顯優(yōu)于其他2種方法，他能夠反映腸管內(nèi)的真實生存環(huán)境，且實驗技術已經(jīng)成熟.ZHAO等研究發(fā)現(xiàn)藥物在大鼠體內(nèi)吸收與人體內(nèi)吸收存在高度相關性，可以用大鼠代替人體進行臨床前口服藥物吸收的研究[25].本實驗以楊梅素脂質體為對象，測定其體外釋放度，研究其體外釋放規(guī)律；同時采用大鼠在體腸灌流法對楊梅素原料藥及楊梅素脂質體的吸收動力學進行研究，通過測量灌流前后腸腔內(nèi)藥物濃度的變化來考察藥物的小腸吸收狀況，為研制楊梅素脂質體口服制劑提供制劑學基礎.

1材料與方法

1.1材料

楊梅素(質量分數(shù)為98.1%)，浙江省寧波市中藥制藥有限公司；大豆卵磷脂(質量分數(shù)為70%)，江蘇曼氏生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，國藥集團化學試劑有限公司；酚紅，上海試劑三廠；SD大鼠，體重(200±20) g，雄老鼠，浙江省醫(yī)學科學院動物中心提供；其他試劑均為分析純.

1.2儀器與設備

752型紫外可見光度計，上海光譜儀器有限公司；SP-2500雙光束紫外分光光度計，蘇州市萊頓科學儀器有限公司.

1.3楊梅素脂質體制備

精密稱取20 mg楊梅素、質量分數(shù)為70%的大豆卵磷脂和載體材料于梨形燒瓶中，單硬脂酸甘油酯為載體，m(質量分數(shù)為70%的卵磷脂)∶m(載體)=1∶1，加入10 mL無水乙醇使三者充分溶解,置于旋轉蒸發(fā)器中，0.085 MPa真空度65 ℃下減壓回收乙醇成膜，然后加入60 mL質量分數(shù)為0.06%的吐溫40水溶液，使膜溶解分散并且充分水合，800 W超聲10 min，最終形成楊梅素脂質體.用激光粒徑分析儀測得楊梅素脂質體平均粒徑為(145.1±33.4) nm(多分散系數(shù)為0.281)，zeta電位為-36.62 mV.

2實驗方法

2.1體外釋放度實驗

2.1.1楊梅素體外釋放含量測定方法

楊梅素的結構式為

采用分光光度法測定楊梅素含量.通過楊梅素全波段掃描，確定357 nm為吸收波長，稱取楊梅素無水乙醇溶解定容，配置成一系列標準溶液，在357 nm波長下檢測吸光度，繪制標準曲線，得到回歸方程：A=0.051C+0.005 9(R2=0.999 5)，在2～14 μg/mL范圍內(nèi)，線性相關性良好.

2.1.2體外釋放度的測定方法

取適量的楊梅素脂質體及等劑量的楊梅素原料藥，分別裝于透析袋中，將透析袋兩頭扎緊，置于質量分數(shù)為0.5%的SDS介質溶液中(通過一系列濃度的SDS溶液的篩選，質量分數(shù)為0.5%的SDS溶液可滿足體外釋放及漏槽條件)，按照50 r/mim，(37±2) ℃水浴恒溫，定時取樣，同時加入等量的空白釋放介質，則楊梅素累積釋藥百分率計算式為

楊梅素累積釋放量：

Qn=Cn×V+∑Ci×Vs

(1)

楊梅素累積釋藥百分率：

P=Qn/Q0×100%

(2)

式中：Cn為第n次取樣點時的楊梅素濃度；Ci第i次取樣點時楊梅素濃度；V為溶出介質體積；Vs為每次的取樣體積；Q0為初始楊梅素的量.

用釋放模型方程對藥物0～96 h的體外累計釋放數(shù)據(jù)進行擬合,以此描述楊梅素脂質體制劑的體外釋放規(guī)律.

2.2大鼠在體腸吸收實驗

2.2.1腸循環(huán)液中楊梅素含量的測定方法

為了避免實驗過程中小腸吸收和分泌的水分對藥物濃度造成的影響，通過加入“標示物”來測定水分的變化進行校正[26]，同時采用雙波長等吸收消除酚紅對楊梅素紫外吸收的干擾[27].

取200 mg/L酚紅供試液、楊梅素脂質體溶液、含酚紅的楊梅素脂質體溶液以及在大鼠體內(nèi)腸循環(huán)2 h的K氏營養(yǎng)液，于200～600 nm紫外掃描.結果表明酚紅、輔料和腸循環(huán)液分別在楊梅素596，357 nm特征吸收峰處對其沒有干擾.故選擇357 nm為檢測波長，596 nm為參比波長，△A=A357-A596為定量信息測定楊梅素的含量.以△A對楊梅素質量濃度C進行線性回歸，得標準曲線△A=0.042 2C+0.173 6(R2=0.999 8)，在0.5～14 mg/L線性范圍內(nèi)相關性良好.

2.2.2楊梅素脂質體在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性

楊梅素脂質體在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性直接影響實驗的準確性，需要對其穩(wěn)定性進行考察.取30 mL楊梅素脂質體溶液，加入200 mg/L酚紅溶液和K氏營養(yǎng)液，用空白腸循環(huán)液定容至60 mL，配置成供試液.37 ℃恒溫水浴2 h，分別在0，1，2 h測定供試液中的楊梅素濃度.

2.2.3腸壁物理吸附的影響

腸壁絨毛可能會因為吸附楊梅素和酚紅對實驗結果造成影響，需要測定腸壁物理吸附影響的大小.取大鼠小腸，清洗后置于60 mL 供試液中.在37 ℃的恒溫振蕩儀中2 h，分別在0，1，2 h測定供試液中楊梅素及酚紅濃度.

2.2.4大鼠在體腸灌流實驗

取SD雄性大鼠，禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，麻醉后固定在手術臺板上紅外燈照射保持37 ℃體溫.采用全腸段回流，沿腹中線剪開腹部約4 cm，取出十二指腸上部至回腸下部腸段，兩端切口后分別插管并結扎.用37 ℃生理鹽水、K氏營養(yǎng)液依次沖洗腸道內(nèi)容物后，將插管與恒流泵連接形成回路.以5 mL/min流速將供試液在回路中循環(huán)10 min再調至2.5 mL/min，分別在0，15，30，45，60，90，120 min時取1 mL和0.5 mL樣各一份，同時補加1.5 mL的37 ℃的K氏營養(yǎng)液，取樣7次.實驗裝置見圖1所示.

圖1　在體小腸吸收實驗裝置Fig.1　In situ intestinal absorption experimental facility

以小腸剩余藥量的對數(shù)(lnX)對取樣時間(t)做圖得吸收曲線，從吸收曲線可得出速率常數(shù)(Ka)和相關系數(shù)(r)，吸收半衰期(t1/2)和單位時間吸收率(P)計算式為

吸收半衰期:

t1/2=0.063 9/Ka

(3)

單位時間吸收率:

P=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)

(4)

式中：Ka為吸收速率常數(shù)；C0為灌注液中藥物初始質量濃度；Ct為t時刻灌注液中藥物質量濃度；V0為灌注液初始體積；Vt為t時刻灌注液體積.

3實驗結果與討論

3.1體外釋放度實驗結果

在(37±2) ℃恒溫，質量分數(shù)為0.5%的SDS釋放介質中加入楊梅素脂質體，相同條件進行三組實驗，以楊梅素原料藥為對照，得到體外累積釋放曲線，如圖2所示.

圖2　楊梅素及楊梅素脂質體體外釋放曲線Fig.2　Releasing curves of Myricetin and Myricetin liposome in vitro

由圖2可知：從12 h開始楊梅素原料藥和楊梅素脂質體的釋放規(guī)律逐漸出現(xiàn)差異：楊梅原料藥釋放速度加快，48 h后累積釋藥百分率已達到100%；楊梅素脂質體累積釋藥百分率平穩(wěn)增加，96 h后，藥物釋放量只達到30%.說明楊梅素制備成脂質體后藥物呈緩慢持續(xù)釋放.

分別按照零級動力學模型、一級動力學模型和Higuchi方程模型進行擬合，求出相關系數(shù)r、釋放常數(shù)K及SD值.比較楊梅素原料與楊梅素脂質體的體外釋放規(guī)律，結果如表1所示.

表1　楊梅素及楊梅素脂質體在0.5%的SDS釋放介質中釋放的藥動學擬合

注:1) 代表零級動力學的釋放常數(shù)；2) 代表Higuchi方程的Higuchi系數(shù).

由表1可知：楊梅素原料藥遵循零級動力學規(guī)律釋放；楊梅素脂質體Higuchi方程模型擬合的相關系數(shù)r最大，遵循Higuchi規(guī)律釋放，符合緩釋制劑的釋藥要求.因此將楊梅素制備成楊梅素脂質體之后，減慢了藥物的釋放速度，延長了藥物在體內(nèi)的滯留時間，有利于提高藥效.三組脂質體的平行實驗SD值為1.9，說明實驗結果穩(wěn)定.

3.2楊梅素脂質體在空白腸循環(huán)液中的穩(wěn)定性結果

將楊梅素脂質體溶液在37 ℃恒溫水浴放置2 h，分別在0，1，2 h時測定楊梅素濃度，實驗結果表明，與0 h相比，1 h后楊梅素的質量分數(shù)降低1.3%，2 h后楊梅素的質量分數(shù)降低3.8%，可能由于楊梅素自身降解導致.因此認為2 h內(nèi)楊梅素脂質體在空白腸循環(huán)液中較穩(wěn)定，不會干擾腸灌流實驗.

3.3腸壁物理吸附的影響結果

大鼠小腸浸泡在37 ℃的60 mL供試液中，分別在0，1，2 h時測定楊梅素濃度，實驗結果表明：與0 h相比，1 h后楊梅素的質量分數(shù)降低0.9%，2 h后楊梅素的質量分數(shù)降低3.0%，可能由于楊梅素自身降解導致，由此推測腸壁對楊梅素脂質體無物理吸附；與0 h相比，1 h后酚紅的質量分數(shù)不變，2 h后酚紅的質量分數(shù)僅微量減少0.3%，可認為無變化，故腸壁對酚紅無物理吸附.綜上所述，大鼠小腸壁對楊梅素和酚紅均無物理吸附，不會影響二者含量的測定.

3.4大鼠在體腸灌流實驗結果

通過對大鼠小腸剩余藥量的測定，得到楊梅素脂質體與楊梅素原料膠束溶液在大鼠小腸2 h吸收曲線，如圖3所示.

由圖3可知：楊梅素脂質體的透過速率方程為lnX=7.538 4-0.003 4t，楊梅素原料的透過速率方程為lnX=7.576 7-0.000 9t，與表觀一級速度方程lnX-lnX0-Kat線性吻合，因此楊梅素的吸收為被動轉運，依靠生物膜兩側的藥物濃度梯度被吸收，不需要載體和能量.由吸收曲線得到吸收速率常數(shù)Ka、相關系數(shù)r、吸收半衰期t1/2以及單位時間吸收率P，見表2.

圖3　楊梅素脂質體與楊梅素原料體內(nèi)吸收曲線(n=7)Fig.3　Absorption cure of Myricetin liposomes and myricetin in rat(n=7)

Table 2The results of Myricetin microcapsules and myricetin within micellar in intestine absorption

樣品Ka吸收率P/%t1/2/min相關系數(shù)r楊梅素脂質體3.4×10-336.32040.9634楊梅素9.0×10-410.27700.9558

實驗結果顯示：與楊梅素原料藥相比，楊梅素脂質體在小腸吸收速率常數(shù)Ka和吸收率P均顯著提高，說明經(jīng)脂質體化楊梅素更容易被在體吸收；計算得到的楊梅素脂質體吸收半衰期明顯少于楊梅素原料藥，可以預測經(jīng)脂質體化的楊梅素在體內(nèi)消除速率加快.

4結論

本實驗以實驗室制備的楊梅素脂質體為研究對象，考察其體外釋放規(guī)律和體內(nèi)吸收狀況.實驗結果表明：楊梅素脂質體遵循Higuchi規(guī)律緩慢持續(xù)釋放，延長了藥物在體內(nèi)的滯留時間，有利于提高藥效；楊梅素在體內(nèi)的吸收為被動轉運，與楊梅素原料藥相比，脂質體化的楊梅素在體內(nèi)吸收速度和消除速度均明顯增大.說明經(jīng)脂質體化的楊梅素更容易被吸收，有利于提高藥效.本實驗為今后制造口服楊梅素脂質體提供了制劑理論基礎.

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(責任編輯：陳石平)

Study on release characteristic and pharmacokinetics property of Myricetin liposome

QIAN Junqing, HUANG Qi, ZHU Shaomin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:In order to investigate the release and absorption mechanism of Myricetin liposome, the Myricetin liposome was prepared using a dried film-ultrasonic procedure, the release characteristic of the Myricetin liposomes was then studied by the dissolution media of 5% SDS in vitro, and the pharmacokinetics property was finally evaluated by rat intestinal perfusion studies. A sustained release trend was found for Myricetin liposomes by following Higuchi law in release experiments. Myricetin liposome had a passive absorption mechanism in rat intestinal, absorption and elimination rate of Myricetin liposome were improved compared with Myricetin. And half-life of durg was obviously increased. The oral liposome formulation of Myricetin has a better efficacy as compared to Myricetin.

Keywords:Myricetin; liposome; release; intestinalperfusion

收稿日期：2015-12-22

作者簡介：錢俊青(1964—)，男，浙江紹興人，教授，博士，主要從事天然藥物資源利用技術研究，E-mail：qjq@zjut.edu.cn.

中圖分類號：R944

文獻標志碼：A

文章編號：1006-4303(2016)04-0422-05