徐嘉輝 黃雪君 曾巧煌 藍(lán)燕嬌 張曉露 余德釗

摘要：目的 觀察大桑菊合劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性肝損傷的影響，探討其抗炎免疫的作用機制。方法 采用腹腔注射環(huán)磷酰胺處理后，予2，4，6-三硝基氯苯2次外涂腹部皮膚致敏，再經(jīng)皮肝穿刺攻擊造模。實驗小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥高、中、低劑量組。中藥高、中、低劑量組給予大桑菊合劑灌胃，每日1次，連續(xù)7 d。ELISA檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平，HE染色觀察肝臟組織病理形態(tài)。結(jié)果 與正常組比較，模型組AST、ALT和TNF-α水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組ALT、AST和TNF-α水平顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；中藥各劑量組較模型組均能減輕肝組織局部炎癥浸潤與水腫。結(jié)論 大桑菊合劑對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)性肝損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：大桑菊合劑；遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；肝損傷；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.019

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0074-03

Protective Effects of Dasangju Mixture on Liver Injury Induced by Delayed-type Hypersensitivity in Mice XU Jia-hui1， 2， HUANG Xue-jun1， ZENG Qiao-huang1， LAN Yan-jiao1， ZHANG Xiao-lu1， YU De-zhao2 （1. The Second Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China； 2. Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effects of Dasangju Mixture on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice； To discuss its mechanism of anti-inflammatory-immunity. Methods After enterocoelia intravenous injection of cyclophosphamide was used， 2，4，6-picryl chloride was used twice for exterior coating for skin of abdomen to cause sensation of skin. Then percutaneous transhepatic puncture was used to attack for modeling. Male Kunming mice were randomly divided into blank group， model group， high-， medium- and low-dose treatment groups. The high-， medium- and low-dose treatment groups were given Dasangju Mixture for gavage， once a day for 7 days. ELISA was applied to determine the serum levels of aspartate aminotransferase （AST）， alamine aminotransferase （ALT） and tumor necrosis factor （TNF）-α. Pathological features of liver tissue were observed by HE staining. Results Compared with the blank group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the model group increased significantly （P<0.05）； Compared with the model group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the high-， medium- and low-dose treatment groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01， P<0.001）； Compared with the model group， high-， medium- and low-dose treatment groups can better alleviate topical inflammation infiltration and edema of liver tissue. Conclusion Dasangju Mixture has certain protective effects on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice.

Key words： Dasangju Mixture； delayed-type hypersensitivity； liver injury； mice

藥物性肝損害是兒童常見的藥物不良反應(yīng)之一，世界衛(wèi)生組織個例安全性病例報告數(shù)據(jù)庫中報道，兒童藥物肝損害占其他類型的損害1%，常見藥物有撲

基金項目：廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313646）；廣東省中醫(yī)藥局科技項目（20120108）

通訊作者：余德釗，E-mail：928279647@qq.com

熱息痛、紅霉素等[1]。肺炎支原體肺炎是兒童社區(qū)獲得性肺炎常見病之一，其首選藥物是大環(huán)內(nèi)酯類藥物，如阿奇霉素等[2]。然而，研究表明阿奇霉素序貫治療小兒肺炎支原體肺炎與藥物性肝炎有一定相關(guān)性，年齡越小相關(guān)性越大[3]。大桑菊合劑是我們的臨床驗方，其聯(lián)合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎能夠明顯縮短療程，降低胃腸道及肝損害等不良反應(yīng)發(fā)生率，且能雙向調(diào)控促炎因子白細(xì)胞介素（IL）-6與抑炎因子IL-10，其作用機制與免疫調(diào)控相關(guān)[4]。為此，我們通過大桑菊合劑對遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）性肝損傷動物模型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的作用，觀察大桑菊合劑對小鼠DTH性肝損傷的影響，探討其抗炎免疫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性昆明種小鼠50只，6～8周齡，體質(zhì)量16～18 g，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，許可證號SCXK（粵）2013-0034。飼養(yǎng)于（22±2）℃相對恒溫環(huán)境，濕度60%～80%，自由飲食。

1.2 藥物

大桑菊合劑（桑葉3 g，菊花3 g，浙貝母2 g，甘草1 g，黃芩3 g，薄荷 1g，魚腥草2 g，連翹2 g，青天葵1 g，蘆根2 g，桔梗2 g），廣州市康源藥業(yè)有限公司，10 mL/支，批號20141001。

1.3 主要試劑與儀器

2，4，6-三硝基氯苯（PCl，深圳伽馬生物有限公司），環(huán)磷酰胺（Sigma公司），AST、ALT、TNF-α小鼠ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。RAD680酶標(biāo)儀（美國伯樂），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯），冷凍高速離心機（Sigma公司）。

1.4 造模

刮去小鼠腹毛，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉；經(jīng)腹腔注射予200 mg/kg環(huán)磷酰胺致小鼠免疫抑制。1 d后予1%PCl的乙醇溶液100 μL腹部暴露皮膚致敏，5 d后再次同樣致敏，再5 d后，用0.2%PCl的橄欖油溶液10 μL肝內(nèi)注射，造成PCl-DTH模型。

1.5 分組、給藥及處理

實驗小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥低、中、高劑量組，每組10只。劑量采取體表面積法估算，中藥低、中、高劑量組給予相應(yīng)劑量大桑菊合劑灌胃，均定容至0.6 mL，高劑量（8.60 g/kg）相當(dāng)于18歲以上劑量，中劑量（4.30 g/kg）相當(dāng)于3～18歲劑量，低劑量（2.10 g/kg）相當(dāng)于3歲以下劑量；模型組與空白組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥18 h后進(jìn)行常規(guī)麻醉及腹腔采血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，取血清后備測。脫頸處死小鼠，取左葉局部病變組織，10%福爾馬林液固定備用。

1.6 小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取約2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm肝臟局部病變組織進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋，制成切片。HE染色鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。參照文獻(xiàn)[5]對肝組織病理形態(tài)改變進(jìn)行評價。按病變程度進(jìn)行計分：0分，輕微改變；1分，輕中度改變；2分，中度改變；3分，中重度改變；4分，重度改變。

1.7 指標(biāo)檢測

于酶標(biāo)儀波長450 nm處，ELISA測定ALT、AST，于酶標(biāo)儀波長490 nm處，ELISA測定TNF-α，均嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用t檢驗或秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大桑菊合劑對小鼠肝組織病理形態(tài)的影響

正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞輕微水腫，核結(jié)構(gòu)清晰，肝竇正常；模型組小鼠肝細(xì)胞彌漫性水腫，胞漿疏松化，胞質(zhì)色淡，肝細(xì)胞點狀壞死，散在有炎性細(xì)胞浸潤；大桑菊合劑高、中、低劑量組均較模型組小鼠肝臟狀況明顯改善。結(jié)果見圖1、表1。

2.2 大桑菊合劑對模型小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清AST、ALT水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠血清AST、ALT水平顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結(jié)果見表2。

2.3 大桑菊合劑對模型小鼠血清腫瘤壞死因子-α水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠血清TNF-α含量顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結(jié)果見表3。

正常組 模型組 中藥低劑量組

中藥中劑量組 中藥高劑量組

圖1 各組小鼠肝組織病理形態(tài)（HE染色，×200）

3 討論

PCl-DTH小鼠動物模型是由活化的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)實驗性肝損傷模型[6]。同時，相關(guān)細(xì)胞因子如IL、TNF-α起重要的調(diào)節(jié)作用；其中，TNF-α劑量依賴性地促進(jìn)抗原攻擊18 h后T細(xì)胞的黏附能力，并且這種促進(jìn)作用明顯高于對脾總淋巴細(xì)胞的作用；T細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附能力受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)而上升可能是DTH初期的細(xì)胞病理學(xué)特征之一。

實驗結(jié)果表明，大桑菊合劑能明顯改善肝細(xì)胞局部炎癥浸潤水腫，既可以顯著降低血清ALT、AST水平，又能減少Th1型細(xì)胞因子TNF-α含量，提示其可能對Th1細(xì)胞介導(dǎo)的DTH初期具有調(diào)節(jié)的作用。

大桑菊合劑由桑葉、菊花、浙貝母、甘草、黃芩、薄荷、魚腥草、連翹、青天葵、蘆根、桔梗等中藥經(jīng)乙醇提取制成，為古方桑菊飲加減而得，長期運用于治療兒童呼吸道疾病。方中黃芩有效成分黃芩苷具有抗炎抑菌、抗病毒、清除自由基以及抗腫瘤等作用，且能對肝臟和免疫系統(tǒng)起到保護(hù)作用[7]；連翹有效成分連翹苷元對四氯化碳誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用，能夠明顯降低血清TNF-α、IL-8水平[8]。另外，我們前期研究表明，大桑菊合劑具有明顯的抗炎抑菌作用，聯(lián)合阿奇霉素治療肺炎支原體具有顯著療效；同時能夠明顯降低Th2細(xì)胞因子IL-6與IL-10的血清濃度水平[4]。另有研究表明，IL-6在變態(tài)反應(yīng)性肝損傷初期作用并不明顯；TNF-α可誘導(dǎo)IL-6的合成，IL-6則抑制TNF-α的產(chǎn)生，兩者是肝臟再生的早期信號[9]。

由此可見，大桑菊合劑不僅具有護(hù)肝的作用，其還能通過動態(tài)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡漂移機制起到抗炎免疫的作用。其在肺炎支原體肺炎治療中，初期通過平衡Th1細(xì)胞因子水平，既能減輕肝損傷，又能起到抗炎的效果；后期通過平衡Th2細(xì)胞因子水平，使Th1/Th2趨于穩(wěn)定，從而達(dá)到提高聯(lián)合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎的作用，但其具體信號通路仍待進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2015-10-30）

（修回日期：2015-11-27；編輯：華強）