張玥晗, 文 靜, 朱海桃, 趙光宗, 李曉愚(重慶醫(yī)科大學(xué). 0級(jí)臨床一系; . 0級(jí)臨床二系; . 實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心, 重慶 40)

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雌激素灌胃法制備豚鼠子宮肌瘤模型

張玥晗1, 文 靜1, 朱海桃1, 趙光宗2, 李曉愚3
(重慶醫(yī)科大學(xué)1. 2012級(jí)臨床一系; 2. 2013級(jí)臨床二系; 3. 實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心, 重慶 401331)

[摘要]目的 用雌激素灌胃法制備豚鼠子宮肌瘤模型, 探討不同劑量及給藥周期對(duì)子宮肌瘤形成的影響。方法 性成熟雌性豚鼠分為短周期組和長(zhǎng)周期組，分別每周2次灌胃戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè))0.1 mg/100 g體質(zhì)量6周和8周?？瞻讓?duì)照組灌胃相同體積生理鹽水。灌胃結(jié)束后，ELISA法測(cè)定血清中雌二醇及孕酮水平; 計(jì)算肌瘤形成率、子宮臟器系數(shù); 子宮組織制作石蠟切片，檢測(cè)子宮肌瘤模型是否成功建立。結(jié)果 短周期模型組成瘤率30%，長(zhǎng)周期模型組成瘤率40%，總體成瘤率35%。血清學(xué)檢測(cè)顯示模型組動(dòng)物血清雌激素水平明顯增高，孕激素水平下降; 病理組織學(xué)檢測(cè)證實(shí)造模成功。 結(jié)論 雌激素灌胃法是一種簡(jiǎn)單有效的豚鼠子宮肌瘤模型造模方法。

[關(guān)鍵詞]子宮肌瘤; 豚鼠; 雌激素; 灌胃法

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的良性腫瘤，約占女性所有良性腫瘤的51.87%，育齡期婦女高發(fā)，其發(fā)病率可高達(dá)77%，且呈逐年上升趨勢(shì), 嚴(yán)重危害女性身體健康[1,2]。子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與體內(nèi)性激素關(guān)系密切，但目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。建立子宮肌瘤動(dòng)物模型是研究其發(fā)病機(jī)制和篩選治療藥物的常用手段。國(guó)外多采用自發(fā)子宮肌瘤的Eker大鼠模型，成瘤率高但價(jià)格昂貴[3]; 此外還有利用基因工程技術(shù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠模型、在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)移植人類子宮肌瘤組織建立的異種移植動(dòng)物模型等[4,5]。這些方法各有優(yōu)勢(shì), 但操作復(fù)雜, 對(duì)實(shí)驗(yàn)室及其配套設(shè)備要求較高。國(guó)內(nèi)多采用外源性性激素注射法建立子宮肌瘤模型，包括單一雌激素誘導(dǎo)法(單模法)[6]、雌激素孕激素聯(lián)合誘導(dǎo)法(雙模法)[7]、去勢(shì)后雌激素誘導(dǎo)法[8]等。用于外源性性激素注射的國(guó)內(nèi)產(chǎn)品有苯甲酸雌二醇注射液和戊酸雌二醇注射液，但近年來(lái)該產(chǎn)品陸續(xù)停產(chǎn)，難以購(gòu)買，臨床上也已廣泛采用雌激素口服制劑進(jìn)行相關(guān)疾病的治療。近年有些研究項(xiàng)目組改用獸用雌激素注射液進(jìn)行子宮動(dòng)物模型建立，結(jié)果成瘤率低，造模效果不好[9]。為適應(yīng)國(guó)內(nèi)目前實(shí)驗(yàn)條件，需建立一種簡(jiǎn)便易行、行之有效的子宮肌瘤模型建模方法，本文探討用目前臨床上常用的口服雌激素藥物戊酸雌二醇，采用灌胃法建立豚鼠子宮肌瘤模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雌性豚鼠 40 只, 重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK-(渝)2012-0001]，體質(zhì)量400± 20 g, 未經(jīng)生育交配。飼養(yǎng)條件: 室溫22±2 ℃, 相對(duì)濕度 50%～70%, 自然通風(fēng), 光照12 h, 黑暗12 h,每籠5只。以清潔級(jí)豚鼠飼料和凈化水飼養(yǎng), 自由攝食和飲水，每日每只豚鼠給予100 g卷心菜補(bǔ)充維生素C。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周[SYXK-(渝)2012-0001]。

1.2 材料和儀器

戊酸雌二醇(商品名: 補(bǔ)佳樂(lè), Delpharm Lille S.A.S生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字20130009)，建模劑量參考Fujii 等[10]的方法，計(jì)算出每只豚鼠所需補(bǔ)佳樂(lè)劑量，將藥物研磨至粉狀后溶于無(wú)菌生理鹽水，配置終濃度為0.1 mg/mL，在振蕩器上充分震蕩混勻后制成混懸液備用。檢測(cè)雌二醇(E2)和孕酮(P)的ELISA試劑盒購(gòu)自廈門慧嘉生物科技有限公司。酶標(biāo)儀(南京華東電子); 組織切片機(jī)(杭州科迪); 生物組織脫水機(jī)(中威TSJ-SD)。

1.3 方法

1.3.1 造模 將40只豚鼠隨機(jī)分為4 組, 每組10只。短周期和長(zhǎng)周期模型組，每只豚鼠分別按體質(zhì)量100 g灌胃戊酸雌二醇懸濁液1 mL，每周2次，連續(xù)6周和8周; 同時(shí)設(shè)短周期和長(zhǎng)周期對(duì)照組，同法灌胃等量生理鹽水。

1.3.2 檢測(cè)項(xiàng)目 短周期模型組和對(duì)照組豚鼠6周后處死, 長(zhǎng)周期模型組和對(duì)照組豚鼠8周后處死。處死前所有豚鼠于眶動(dòng)脈取血1 mL, 3 000 r/min離心10 min 分離血清, ELISA法測(cè)定血清E2和P含量。

處死后豚鼠立即稱重，然后解剖觀察子宮與肌瘤形態(tài)。將子宮完整剪下并稱重，計(jì)算肌瘤形成率和子宮臟器系數(shù) (子宮重量/體質(zhì)量×100%)。子宮組織用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定48 h，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察病理組織改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 豚鼠子宮肌瘤形成

短周期模型組有3只豚鼠造模成功，肌瘤形成率30%。肉眼可見(jiàn)造模成功豚鼠子宮體積增大、色澤晦暗、肌層增生，個(gè)別動(dòng)物于子宮角處出現(xiàn)肌瘤樣結(jié)節(jié)，1～3個(gè)不等。造模期間死亡1只，死亡率10%，死亡原因?yàn)榉尾扛腥尽ｉL(zhǎng)周期模型組造模成功4只，肌瘤形成率為40%。其子宮形態(tài)改變較短周期模型組更為明顯，體積明顯增大、腫脹明顯。造模期間死亡3只，死亡率30%，其中2只死于肺部感染，1只死因不明。2組對(duì)照組動(dòng)物子宮體積無(wú)增大、質(zhì)地均勻、無(wú)結(jié)節(jié)或囊腫生長(zhǎng)。其中長(zhǎng)周期對(duì)照組死亡1只，死亡率10%。

2.2 子宮重量和子宮臟器系數(shù)

長(zhǎng)周期和短周期模型組與相應(yīng)的對(duì)照組比較,子宮重量、子宮臟器指數(shù)均明顯增加(P<0.05)(表1),說(shuō)明造模成功。

表1 雌激素對(duì)豚鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響Table 1 The changes of uterine weight and organ coefficient after estrogen injection

2.3 血清E2、P含量

與相應(yīng)對(duì)照組比較, 模型組血清E2含量均明顯增高(P<0.01), 說(shuō)明造模成功。長(zhǎng)周期模型組P含量低于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

2.4 病理組織學(xué)觀察

HE染色顯示, 正常豚鼠子宮平滑肌肌層較薄，平滑肌細(xì)胞排列整齊，肌纖維細(xì)長(zhǎng)，流水樣排列(圖1A)。長(zhǎng)周期模型組豚鼠子宮壁增厚，平滑肌細(xì)胞增生、增粗、排列紊亂。部分平滑肌細(xì)胞互相交錯(cuò)，呈編織樣排列，細(xì)胞核肥大、深染，增生活躍，病變與人體平滑肌瘤樣增生相似(圖1B)。

表2 豚鼠血清E2、P含量Table 2 The serum E2 and P levels in guinea pigs

3 討論

人類疾病動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制、臨床藥物篩選的重要手段，建立適宜的動(dòng)物模型是人類疾病研究的重要基礎(chǔ)。

A: 對(duì)照組 B: 模型組圖1 豚鼠子宮平滑肌組織學(xué)觀察(HE×40)A: control group B: model groupFigure 1 Histological observation on uterine smooth muscle in Guinea pig

子宮肌瘤動(dòng)物模型建立方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)。Eker大鼠是自發(fā)性子宮肌瘤動(dòng)物模型，其Tsc-2等位基因突變, 導(dǎo)致Tsc-2基因功能缺陷, 從而自發(fā)形成包括子宮肌瘤在內(nèi)的一些良惡性腫瘤[11]。Everitt等[12]報(bào)道，雌性未妊娠Eker大鼠自發(fā)子宮肌瘤的發(fā)生率為65%。轉(zhuǎn)基因小鼠子宮肌瘤模型是通過(guò)抑制子宮肌層中SV40 標(biāo)記基因的表達(dá)而建立[13],方法是在轉(zhuǎn)基因小鼠切除卵巢后，每日給予乙烯雌酚(100 mg/kg) 連續(xù)15 d后，通過(guò)組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)子宮肌層平滑肌細(xì)胞增生形成渦旋狀肌束，組織形態(tài)學(xué)上與人類子宮肌瘤相似、并發(fā)生雌激素依賴性的子宮肌瘤。子宮肌瘤異種移植動(dòng)物模型則是在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)移植人源性子宮肌瘤組織而建立，其優(yōu)點(diǎn)是成瘤率高，肌瘤結(jié)構(gòu)與人類相同。Ishikawa等[14]在非肥胖糖尿病重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠的腎包膜下移植人子宮肌瘤組織，結(jié)果正常子宮肌層組織和子宮肌瘤組織的成活率接近100%，且異種移植瘤保留了原組織的組織學(xué)特征，是目前成瘤率最高的子宮肌瘤動(dòng)物模型造模方法。雖然以上方法均可成功建立子宮肌瘤動(dòng)物模型，但操作方法比較復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高，費(fèi)用比較昂貴。

陳海剛等[15]通過(guò)給予雌性未妊娠SD 大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液200 mg和300 mg每周2次, 持續(xù)8 周和10周, 結(jié)果顯示200 mg劑量8周組成功建立了與人子宮肌瘤相似的子宮肌瘤模型。鄒小麗等[16]給雌性未妊娠SD 大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg, 連續(xù)30 d, 每周1 次黃體酮(4 mg/kg), 25～30 d兩種激素同時(shí)注射，結(jié)果顯示造模成功。

本研究探討用目前臨床上常用的口服雌激素藥物戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè))作為外源性雌激素，通過(guò)灌胃的方法建立豚鼠子宮肌瘤動(dòng)物模型造模。結(jié)果表明，0.1 mg/100g體質(zhì)量劑量下，每周2次口服灌胃，6周即可成功建立子宮肌瘤動(dòng)物模型，8周成瘤率進(jìn)一步提高，但動(dòng)物死亡率上升，且剩余存活動(dòng)物的一般情況、進(jìn)食狀態(tài)和精神狀態(tài)均變差。兩個(gè)模型組共20只動(dòng)物中，建模成功7只，總體成瘤率35%，與文獻(xiàn)報(bào)道的雌激素注射法成模率(27%～41%)相近[17,18]。血清學(xué)檢測(cè)顯示，長(zhǎng)、短周期模型組動(dòng)物E2水平均明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明補(bǔ)佳樂(lè)混懸液能夠有效提高動(dòng)物體內(nèi)雌激素水平。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，孕激素水平逐漸降低，可能與體內(nèi)性腺軸負(fù)反饋抑制有關(guān)。與雌激素注射建模法相比，采用雌激素藥物灌胃法建立子宮肌瘤動(dòng)物模型，具有藥物來(lái)源廣泛、建模時(shí)間短、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。李東華等[19]報(bào)道，雌孕激素協(xié)同造模過(guò)程中，初期可能出現(xiàn)大鼠活動(dòng)減少、精神欠佳、生長(zhǎng)緩慢、易激惹甚至出現(xiàn)脫毛、四肢炎性腫塊等現(xiàn)象，但本研究中未見(jiàn)類似表現(xiàn)。本研究中出現(xiàn)動(dòng)物死亡的情況，死因多為肺部感染，是否與灌胃操作不當(dāng)有關(guān)，尚需進(jìn)一步探討。此外，由于本研究選用的補(bǔ)佳樂(lè)為進(jìn)口藥物，其配方受控保密，無(wú)法查到藥物填料成分，所以本研究未設(shè)立藥物填料陰性對(duì)照組，藥物填料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響還需做進(jìn)一步研究。

綜上，雌激素灌胃建立子宮肌瘤模型，成瘤率與注射法接近，模型豚鼠病理學(xué)改變與人平滑肌瘤樣增生相似，是一種有效的動(dòng)物模型造模方法，可用于子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制、治療方法研究。

參考文獻(xiàn):

[1] Ciarmela P, Critchley H, Christman GM, et al. Pathogenesis of endometriosis and uterine fibroids [J]. Obstet Gynecol Int, 2013:656571.

[2] Khan AT, Shehmar M, Gupta JK. Uterine fibroids: current perspectives [J]. Int J Womens Health, 2014, 6:95-114.

[3] Hassan M, Zhang D, Salama S, et al. Towards fibroid gene therapy: adenovirus-mediated delivery of herpes simplex virus 1 thymidine kinase gene/ganciclovir shrinks uterine leiomyoma in the Eker rat model [J]. Gynecol Obstet Invest, 2009, 68(1):19-32.

[4] Vaezy S, Fujimoto VY, Walker C, et al. Treament of uterine fibrodtumors in a nude mouse model using high intensity focused ultrasound [J]. Am J Obstet Gynecol, 2000, 183(1): 6-11.

[5] Drosch M, Bullerdiek J, Zollner TM, et al. A novel mouse model that closely mimics human uterine leiomyomas [J]. Fertil Steril, 2013, 99(3):927-935.

[6] 景慧芳, 張曉甦. 子宮肌瘤動(dòng)物模型研究[J]. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 29(3):513-514.

[7] 郭純, 徐景杰, 呂新亮, 等. 消瘕丸治療大鼠子宮肌瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 武警醫(yī)學(xué), 2007,18(5):342-344.

[8] 朱焰, 邱小燕, 吳建輝, 等. 子宮肌瘤動(dòng)物模型的建立[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 27(4):6-9.

[9] 李文, 劉新敏. 子宮肌瘤動(dòng)物模型構(gòu)建方法的實(shí)驗(yàn)研究概況[J]. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展, 2014, 23(11):917-919.

[10] Fujii S, Nakashima N, Okamura H, et al. Progesterone-induced smooth muscle-like cells in the subperitoneal nodules produced by estrogen. Experimental approach to leiomyomatosis peritonealis disseminate[J]. Am J Obstet Gynecol, 1981, 139 (2):164-172.

[11] Walker CL, Hunter D, Everitt JI. Uterine leiomyoma in the Eker rat: a unique model for important diseases of women[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 38(4):349-356.

[12] Everitt JI, Wolf DC, Howe SR, et al. Rodent model of reproductive tract leiomyomata. Clinical and pathological features [J]. Am J Pathol, 1995, 146(6):1556-1567.

[13] Romagnolo B, Molina T, Leroy G, et al. Estradiol-dependent uterine leiomyomas in transgenic mice [J]. Clin Invest, 1996, 98(3):777-784.

[14] Ishikawa H, Ishi K, Serna VA, et al. Progesterone is essential for maintenance and growth of uterine leiomyoma [J]. Endocrinol, 2010, 151(6):2433-2442.

[15] 陳海剛, 朱蘭, 崔全才, 等. 雌激素指標(biāo)大鼠子宮肌瘤動(dòng)物模型[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 33(4):408-411.

[16] 鄒小麗, 李冬華, 王亞松, 等. 理沖湯對(duì)子宮肌瘤大鼠細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 [J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2011, 17(11):3-6.

[17] 李冬華. 子宮肌瘤大鼠模型制備方法之比較 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 15(24):3700-3706.

[18] 王占利, 李坤寅, 趙穎, 等. 長(zhǎng)期與短期雙模法子宮肌瘤大鼠模型制備的比較[J]. 中醫(yī)研究, 2012, 25(5):54-57.

[19] 李東華, 謝小磊, 張亞蘭, 等. 扶正祛瘀中藥調(diào)控子宮肌瘤模型大鼠p53信號(hào)通路基因表達(dá)譜的研究[J]. 中國(guó)婦幼保健, 2010, 25(33): 4910-4913.

Intragastric Estrogen Administration Induced Guinea Pig Model of Uterine Leiomyoma

ZHANG Yue-han1, WEN Jing1, ZHU Hai-tao1, ZHAO Guang-zong2, LI Xiao-yu3
(1. 2012 No.1 Clinical Department, 2. 2013 No.2 Clinical Department, 3. Experiment Teaching Center, Chongqing Medical University, Chongqing 401331, China)

[Abstract]Objective To establish the guinea pig model of uterine leiomyoma by intragastric administration of estrogen and to discuss the effect of different cycles of administration on formation of uterine leiomyoma. Method Mature female guinea pigs were divided into short term group and long term group, and intragastric administrated with estradiol valerate at 0.1 mg/100 g body weight twice a week for 6 weeks and 8 weeks respectively. The control was intragastric administrated with normal saline with same volume. After 6 or 8 weeks, the guinea pigs were sacrificed. The serum levels of estrogen and progesterone were measured by ELISA and the leiomyoma forming rate was measured. Histological changes were compared between treatment group and control group with HE staining. Results The leiomyoma forming rate in short term group was 30% and long term group was 40%. The average total rate was 35%. The serum level of estrogen in model animals was increased significantly and the progesterone decreased in long term group. Histopathological examination confirmed that the guinea pig model of uterine leiomyoma were established successfully. Conclusions Intragastric estrogen administration was a simple and effective method for establishing uterine leiomyoma guinea pigs model. [Key words] Uterine leiomyoma; Guinea pigs; Estrogen; Intragastric administration

[中圖分類號(hào)]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-5817(2016)03-0195-05

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.007

[收稿日期]2016-01-25

[基金項(xiàng)目]重慶市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目201410631021;重慶醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目201423

[作者簡(jiǎn)介]張玥晗(1994-), 重慶醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)臨床一系本科生。E-mail: 824025990@qq.com

[通訊作者]李曉愚(1976-), 39歲, 男, 博士研究生、講師, 主要從事病原生物學(xué)研究工作。E-mail: penet@qq.com