李 瑤, 高小莉, 陳健康, 王四旺, 謝艷華(. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 咸陽(yáng) 7046;. 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室, 西安 700;. 第四軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 西安 700)

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面神經(jīng)夾閉建立大鼠面癱模型

李 瑤1, 高小莉2, 陳健康3, 王四旺2, 謝艷華2
(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 咸陽(yáng) 712046;
2. 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系天然藥物學(xué)教研室, 西安 710032;
3. 第四軍醫(yī)大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心, 西安 710032)

[摘要]目的 建立操作簡(jiǎn)便、發(fā)病率高、死亡率低的大鼠面癱模型制作方法。方法 SD大鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別用蚊式鉗閉合三齒夾閉大鼠右側(cè)耳后面神經(jīng)主干6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，記錄各組大鼠面神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位(CMAP)波幅變化情況，觀察大鼠的一般行為學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 造模6 min、8 min與造模之前比較，面神經(jīng)CMAP波幅無(wú)差異，造模10 min、12 min、14 min與造模之前相比較，大鼠面神經(jīng)CMAP波幅明顯減小并趨于0; 行為學(xué)評(píng)分結(jié)果表明，造模6 min、8 min大鼠為不完全面癱，造模10 min、12 min、14 min大鼠完全面癱，造模12 min、14 min大鼠與造模10 min相比無(wú)顯著差異。結(jié)論 用蚊式鉗閉合三齒夾閉面神經(jīng)主干10 min，面神經(jīng)CMAP下降波幅和行為學(xué)評(píng)分均表明大鼠完全面癱，故該方法可作為大鼠面癱模型建立的優(yōu)選方法。

[關(guān)鍵詞]大鼠; 面癱模型; 面神經(jīng); 復(fù)合動(dòng)作電位

面癱是指以面部表情肌群運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要特征的一種常見(jiàn)疾病，臨床上主要表現(xiàn)為不自主流淚，眼睛閉合不全，口眼歪斜等[1]。面部表情肌的運(yùn)動(dòng)受面神經(jīng)的支配，面神經(jīng)一旦受損造成面癱，會(huì)對(duì)患者的生理和心理造成重大影響。面癱發(fā)生的原因目前尚不清楚，建立完善的面癱動(dòng)物模型有助于更清晰了解面神經(jīng)纖維的損傷情況，為臨床治療面癱提供依據(jù)。

目前面癱模型的造模方法國(guó)內(nèi)外報(bào)道很多，根據(jù)模型制作方法不同，面癱動(dòng)物模型主要包括外傷性、病毒性、冷空氣及缺血性四種[2,3]，且這四種面癱動(dòng)物模型均具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。為建立更符合臨床實(shí)際情況的模型，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)劉悅等[4]造模方法的改進(jìn)，建立了一種操作簡(jiǎn)便、死亡率低、模型成功率高的面癱動(dòng)物模型制作方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

清潔級(jí)SD大鼠50只, 體質(zhì)量190～250 g, 雌雄各半, 由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(軍) 2012-0007]。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后, 隨機(jī)分為5組，每組10只。每籠5只分別飼養(yǎng)于IVC內(nèi)，室內(nèi)溫度21～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，人工控制光照晝夜各12 h[SYXK(陜)2012-001]。顆粒飼料(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)喂養(yǎng), 自由飲水, 每周更換墊料2次。BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(上海山浦化工有限公司)、蚊式鉗(12.5 cm直頭，上海金鐘醫(yī)療器械公司)。

1.2 造模方法

所有SD大鼠采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(3 mL/

kg)腹腔注射麻醉后, 右側(cè)面部去毛, 消毒, 耳后縱切口，于腮腺后上緣暴露并分離面神經(jīng)主干，在面神經(jīng)主干近端一側(cè)插入電極給予刺激，在其遠(yuǎn)側(cè)端口插入電極，誘發(fā)面神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位(CMAP)，測(cè)定各組大鼠面神經(jīng)損傷之前的面神經(jīng)CMAP波幅后, 用蚊式鉗閉合三齒分別夾閉面神經(jīng)主干6 min、8 min、10 min、12 min、14 min, 測(cè)定夾閉后面神經(jīng)CMAP波幅, 測(cè)定結(jié)束后縫合皮膚, 即制成面癱動(dòng)物模型。術(shù)后隔日觀察大鼠一般行為學(xué)狀況。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大鼠面部一般行為學(xué)表現(xiàn) 于術(shù)后麻醉恢復(fù)后隔日, 觀察大鼠面部運(yùn)動(dòng)情況。大鼠面部一般行為學(xué)指標(biāo)主要包括瞬目反射、觸須運(yùn)動(dòng)和鼻尖位置。瞬目反射的誘發(fā)方法[5]: 用5 mL注射器18號(hào)針頭距離鼠眼2 cm處, 向眼部吹入空氣, 觀察大鼠眼瞼活動(dòng)及閉合情況, 雙側(cè)無(wú)明顯差異記0分, 右側(cè)較對(duì)側(cè)閉合延遲記1分, 右側(cè)眼瞼不能閉合記2分;計(jì)數(shù)30 s內(nèi)大鼠雙側(cè)的觸須運(yùn)動(dòng)[6]: 雙側(cè)胡須運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯差異記0分，右側(cè)胡須運(yùn)動(dòng)較對(duì)側(cè)減弱記1分, 右側(cè)胡須運(yùn)動(dòng)消失記2分; 觀察大鼠鼻尖位置: 0分為居中, 1分鼻尖偏向?qū)?cè)。將3項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)分相加進(jìn)行面癱的鑒定和評(píng)價(jià): 0～1分為無(wú)面癱, 2～3分為不完全面癱，4～5分為完全性面癱[7]。 1.3.2 大鼠面神經(jīng)生物電 分離出大鼠右側(cè)面神經(jīng)主干后，在面神經(jīng)主干近端一側(cè)插入電極給予刺激，在其遠(yuǎn)側(cè)端口插入電極，誘發(fā)面神經(jīng)CMAP，用BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)測(cè)定各組面神經(jīng)損傷之前的CMAP波幅，測(cè)定結(jié)束后，分別用蚊式鉗閉合三齒夾閉面神經(jīng)主干6 min、8 min、10 min、12 min、14 min，并測(cè)定夾閉損傷不同時(shí)間之后的CMAP波幅。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以x-± s表示，采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，行為學(xué)評(píng)分組間比較和動(dòng)作電位波幅組間比較均采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠面部一般行為學(xué)指標(biāo)

經(jīng)過(guò)觀察, 大鼠面神經(jīng)損傷之前, 各組大鼠面部一般行為學(xué)評(píng)分為0，且各組間評(píng)分均無(wú)明顯差異(P>0.05)。造模6 min、8 min的模型組, 行為學(xué)評(píng)分均未達(dá)到完全面癱的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn), 而造模10 min、12 min、14 min大鼠行為學(xué)評(píng)分均達(dá)到完全面癱評(píng)分標(biāo)準(zhǔn), 且與造模8 min比較差異顯著(P<0.05); 造模12 min、14 min與造模10 min比較行為學(xué)評(píng)分無(wú)明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 大鼠面神經(jīng)處理不同時(shí)間后一般行為學(xué)評(píng)分Table 1 The ethology score of rats after facial nerve trunk clipped for different times

造模6 min, 大鼠鼻尖無(wú)變化，胡須運(yùn)動(dòng)較對(duì)側(cè)減弱; 造模8 min，大鼠鼻尖稍偏向?qū)?cè)，胡須運(yùn)動(dòng)和眼瞼閉合較對(duì)側(cè)緩慢; 造模10 min、12 min、14 min，大鼠鼻尖偏向?qū)?cè)，右側(cè)眼瞼不能閉合、胡須運(yùn)動(dòng)基本消失，判定為完全面癱，經(jīng)比較，造模10 min、12 min、14 min組間動(dòng)物行為學(xué)狀況無(wú)明顯差異(圖1)。

2.2 大鼠面神經(jīng)CMAP波幅

造模6 min、8 min前與造模后相比，大鼠面神經(jīng)CMAP波幅無(wú)明顯差異(P>0.05), 造模10 min、12 min、14 min與造模前相比，大鼠面神經(jīng)CMAP波幅有明顯差異(P<0.05)(表2, 圖2)。

表2 大鼠面神經(jīng)處理不同時(shí)間CMAP波幅Table 2 The CMAP amplitude of rats after facial nerve trunk clipped for different times

圖1 造模不同時(shí)間大鼠面部表現(xiàn)Figure 1 The facial expression of rats after facial nerve trunk clipped for different times

圖2 造模10 min前后CMAP波幅Figure 2 The CMAP amplitude of rats after facial nerve trunk clipped for ten minutes

3 討論

面癱是臨床常見(jiàn)病之一，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)稱之為面神經(jīng)麻痹、面神經(jīng)炎。關(guān)于面癱的發(fā)病原因眾說(shuō)紛紜，中醫(yī)通常認(rèn)為風(fēng)、寒、熱、外傷是引起面癱的主要原因。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，90%的面癱患者有恐懼和緊張感，對(duì)日常生活有較大影響。目前臨床主要用針灸法治療面癱，面癱動(dòng)物模型的建立對(duì)面癱研究有著重要的推動(dòng)作用[8]。

面神經(jīng)是以運(yùn)動(dòng)神經(jīng)為主的混合神經(jīng)，主要支配面部表情肌和傳導(dǎo)舌前2/3的味覺(jué)及支配舌下腺、下頜下腺和淚腺的分泌。面神經(jīng)核位于腦橋，分為上下兩部分，上半部分受雙側(cè)大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)的支配，并發(fā)出運(yùn)動(dòng)纖維支配同側(cè)顏面上半部的肌肉，下半部分僅受對(duì)側(cè)大腦皮質(zhì)的支配，并發(fā)出運(yùn)動(dòng)纖維支配同側(cè)顏面下半部分的肌肉。面神經(jīng)出莖乳孔后迂回向上向前約105°而達(dá)腮腺。面神經(jīng)受到擠壓、牽拉、斷裂、溫度刺激及其他形式的損傷時(shí)，其傳導(dǎo)功能發(fā)生異常，進(jìn)而引起面肌癱瘓，即中醫(yī)所說(shuō)的面癱[9]。由于面神經(jīng)獨(dú)特的生理結(jié)構(gòu)和功能，常被認(rèn)為是進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)損傷和再生體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究的理想工具。

面神經(jīng)CMAP波幅歷來(lái)被作為判斷神經(jīng)損傷的重要指標(biāo)，研究表明[10]，面神經(jīng)CMAP波幅的下降程度和面神經(jīng)的損傷程度有關(guān)，損傷越嚴(yán)重，CMAP波幅的下降比例越大，所以可以將面神經(jīng)CMAP波幅下降比值作為判斷面癱模型是否制作成功的電生理指標(biāo)。

目前面癱造模的動(dòng)物種類繁多，造模方法各具特色，主要通過(guò)神經(jīng)牽拉、重創(chuàng)、接種病毒等造成面神經(jīng)損傷而引起面癱，但很少有符合中醫(yī)臨床發(fā)病規(guī)律的面癱病癥的動(dòng)物模型，用于造模動(dòng)物的年齡、面神經(jīng)卡壓時(shí)間、神經(jīng)切斷長(zhǎng)度等大都沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[11]，且現(xiàn)有的面癱模型中，采用切斷面神經(jīng)法建立的模型死亡率較高，部分切斷的神經(jīng)纖維近端會(huì)膨大形成神經(jīng)膠質(zhì)瘤; 病毒性面癱動(dòng)物模型的制備，需要接種單純皰疹病毒，在實(shí)驗(yàn)中病毒的攻擊途徑與自然感染途徑差別較大，且病毒與人之間的感染也有危險(xiǎn)性，不易于推廣; 冷空氣刺激法建立的面癱模型，雖然與臨床面癱的發(fā)病機(jī)理比較貼近，但是此模型的造模成功率低，且受個(gè)體因素影響較大。

本實(shí)驗(yàn)采用蚊式鉗閉合三齒夾閉大鼠面神經(jīng)主干6 min、8 min、10 min、12 min、14 min, 檢測(cè)大鼠面神經(jīng)CMAP波幅，確定用蚊式鉗閉合三齒夾閉面神經(jīng)主干10 min為大鼠面癱模型的優(yōu)選制備方法。該方法簡(jiǎn)便易行，成功率高，對(duì)面癱的研究和治療有重要應(yīng)用價(jià)值。

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Establishing Facial Paralysis Model in Rats by Clipped Facial Nerve

LI Yao1, GAO Xiao-li2, CHEN Jian-kang3, WANG Si-wang2, XIE Yan-hua2
(1. Institution of Pharmacy, Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xian yang 712046, China; 2. Department of Nature Medicine, School of Pharmacy, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China; 3. Experimental Teaching Centre, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

[Abstract]Objective To establish a high morbidity and low mortality of animal model for facial paralysis in rats, which is easy to operate. Methods Fifty SD rats with half male and female were randomly divided into five groups, each group with 10. The facial nerve trunk of rats were clipped with mosquito forceps closing three tooth for 6 min, 8 min, 10 min, 12 min and 14 min. The compound muscle action potential (CMAP) amplitude of facial nerve trunk was measured by biological function experiment system, and the general behavior indices of all the rats were observed next day after injury. Results The CMAP amplitude of rats after facial nerve trunk clipped for 6 min and 8 min respectively were the same as none clipped rats, but it decreased obviously and tended to zero after clipped for 10 min, 12 min and 14 min. In addition, ethology score results showed that the models of 6 min, 8 min rats performed incomplete paralysis symptoms, the models of 10 min,12 min,14 min rats were facial paralysis completely and the models of 14 min and 12 min rats had no obvious difference compared with the model of 10 min. Conclusion The decreased CMAP amplitude of facial nerve trunk and ethology score results showed that clipping the facial nerve trunk with the mosquito forceps closing three tooth for 10 min was the best way to establish rats model of facial paralysis.

[Key words]Rat; Facial paralysis model; Facial nerve; Compound muscle action potential (CMAP)

[中圖分類號(hào)]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-5817(2016)03-0190-05

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.006

[收稿日期]2016-02-02

[作者簡(jiǎn)介]李 瑤(1991-), 女, 碩士研究生, 研究方向: 中藥飲片炮制原理及標(biāo)準(zhǔn)化研究。E-mail: 879220847@qq.com

[通訊作者]謝艷華, 女, 博士, 副教授, 碩士研究生導(dǎo)師, 研究方向: 生藥活性成分作用機(jī)制研究。E-mail: xieyanh@fmmu.edu.cn