李大偉, 華相偉, 張 江, 姚菊芳, 戴慧莉, 孔憲明(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院.肝臟外科, .實驗動物中心, 上海 007)

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小動物斷層掃描系統(tǒng)在小鼠爆發(fā)性肝損傷模型中的應(yīng)用

李大偉1, 華相偉1, 張 江1, 姚菊芳2, 戴慧莉2, 孔憲明2
(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院1.肝臟外科, 2.實驗動物中心, 上海 200127)

[摘要]目的 利用小動物斷層掃描(MicroCT)系統(tǒng)觀察內(nèi)毒素聯(lián)合D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)所致小鼠爆發(fā)性肝損傷模型中的影像學(xué)表現(xiàn)和CT值變化，并分析影像學(xué)表現(xiàn)與小鼠肝損傷之間的關(guān)系及機(jī)制。方法 取5只雄性C57BL/6小鼠進(jìn)行爆發(fā)性肝損傷造模(LPS 10 mg/kg+D-GalN 700 mg/kg，腹腔注射)，分別于造模前，造模后3 h、6 h利用MicroCT行小鼠活體肝組織掃描，根據(jù)掃描圖像所獲得資料測量小鼠肝臟的平均CT值，分析比較各組肝損傷征象的顯示率差異。同時，取20只小鼠分為4組，造影劑(ExiTron nano 6000)組，給予造影劑注射，檢測造影劑對肝臟有無毒性; PBS組, 給予同造模組相同劑量的PBS注射; 造模3 h組，肝損傷造模后3 h取血和組織標(biāo)本; 造模6 h組，造模后6 h取標(biāo)本。然后比較MicroCT顯像與小鼠血液及病理結(jié)果的相關(guān)性。結(jié)果 以ExiTron nano 6000 做為造影劑, MicroCT可清晰的顯影肝臟和脾臟的二維和三維結(jié)構(gòu)。LPS/D-GalN可以造成嚴(yán)重的肝臟損傷。給予LPS/D-GalN處理后3 h，小鼠肝臟的CT值明顯升高，體外實驗證明LPS可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吸收造影劑的能力。結(jié)論 MicroCT可通過無創(chuàng)方法在小鼠爆發(fā)性肝損傷早期反應(yīng)肝臟損傷的變化，具有較高的應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞]爆發(fā)性肝損傷; 小動物斷層掃描(Micro CT); ExiTron nano 6000;巨噬細(xì)胞; 小鼠

爆發(fā)性肝損傷是多種因素作用引起的一組臨床綜合征, 具有較高病死率[1]。除肝移植外, 目前尚無有效的治療方法，因此，對爆發(fā)性肝損傷的早期干預(yù)具有重要的研究價值和臨床意義[2]。以往在進(jìn)行小鼠肝損傷模型實驗時，為了檢測小鼠的肝損傷程度及變化過程，常采用取血測轉(zhuǎn)氨酶和取肝臟作病理觀察的方法。但是小鼠的體型較小, 要獲得足夠的血液或組織標(biāo)本, 必須將小鼠處死。這樣就造成大量動物資源浪費，并且不能在同一個體上得到連續(xù)性觀察結(jié)果。本研究運用無創(chuàng)傷性的小動物斷層掃描(MicroCT)系統(tǒng)對小鼠肝損傷模型進(jìn)行活體顯像, 連續(xù)檢測爆發(fā)性肝損傷的發(fā)生發(fā)展。MicroCT雖然已在一些動物模型的研究中有所應(yīng)用[3,4], 但在爆發(fā)性肝損傷方面的應(yīng)用非常有限。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

8～10周齡清潔級雄性C57BL/6小鼠25只，體質(zhì)量20～26 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2007-0005]。小鼠飼養(yǎng)于SPF設(shè)施[SYKX-2012-0013]。動物的使用經(jīng)過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院動物倫理委員會審批。

Micro-CT系統(tǒng)(eXplore Locus, GE Healthcare)購自美國通用公司。脂多糖(LPS)和 D-半乳糖胺(D-GalN)均購自美國Sigma公司; 體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛; 1 mL注射器。細(xì)胞培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%血清的DMEM(Gibco，美國Invitrogen公司)。巨噬細(xì)胞系RAW264.7(小鼠單核巨噬細(xì)胞系)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 爆發(fā)性肝損傷模型制備

D-GalN 和LPS同時溶于PBS，濃度為(70 mg D-GalN+1 mg LPS)/mL，完全溶解后每只小鼠腹腔注射(D-GalN 700 mg/kg + LPS10 mg)/kg建立爆發(fā)性肝損傷模型。檢測損傷的實驗分為4組，每組5只:造影劑組，給予造影劑注射，6 h后取血。PBS組，給予同造模組相同劑量的PBS注射; 造模3 h組，給予肝損傷造模后3 h取血和組織標(biāo)本; 造模6 h組，造模后6 h取組織標(biāo)本。另有5只小鼠用于MicroCT掃描，具體方法見1.4。

1.3 轉(zhuǎn)氨酶檢測及病理學(xué)觀察

各組小鼠分別于造模后相應(yīng)時間點, 以10 g/L濃度的戊巴比妥鈉按10 mL/kg麻醉, 然后采集各組小鼠腹主動脈血。室溫靜置1 h后, 4 ℃, 1 000 r/min離心分離血清, 測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平; 取小鼠肝組織, 用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片(厚5mm)，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.4 MicroCT掃描

5只小鼠在LPS/D-GalN造模前4 h通過鼠尾靜脈注射ExiTron nano6000 100 mL。在造模后0 h、3 h和6 h對小鼠進(jìn)行MicroCT掃描，相關(guān)參數(shù)為光管電壓: 80 kV; 光管電流: 0.45 mA; 視圖總量: 400;曝光時間: 400 ms; 平均幀數(shù): 2×2；有效像素: 0.045 mm。掃描時間為20 min，通過 Launch GEHC Micro View系統(tǒng)分析掃描結(jié)果。

1.5 體外實驗

實驗組巨噬細(xì)胞系細(xì)胞進(jìn)行LPS(1 mg/mL)刺激預(yù)處理后12 h更換成添加有ExiTron nano6000的培養(yǎng)基，對照組直接給予含ExiTron nano6000的培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞用PBS洗3遍，然后檢測兩組細(xì)胞的平均CT值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MicroCT 對正常小鼠肝臟具顯像效果

ExiTron nano6000作為對比劑對小鼠進(jìn)行MicroCT掃描，可清晰顯示小鼠肝臟和脾臟結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 小鼠肝臟和脾臟的二維和三維MicroCT成像Figure 1 Two and Three-dimensional image of normal liver and spleen by MicroCT

表1 各組小鼠血清ALT及AST水平Table 1 Serum ALT and AST level after LPS/D-GalN administration in mice

2.2 MicroCT成像與肝損傷進(jìn)程的關(guān)系

如圖2所示，注射LPS/GalN后，造模3 h小鼠肝臟出現(xiàn)輕度病理改變，肝細(xì)胞腫脹，核染色加深。而6 h時肝組織病理出現(xiàn)明顯的充血壞死，肝細(xì)胞核碎裂，肝小葉結(jié)構(gòu)消失。而血清轉(zhuǎn)氨酶結(jié)果(表1)顯示，LPS/GalN造模后3 h，ALT及AST結(jié)果相較PBS組無明顯升高(P>0.05)，而6 h后出現(xiàn)明顯升高(P<0.05)，表示造模成功。而給同樣處理的小鼠進(jìn)行增強(qiáng)MicroCT掃描，結(jié)果顯示(圖3)，造模3 h，小鼠肝臟明顯強(qiáng)化，平均CT值較0 h明顯升高(P<0.05)，而在6 h降為初始值。這說明MicroCT可在轉(zhuǎn)氨酶升高及病理學(xué)明顯改變之前檢測小鼠爆發(fā)性肝損傷，特別是在肝臟損傷的初始發(fā)病階段就有明顯的影像學(xué)改變。

2.3 MicroCT對肝損傷顯像的機(jī)制

LPS預(yù)處理組的巨噬細(xì)胞RAW264.7的CT值(180.4±10.16 HU)明顯高于對照組(129.0±18.84 HU) (P<0.05)，表明LPS預(yù)刺激增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞吞噬ExiTron nano6000的能力，與大體結(jié)果一致。

圖2 LPS/D-GalN造模后的肝臟病理變化Figure 2 Pathological changes of liver after LPS/D-GalN administration in mice

圖3 LPS/D-GalN造模后小鼠肝臟MicroCT掃描A: scan image; B: average CT valueFigure 3 MicroCT images of liver after LPS/D-GalN administration in mice

3 討論

既往動物實驗，特別是涉及急性損傷的動物實驗都需要消耗大量動物資源。所以開發(fā)一種無創(chuàng)檢測手段具有非常大的應(yīng)用前景[5-8]。小動物的MicroCT顯像與人體的CT顯像有很大區(qū)別，前者必須要有造影劑才能進(jìn)行清晰的軟組織顯像[9-12]。MicroCT最常使用造影劑有Fenestra LC和ExiTron nano等，前者主要由肝細(xì)胞通過載脂蛋白E(apoE)受體通路來吸收，而后者在體內(nèi)主要由網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吸收，在肝內(nèi)主要表現(xiàn)為庫普弗（kupffer）細(xì)胞[13]。這兩種造影劑都已被用在小鼠肝臟腫瘤模型的無創(chuàng)評估中，能清楚顯示肝內(nèi)腫瘤的位置及大小形狀。本研究采用的LPS/D-GalN模型是一種炎性肝損傷, 巨噬細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子a(TNFa)等是介導(dǎo)該損傷初始階段的重要因子。所以本研究采用巨噬細(xì)胞特異性吸收的ExiTron nano 6000為MicroCT造影劑，同時ExiTron nano6000在小鼠體內(nèi)的代謝較為緩慢，注射4 h后就可以達(dá)到平衡狀態(tài)，并可以維持2周到數(shù)月，便于進(jìn)行連續(xù)性無損傷檢測，避免了反復(fù)通過鼠尾靜脈注射所帶來的不便。ExiTron nano已被用于多種含有巨噬細(xì)胞參與的軟組織病變的MicroCT顯像[14,15]。本文結(jié)果表明，用ExiTron nano 6000做造影劑可以清晰顯示肝臟的切面結(jié)構(gòu)及三維立體形態(tài)，并且對脾臟也具有較好的顯像效果。

爆發(fā)性肝損傷是一種常見病，如得不到及時治療，將會發(fā)展為重癥肝炎，病死率非常高。臨床典型特征表現(xiàn)為急性肝功能衰竭，肝組織中大量肝細(xì)胞壞死和凋亡。LPS/D-GalN誘發(fā)的爆發(fā)性肝損傷模型已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究[16,17]，LPS是內(nèi)毒素的主要毒性成分，可介導(dǎo)炎癥因子破壞血管內(nèi)皮的完整性，導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死，D-GalN可快速結(jié)合并消耗大量的尿苷酸，影響肝細(xì)胞蛋白質(zhì)、酶等的生成，增強(qiáng)LPS的作用。LPS/D-GalN肝損傷模型，不僅能模仿內(nèi)毒素性爆發(fā)性肝損傷，同時可用于急性重癥肝炎模型的研究[18]。

既往研究表明[19,20]，在小鼠造模早期，血清中細(xì)胞炎癥因子白細(xì)胞介素6(IL-6)、TNFa、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP1)表達(dá)量就迅速升高，這些炎癥因子活化后，進(jìn)一步激活體內(nèi)的固有免疫應(yīng)答，引起一系列的“炎癥因子風(fēng)暴”，進(jìn)而介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，而肝細(xì)胞壞死產(chǎn)物又會加重炎性反應(yīng)，最終引發(fā)重癥肝炎等不可逆型肝臟疾病。而巨噬細(xì)胞是這一過程中最重要的炎性細(xì)胞[21]。本實驗表明，在LPS/D-GalN毒性早期，小鼠肝臟的MicroCT顯像就有明顯改變，平均CT值明顯升高，說明肝內(nèi)巨噬細(xì)胞吸收ExiTron nano 6000的能力被明顯激活。細(xì)胞實驗也證明，LPS能明顯增強(qiáng)巨噬細(xì)胞系RAW264.7吸收ExiTron nano6000的能力。Streetz 等[22]研究表明，在損傷后期炎癥因子水平均發(fā)生明顯下調(diào)，可能是損傷后期，肝內(nèi)損傷過重，肝臟功能衰竭，造成機(jī)體各種巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的大量壞死，上述細(xì)胞壞死后吞噬功能及釋放炎性因子能力都明顯下降，以致染毒后期血清炎癥因子明顯下降，這也解釋了為什么在損傷后期肝臟在MicroCT顯像中的平均CT值出現(xiàn)明顯下降。

綜上結(jié)果, 低劑量ExiTron nano 6000可以快速清晰提供肝臟和脾臟的顯影。這一顯影效果主要通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)實現(xiàn)的。LPS/D-GalN可造成明顯的爆發(fā)性肝損傷, MicroCT可通過平均CT值的升高反應(yīng)肝臟的病理變化, 且這一影像學(xué)的改變早于肝臟損傷的發(fā)生。目前常用肝損傷動物模型, 如膽道結(jié)扎的淤膽模型、酒精性肝損傷、非酒精性肝病和藥物性肝損傷模型中, 巨噬細(xì)胞均發(fā)揮重要作用。由此可見, 以ExiTron nano 6000為造影劑的MicroCT顯像技術(shù)在小動物肝損傷的無創(chuàng)檢測中具有應(yīng)用前景。

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Non-invasive Assessment of Fulminant Liver Injury with Contrast-Enhanced Micro CT in Mice Models

LI Da-wei1, HUA Xiang-wei1, ZHANG Jiang1, YAO Ju-fang2, DAI Hui-li2, Kong Xian-ming2
(1. Department of Transplantation and Hepatic Surgery, 2. Animal Facility, RenJi Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China)

[Abstract]Objective To explore the potential use and mechanism of MicroCT using ExiTron nano6000 in the assessment of fulminant liver injury in mouse models. Methods Five male C57BL/6 mice were subjected to administration of LPS/D-GalN to develop model of fulminant liver injury. The mice were scanned with MicroCT before the treatment and at 3 h and 6 h after the establishment of liver injury model. The average CT value of liver were analyzed with software for future study. Twenty male mice were divided into 4 groups, 5 mice in each group: Nano 6000 group, the mice were treated with Nano 6000; PBS group, treated with PBS as control; model 3 h group and 6 h group, injected with LPS/D-GalN and sacrificed at 3 h, 6 h after the injection. Pathological damage of the liver were observed by microscope and serum ALT and AST were detected. Results MicroCT with ExiTron nano6000 as contrast agent could provided specific and clear 2 dimensions and 3 dimensions structure of liver and spleen in mice. The average CT value of liver was significantly increased at 3 h after LPS/D-GalN treatment and drop to baseline level at 6 h. In vitro experiments showed that LPS stimulation could enhance the endocytotic ability of macrophages to uptake ExiTron nano6000. Conclusions The Micro CT provided a rapid noninvasive longitudinal monitoring of fulminant liver injury in mice models and may be had good application in future research.

[Key words]Fulminant liver injury; Micro CT; ExiTron nano 6000; Macrophage; Mice

[中圖分類號]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]B

[文章編號]1674-5817(2016)03-0180-06

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.004

[收稿日期]2016-01-12

[基金項目]上海市2014年度“科技創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究領(lǐng)域科技支撐項目(14140902000)

[作者簡介]李大偉(1988-), 博士, 住院醫(yī)師。研究方向: 急性肝損傷 。E-mail: lidawei3000@126.com

[通訊作者]孔憲明, 主任醫(yī)師, 博士生導(dǎo)師。E-mail: kxm666@sohu.com