趙永江, 朱淼鑫, 袁立新, 孫 磊, 耿 沁, 李 靜, 姚 明, 閆明霞(. 上海市同仁醫(yī)院影像介入科, 上海 0003; . 上海市腫瘤研究所, 上海 0003)

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人結(jié)腸癌原位移植瘤裸小鼠模型的活體成像觀察

趙永江1, 朱淼鑫2, 袁立新1, 孫 磊2, 耿 沁2, 李 靜2, 姚 明2, 閆明霞2
(1. 上海市同仁醫(yī)院影像介入科, 上海 200023; 2. 上海市腫瘤研究所, 上海 200032)

[摘要]目的 建立人結(jié)腸癌原位移植瘤裸小鼠模型，探討小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)在結(jié)腸癌原位移植瘤模型中的應(yīng)用。方法 應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法建立同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白及熒光素酶(GFP/ Luc)的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，分別采用組織塊法及培養(yǎng)細(xì)胞法建立裸小鼠結(jié)腸癌原位移植瘤模型，通過小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察腫瘤在腸原位的生長及轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果 成功建立了穩(wěn)定表達(dá)GFP/Luc的人結(jié)腸癌細(xì)胞，并應(yīng)用該細(xì)胞成功建立了結(jié)腸癌原位移植瘤動(dòng)物模型。經(jīng)連續(xù)7周動(dòng)態(tài)觀察表明，隨著腫瘤移植時(shí)間的延長，腹部皮下觸診顯示腫瘤逐漸增大，小動(dòng)物活體成像顯示熒光素表達(dá)面積和強(qiáng)度也逐漸增大。結(jié)論 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠客觀評價(jià)結(jié)腸癌的原位生長及轉(zhuǎn)移情況，為體內(nèi)深部腫瘤的觀察和研究提供了有效的參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]人結(jié)腸癌; 原位移植; 活體成像系統(tǒng); 慢病毒載體

目前，結(jié)腸癌原位移植瘤動(dòng)物模型已被廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌的基礎(chǔ)研究，它能夠模擬臨床患者腫瘤發(fā)展的全過程，為其診斷、治療及機(jī)制研究等提供有用的實(shí)驗(yàn)工具[1]。小動(dòng)物活體成像技術(shù)具有操作簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高、能夠精確定量等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi), 已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面[2]。國內(nèi)在活體成像技術(shù)方面的工作剛剛起步，目前在結(jié)腸癌原位移植模型的研究和應(yīng)用方面報(bào)道較少。本課題擬在建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步應(yīng)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察結(jié)腸癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移情況，旨在為結(jié)腸癌原位移植瘤模型的進(jìn)一步推廣及應(yīng)用提供簡便而可靠的方法，為體內(nèi)深部腫瘤的觀察和研究提供有效的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞株

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116為人低分化腺癌，購于美國模式培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，由上海市腫瘤研究所用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco modified Eagle medium)培養(yǎng)基按常規(guī)方法長期保存和傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級雄性BALB/c-nu/nu小鼠16只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由上海市腫瘤研究所提供[SCXK(滬)2012-0001]，實(shí)驗(yàn)操作及動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照SPF級標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行[SYXK(滬)2012-0001]。

1.3 試劑儀器

真核表達(dá)質(zhì)粒eGFP-2A-CBGr99由德國癌癥研究中心GJ Haemmerling教授惠贈(zèng)，全長5 929 bp，屬氨芐青霉素抗性選擇系統(tǒng)，帶有細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因Amp，在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下可在真核細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)物為GFP與熒光素酶(luciferase，Luc)。pWPXL質(zhì)粒載體，pAX2包裝質(zhì)粒，pMDG2包膜質(zhì)粒及Top10感受態(tài)細(xì)菌均由國家癌基因及相關(guān)基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。熒光底物購自GOLD Bio Technology公司。Matrigel購自美國BD公司; 胎牛血清購自Biowest公司; 胰蛋白酶購自Gibco公司; 培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自Corning公司; 慶大霉素購自上海中西制藥有限公司; 戊巴比妥鈉購自上海西唐生物科技有限公司; 其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)購自德國Berthold Technologies GmbH＆Co.KG，儀器型號為LB983 NC320，分析軟件為WinLight32，320萬像素的冷CCD，濾光片的光譜范圍為300～1 100 nm。熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染的熒光標(biāo)記方法

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、慢病毒載體構(gòu)建、慢病毒感染等具體方法詳見文獻(xiàn)[3]。

1.5 結(jié)腸癌原位移植瘤模型的建立及觀察

1.5.1 組織塊法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型 具體步驟如下：(1)將皮下移植瘤作為瘤源，將腫瘤組織放置在含慶大霉素的生理鹽水中，用無菌眼科剪剔除出血及壞死部分，分割成若干直徑1.5 mm大小的組織塊備用；(2)小鼠術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠；(3)將小鼠仰臥位固定，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒表面皮膚；(4)根據(jù)解剖部位，于盲腸位置取腹部側(cè)切口，尋找到盲腸，鉗出盲腸，于盲腸末端用手術(shù)剪刀輕輕劃破漿膜面，用無齒鑷將盲腸末端向內(nèi)推壓，使局部形成壁龕，將切好備用的腫瘤組織小塊塞入壁龕內(nèi)，將盲腸回納入腹腔，可吸收線逐層連續(xù)縫合關(guān)腹；(5)傷口再次消毒后裸小鼠放入籠中飼養(yǎng)并定時(shí)觀察。

1.5.2 培養(yǎng)細(xì)胞法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型 具體步驟如下：(1)收集體外培養(yǎng)生長旺盛的連續(xù)傳代細(xì)胞，離心，計(jì)數(shù)，用PBS或不含血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.33×108/mL個(gè)細(xì)胞，與Matrigel基質(zhì)膠按1∶1混勻，置冰上備用; (2)小鼠術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠; (3)將小鼠仰臥位固定, 體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒表面皮膚; (4)根據(jù)解剖部位, 于盲腸部分取腹部側(cè)切口, 尋找到盲腸，鉗出盲腸。接種時(shí)將備用的細(xì)胞吹打混勻，用微量注射器取30 mL接種于每只小鼠盲腸部；(5)將盲腸回納入腹腔，可吸收線逐層連續(xù)縫合關(guān)腹; (6)傷口再次消毒后放入籠中飼養(yǎng)，定時(shí)觀察移植瘤的生長情況和裸小鼠的活動(dòng)狀態(tài)。

1.5.3 小動(dòng)物活體成像觀察 結(jié)腸癌原位移植后使用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)每周一次定時(shí)檢測熒光素酶在裸小鼠體內(nèi)的表達(dá)，曝光時(shí)間為10 min，定量分析各時(shí)間點(diǎn)的熒光值，連續(xù)觀察7周。在動(dòng)物處于瀕死狀態(tài)時(shí)，處死荷瘤裸小鼠，行詳細(xì)的解剖學(xué)觀察移植瘤生長情況，周圍臟器受累情況，腹腔內(nèi)及腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，肝、腎、肺、脾等多個(gè)器官有無轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP/Luc的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞的建立

人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞為多角形，細(xì)胞邊界清楚，呈上皮樣單層排列，采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行GFP/Luc雙重標(biāo)記后，熒光顯微鏡下觀察可見，在藍(lán)光激發(fā)下HCT-116細(xì)胞發(fā)出微弱的綠色熒光，熒光分布不均勻，表達(dá)率僅為30%左右，經(jīng)連續(xù)流式細(xì)胞術(shù)分選后，細(xì)胞的熒光表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均呈顯著提高，3次分選后熒光表達(dá)率接近80%，個(gè)別處于有絲分裂期的細(xì)胞表達(dá)的熒光信號極強(qiáng)(圖1)。

2.2 組織塊法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型的活體成

像動(dòng)態(tài)觀察

將組織學(xué)完整的GFP/Luc雙重標(biāo)記的瘤組織塊移植于8只裸小鼠腸原位, 并對結(jié)腸原位移植瘤的生長情況進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)觀測。結(jié)果表明, 原位移植術(shù)后未出現(xiàn)動(dòng)物死亡。1～2周對小鼠腹部進(jìn)行肉眼觀察和皮下觸診, 結(jié)果均無包塊形成。3周時(shí)皮下觸診移植部位無明顯變化, 行活體成像觀察可見小鼠腹部移植部位有熒光素表達(dá), 但熒光素的表達(dá)量較弱,平均表達(dá)面積為60.79±28.01 mm2, 總熒光光子數(shù)440 565.00±51 212.92 ph/s-1·mm-2。4周時(shí)皮下觸診可觸及到左下腹有質(zhì)地略硬的包塊, 活體成像觀察可見左下腹發(fā)光區(qū)域面積增大，熒光光子數(shù)表達(dá)增強(qiáng)。5～6周時(shí), 隨著移植時(shí)間的延長, 皮下觸診腫瘤逐漸增大, 活體成像檢測到的熒光素表達(dá)面積和強(qiáng)度也逐漸增大。7周時(shí), 部分動(dòng)物腹部皮下能夠觀察到腫瘤略突出于腹部表面, 活體成像觀察可見平均熒光素表達(dá)面積為126.70±33.37 mm2, 總熒光光子數(shù)為2 218 648.00±174 726.09 ph/ s-1·mm-2(以2只代表性受試動(dòng)物為例, 圖2)。

圖1 穩(wěn)定表達(dá)GFP/Luc的HCT-116細(xì)胞(100×)Figure 1 Stable GFP/Luc expressing HCT-116 cells in vitro (100×)

圖2 組織塊法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型的活體成像動(dòng)態(tài)觀察Figure 2 The orthotopic transplantation models were established by using tumor tissue pieces method in colon cancer and dynamic observatio nusing in vivo biofluorescent imaging system

2.3 培養(yǎng)細(xì)胞法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型的活體成像動(dòng)態(tài)觀察

圖3 培養(yǎng)細(xì)胞法建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型的活體成像動(dòng)態(tài)觀察Figure 3 The orthotopic transplantation models were established by using cell culture method in colon cancer and dynamic observation using in vivo biofluorescent imaging system

將GFP/Luc雙重標(biāo)記的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116原位接種于8只裸小鼠盲腸末端, 術(shù)后無動(dòng)物死亡,采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察結(jié)腸癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果顯示: 原位移植術(shù)后1～2周時(shí), 對小鼠腹部進(jìn)行皮下觸診和活體成像觀察, 均未發(fā)現(xiàn)形成腫瘤包塊。3周時(shí)皮下觸診移植部位無明顯變化, 行活體成像觀察可見約50%小鼠腹部有熒光素表達(dá), 但由于動(dòng)物個(gè)體差異, 熒光素表達(dá)的強(qiáng)弱和面積略有不同。5周時(shí)大部分動(dòng)物腹部皮下可觸及到質(zhì)地略硬的包塊, 如黃豆粒大小, 活體成像觀察可見左下腹發(fā)光區(qū)域面積增大, 熒光光子數(shù)表達(dá)增加。6周時(shí), 行活體成像觀察可見部分動(dòng)物的熒光素表達(dá)分布于全腹。7周時(shí), 皮下觸診發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物腹部的腫瘤略突出于腹部表面, 活體成像觀察可見熒光表達(dá)面積為189.91±40.01 mm2, 總熒光光子數(shù)為11 468 637.58±2 689 654.18 ph/s-1·mm-2,部分動(dòng)物的熒光素表達(dá)遍布全腹, 表達(dá)的面積和強(qiáng)度較前6周有所增強(qiáng)(以2只代表性受試動(dòng)物為例, 圖3)。采用頸椎脫臼法處死荷瘤裸小鼠, 行詳細(xì)的解剖學(xué)觀察移植瘤生長及轉(zhuǎn)移情況, 可見移植瘤與周圍臟器出現(xiàn)粘連, 腫瘤壓迫周圍腸管, 部分動(dòng)物出現(xiàn)肝、脾等臟器轉(zhuǎn)移, 肉眼觀察與活體成像觀察結(jié)果基本相一致。

3 討論

生物發(fā)光是一種非放射性、非損傷、高靈敏度、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的檢測技術(shù)，近幾年在生物醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷、食品及環(huán)境檢測等方面得到了越來越廣泛應(yīng)用。GFP/Luc雙重標(biāo)記技術(shù)是將熒光成像和化學(xué)發(fā)光技術(shù)有機(jī)結(jié)合，不僅突出了GFP和Luc單一標(biāo)記技術(shù)的各自優(yōu)勢，而且突破了各自局限，結(jié)合運(yùn)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，能夠直接檢測腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的生長及轉(zhuǎn)移情況，應(yīng)用前景廣泛[4]。國內(nèi)已有關(guān)于應(yīng)用GFP/Luc雙重標(biāo)記技術(shù)建立胃癌、肝癌等動(dòng)物模型的報(bào)道[5,6]，但該技術(shù)在結(jié)腸癌模型方面的報(bào)道較少。目前，在結(jié)腸癌動(dòng)物模型效果評價(jià)中，研究者大多以單一標(biāo)記的GFP作為熒光標(biāo)記，如楊柏霖等[7]利用GFPpLPCX逆轉(zhuǎn)錄病毒建立了表達(dá)GFP的人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞及結(jié)腸癌原位移植瘤動(dòng)物模型，利用熒光影像系統(tǒng)在不同時(shí)間點(diǎn)觀察裸小鼠原位移植瘤的生長、轉(zhuǎn)移情況; 竺平等[8]建立了表達(dá)GFP的HCT-116細(xì)胞及結(jié)腸癌原位移植瘤模型，每周2次在體外熒光影像系統(tǒng)下觀察移植腫瘤大小，從而研究藤黃對人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞原位生長及轉(zhuǎn)移的抑制作用。但GFP的波長較短，體內(nèi)穿透力較弱，由于結(jié)腸位于動(dòng)物體內(nèi)深部，以GFP作為標(biāo)記可能會(huì)導(dǎo)致熒光信號的損失，從而不能準(zhǔn)確反映腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移情況。本研究中，以GFP/Luc雙重標(biāo)記的結(jié)腸癌細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料，體外實(shí)驗(yàn)中著重利用GFP可以在體外直接進(jìn)行熒光顯微鏡檢測及便于細(xì)胞分選的特點(diǎn)，從而評價(jià)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的高低; 體內(nèi)成像時(shí)著重利用Luc作為化學(xué)發(fā)光所具有的背景噪音低、特異性高、穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、全方位觀測深部腫瘤的生長情況，從而獲取可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示3周時(shí)盡管皮下觸診移植部位無明顯變化，但小動(dòng)物活體成像已能夠觀察到小鼠腹部移植部位有熒光素表達(dá)，說明熒光素酶檢測的穿透力強(qiáng)，且隨著移植腫瘤的增大，活體成像檢測到的熒光素表達(dá)面積和強(qiáng)度也逐漸增大，二者呈正比關(guān)系，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)能夠較好地動(dòng)態(tài)監(jiān)測體內(nèi)結(jié)腸癌生長與轉(zhuǎn)移的全過程。

目前，結(jié)腸癌原位移植瘤模型建立的方法較為成熟，已廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)理、抗腫瘤藥效學(xué)、治療等多方面研究[9-11]。建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型通常采用組織塊法或培養(yǎng)細(xì)胞法，二者各有優(yōu)勢。組織塊法保留了腫瘤細(xì)胞外的基質(zhì)成分，能夠更好地保持組織結(jié)構(gòu)的完整性; 細(xì)胞培養(yǎng)法易于定量，操作簡便。本研究中同時(shí)進(jìn)行了兩種方法的移植(接種)，結(jié)果顯示，兩種方法都能成功建立結(jié)腸癌原位移植瘤模型，并能夠模擬臨床患者腫瘤生長的過程。但在實(shí)驗(yàn)中觀察到，由于結(jié)腸的漿膜層與肌層之間空間小，接種腫瘤細(xì)胞后易造成細(xì)胞倒流，因此對細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行了一定改良，采用Matrigel基質(zhì)膠與腫瘤細(xì)胞1∶1混勻接種，利用Matrigel基質(zhì)膠在常溫下可迅速凝固成膠的特點(diǎn)從而有效防止細(xì)胞倒流。

總之，通過對人結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行GFP/Luc雙重標(biāo)記，并利用活體熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、連續(xù)地觀察結(jié)腸癌的生長及轉(zhuǎn)移情況，能夠?yàn)樯钊胙芯拷Y(jié)腸癌的體內(nèi)生物學(xué)特性提供有力幫助。

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Dynamic Observation on In vivo Biofluorescent Imaging of Orthotopic Transplant Model of Human Colon Cancer in Nude Mice

ZHAO Yong-jiang1, ZHU Miao-xin2, YUAN Li-xin1, SUN Lei2, GENG Qin2, LI Jing2, YAO Ming2, YAN Ming-xia2
(1. Department of Interventional Radiology, Shanghai Tongren Hospital, Shanghai 200023, China; 2. Department of Experimental Pathology, Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032, China)

[Abstract]Objective To establish an orthotopic transplant nude mice model of human colon cancer and discuss the application of in vivo biofluorescent imaging system in animal model. Methods Human colon cancer cells were tranfected with green fluorescent protein/Luciferase gene by lentiviral vector, they were orthotopically transplanted into the cecum of nude mice by using tumor tissues or cell culture method. The tumor growth and metastasis were dynamically observed by using in vivo biofluorescent imaging system. Results The human colon cancer cell line and orthotopic transplant nude mice model were successfully established, which could display stable high-level GFP/Luc expression in vitro and in vivo. In vivo biofluorescent images showed that the fluorescent areas and intensities were increased gradually with the increase of tumor volume in nude mice during 7 weeks of dynamic observation. Conclusions In vivo biofluorescent imaging system was fitted for evaluation and quantitation of the tumor growth and metastasis of colon cancer. It would provide effective reference for the observation and study of in vivo deep tumors.

[Key words]Human colon cancer; Orthotopic transplantation; In vivo imaging system; Lentiviral vector

[中圖分類號]Q95-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號]1674-5817(2016)03-0174-06

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.003

[收稿日期]2016-03-04

[基金項(xiàng)目]上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”項(xiàng)目(13140900502; 13140902102)

[作者簡介]趙永江(1965-), 男, 主治醫(yī)師。E-mail: czxtjzx@126.com

[通訊作者]閆明霞, 女, 醫(yī)學(xué)博士, 副研究員, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)病理學(xué)。E-mail: mingxia_yan@126.com