付國良, 單金紅, 胡燕紅, 謝金珠, 晏燕花, 黃曉紅(. 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 3507; 2. 江西省東鄉(xiāng)縣第一中學(xué)， 江西 東鄉(xiāng) 33800)

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刺激隱核蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶的分子特征

付國良1, 2, 單金紅1, 胡燕紅1, 謝金珠1, 晏燕花1, 2, 黃曉紅1
(1. 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 350117; 2. 江西省東鄉(xiāng)縣第一中學(xué)， 江西 東鄉(xiāng) 331800)

從刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)滋養(yǎng)體/包囊前體cDNA文庫中篩選出了甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(CiGAPDH), 定點(diǎn)誘變CiGAPDH基因開放閱讀框內(nèi)的非通用密碼子后, 構(gòu)建其原核表達(dá)載體pGEX-4T-3/CiGAPDH, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3)中, 用異丙基硫式-B-D-半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá), 結(jié)果大腸桿菌成功表達(dá)了rCiGAPDH蛋白。用抗rCiGAPDH蛋白的鼠血清進(jìn)行免疫印跡分析, 結(jié)果抗血清能夠識別刺激隱核蟲各期蟲體的天然CiGAPDH蛋白, 其表觀分子質(zhì)量為37.3 ku, 與根據(jù)氨基酸序列推算的理論值相符; 實(shí)驗(yàn)表明rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性, 而且CiGAPDH在生活史的各階段均有表達(dá), 符合持家基因的特征。利用間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)(IFAT)檢測天然CiGAPDH蛋白在刺激隱核蟲幼蟲上的定位, 結(jié)果表明天然CiGAPDH蛋白主要分布在幼蟲的細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 且在胞口位置分布最多。對CiGAPDH的進(jìn)一步研究可能為刺激隱核蟲感染的藥物靶點(diǎn)的尋找多條線索。

刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans); 甘油醛-3-磷酸脫氫酶; 原核表達(dá); 定位

[Foundation : The work was supported by grants from JK project from Fujian Provincial Department of Education (JK2013008), Natural Science Foundation of Fujian Province (2014J01120), and Major Project in Agriculture of Fujian Province (2013NZ0002-5)]

刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)是一種寄生于熱帶、亞熱帶海水魚皮膚和鰓部的遍身性纖毛蟲,隸屬于前口綱(Prostomatea)、前管目(Prorodontida)、隱核蟲科(Crytocaryonidae)、隱核蟲屬(Cryptocaryon)[1]。刺激隱核蟲最早于1937年由日本學(xué)者Sikama在海水觀賞魚身上發(fā)現(xiàn)[2], 其生活史大致可分為滋養(yǎng)體(trophonts)、包囊前體(protomonts)、包囊(tomonts)和幼蟲(theronts) 等4個階段[3], 幼蟲對魚類血清和黏液有趨向性, 可主動尋找宿主[4]。它的宿主范圍廣泛, 除瑩斑籃子魚(Siganus oramin)外, 幾乎所有海水硬骨魚類都是刺激隱核蟲的易感宿主[5-6]。刺激隱核蟲病以病魚皮膚、鰓和眼出現(xiàn)大量小白點(diǎn)為特征, 俗稱“海水小瓜蟲病”[3, 7]或“白點(diǎn)病”[3]。由于刺激隱核蟲在適宜條件下, 完成一個生活史所需的時間很短(不到一周),而且繁殖率又很高, 每輪生活史蟲數(shù)可增加200多倍, 很容易在密度大的養(yǎng)殖魚類中爆發(fā)流行, 造成魚類的群體死亡, 給海水硬骨魚的集約化養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此, 尋找有效的防治方法至關(guān)重要。目前, 由于對刺激隱核蟲的病原生物學(xué)缺乏深入研究, 尚無有效且安全的預(yù)防和治療方法。雖然采用物理和化學(xué)藥物治療[8]及中草藥治療[9]刺激隱核蟲病, 能起到一定的效果, 但或多或少都存在一些不足, 如藥物對魚的毒性, 魚體活力下降、停止攝食、藥物在魚體內(nèi)的殘留等, 既不能徹底治愈刺激隱核蟲病, 還會造成食品安全和環(huán)境污染隱患。隨著基因重組和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用, 從分子水平上研究刺激隱核蟲的病原學(xué), 進(jìn)而尋找有效防治方法已成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是維持生物生命活動的一個關(guān)鍵酶, 參與糖酵解、糖原異生以及卡爾文循環(huán)等能量代謝過程, 與ATP的合成密切相關(guān)[10]。該酶參與細(xì)胞的基本代謝過程, 其編碼基因被認(rèn)為是持家基因[11]。GAPDH幾乎在所有組織中都高水平表達(dá)且通常在同種組織或細(xì)胞中表達(dá)量基本恒定, 所以被廣泛作為抽提總RNA及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)等操作的標(biāo)準(zhǔn)化依據(jù)[12]; 其主要功能是在各組織細(xì)胞中以四聚體的形式催化3-磷酸甘油醛生成1, 3-二磷酸甘油酸, 是糖酵解反應(yīng)的關(guān)鍵酶。隨著對GAPDH 功能的深入研究, 人們發(fā)現(xiàn)GAPDH 除了作為關(guān)鍵酶參與能量代謝外, 還參與許多其他生理功能, 如參與DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)[13-14]、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]、參與膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)[16]等, 從而引起細(xì)胞功能的變化, 因此GAPDH是一個多功能酶,與生物體內(nèi)能量產(chǎn)生以及生命活動正常有序的進(jìn)行密切相關(guān)。雖然目前針對GAPDH的研究報道很多,但有關(guān)刺激隱核蟲甘油醛-3-磷酸脫氫酶(CiGAPDH)基因的相關(guān)報道至今未見。作者根據(jù)刺激隱核蟲cDNA文庫中的EST序列信息, 篩選得到含刺激隱核蟲GAPDH基因(Genbank登錄號: KP662711)的克隆, 構(gòu)建了pGEX-4T-3/CiGAPDH的重組質(zhì)粒, 在E. coli BL21(DE3)菌中進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了親和層析純化和鑒定, 以期為進(jìn)一步研究CiGAPDH在刺激隱核蟲的能量代謝及其在生長、發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ), 為研究刺激隱核蟲病原生物學(xué)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

刺激隱核蟲XP7.2蟲株于2009年7月采自福建霞浦, 并在本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用宿主魚是褐菖鮋(Sebastiscus marmoratus), 購自福建馬尾海產(chǎn)批發(fā)市場, 無特定病原(specific pathogen free , SPF)級昆明小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司。刺激隱核蟲XP7.2株的滋養(yǎng)體cDNA文庫由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。含重組質(zhì)粒pTripIEx2/CiGAPDH的Escherichia coli BM25.8、E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)、pGEX-4T-3均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 CiGAPDH基因序列及其蛋白的分子進(jìn)化分析

根據(jù)EST序列信息找出對應(yīng)的細(xì)菌克隆后, 再利用pTripIEx2上的一對通用引物(上游引物為5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′, 下游引物5′-TAA TACGACTCACTATAGGG-3′)進(jìn)行測序.將測序結(jié)果與Genbank中的已知基因進(jìn)行比對, 鑒定出這個基因?yàn)镚APDH, 然后使用在線軟件找出CiGAPDH基因的開放閱讀框及推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列, 并對氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域以及亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測,再利用Mega4.0軟件以NJ法構(gòu)建CiGAPDH基因的系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.3 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測CiGAPDH基因的時空表達(dá)情況

首先根據(jù)CiGAPDH及CiActin基因的開放閱讀框, 分別設(shè)計(jì)CiGAPDH及CiActin基因的特異性引物。CiGAPDH基因的上游引物序列: (CP1)5′-ACGGATCCATGGCTGATAAACATTAC-3′; 下游引物序列: (CP2)5′-ACCTCGAGTCAATGTAAATT TCCATC-3′, CiActin基因的上游引物序列(AP1)5′-ATGGCCGAAGACTAACAAGCAG-3′; 下游引物: (AP2)5′-TCAGAAGCATTTTCTGTGTACA-3′。用Trizol試劑盒(Takara, 大連)分別提取刺激隱核蟲滋養(yǎng)體/前包囊、包囊、幼蟲各期蟲體總RNA,用微量分光光度計(jì)檢測提取的總RNA濃度。按照RNA PCR 試劑盒(avian myeloblastosis virus, AMV)Ver.3.0(Takara, 大連)的說明建立10 μL反應(yīng)體系, 分別逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)發(fā)育期蟲體的單鏈cDNA。反應(yīng)條件為: 30℃10 min、42℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 5 min。以上述制備的各期蟲體的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 分別加入引物AP1、AP2擴(kuò)增CiGAPDH, 加入AP1、AP2擴(kuò)增CiActin, 反應(yīng)條件為: CiGAPDH基因?yàn)?94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min 10 s) ×30個循環(huán)。內(nèi)參基因CiActin為(94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min 20 s)×30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, 檢測CiGAPDH基因在刺激隱核蟲各期蟲體中的時空表達(dá)情況。

1.4 CiGAPDH基因的定向誘變及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

CiGAPDH基因的開放閱讀框中含有3個非通用密碼子(2個TAA和1個TAG), 為了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)里成功表達(dá), 需要將它們誘變?yōu)镃AA和CAG,根據(jù)CiGAPDH的基因序列, 按照GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System試劑盒(Invitrogen, 加利福尼亞州, 美國)說明書設(shè)計(jì)誘變引物(表1)。按照質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(Biospin Plasmid DNA Extraction Kit)(BioFlux, 杭州)的操作說明, 提取重組質(zhì)粒pTripIEx2/CiGAPDH后進(jìn)行質(zhì)粒的甲基化反應(yīng), 產(chǎn)物作為誘變PCR反應(yīng)的模板, 加入142th誘變引物, 配制誘變反應(yīng)液進(jìn)行PCR反應(yīng), 形成誘變后的線性質(zhì)粒分子; 將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到E. coli DH5α細(xì)胞, 甲基化過的模板質(zhì)粒DNA被McrBC內(nèi)切酶酶切, 只剩下誘變好的線性質(zhì)粒在細(xì)菌內(nèi)環(huán)化。然后送往生工生物工程股份有限公司測序, 用BioEdit進(jìn)行序列對比分析正確后, 用同樣的方法依次對187th和919th位點(diǎn)進(jìn)行誘變。根據(jù)誘變后的CiGAPDH基因開放閱讀框的序列, 設(shè)計(jì)亞克隆引物, 上游引物序列: 5′-ACGGATCC ATGGCTGATAAACATTAC-3′(下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)); 下游引物序列5′-ACCTCGAGTCAATGTAAATTTCCATC-3′(下劃線為 Xho I酶切位點(diǎn))。以三次誘變成功后的重組質(zhì)粒pTripIEx2/CiGAPDH為模板, 加入亞克隆引物進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)條件為: (94℃30 s, 54℃30 s, 72℃ 1 min 10 s)×30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收。用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I(Takara,大連)和Xho I(Takara, 大連)分別雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和載體pGEX-4T-3, 酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收并純化, 按1∶3的摩爾比混合載體片斷與目的基因片斷, 加入T4連接酶將回收的片段連接起來, 目的基因片段重組至原核表達(dá)載體pGEX-4T-3上, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α, 挑取陽性克隆在生工生物工程有限公司測序鑒定。

表1 CiGAPDH基因各誘變位點(diǎn)的誘變引物Tab. 1 Mutagenic primers of CiGAPDH

1.5 重組蛋白rCiGAPDH在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)細(xì)胞中, 37℃過夜培養(yǎng), 挑取單菌落于LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 mg/L)中, 37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜后, 培養(yǎng)物以1∶100的比例稀釋, 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)數(shù)小時至A600約為0.3~0.5, 加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG) (生工生物工程股份有限公司, 上海)至終濃度為0.5 mmol/L, 28℃ 180 r/min誘導(dǎo)外源基因表達(dá)4 h。隨后10000 r/min離心10 min收集菌體, 用4℃預(yù)冷的TNE 緩沖液重懸菌體, 加入溶菌酶至濃度100 mg/L, 放置1~2 min置于冰上進(jìn)行超聲破碎, 4℃ , 10000 r/min離心20 min, 收集上清和沉淀。取部分上清用谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase, GST)SefinoseTMResin純化膠(GST SefinoseTMResin) (生工生物工程股份有限公司, 上海)純化。將菌體沉淀、菌體上清、純化后的rCiGAPDH蛋白和GST分別加入等體積的2倍濃度的樣本緩沖液中, 沸水中加熱變性5 min, 進(jìn)行SDS-PAGE(濃縮膠為3%, 分離膠為12%), 最后用考馬斯亮藍(lán)G250染色, 鑒定重組蛋白的表達(dá), BCA蛋白定量檢測試劑盒(生工生物工程股份有限公司,上海)測定蛋白濃度。

1.6 抗rCiGAPDH和GST蛋白鼠血清的制備

將純化的rCiGAPDH和GST蛋白(由于重組蛋白含有GST蛋白, 所以免疫小鼠時用GST做對照) 在PBS中透析并調(diào)節(jié)濃度后, 分別與等體積的弗氏佐劑(Sigma, 上海)充分乳化后腹腔注射6周齡的SPF級雌性昆明小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司, 上海), 抗原蛋白劑量為80 μg/鼠。隨后加強(qiáng)免疫2次, 每次免疫間隔時間為兩周。其中第一次免疫用弗氏完全佐劑, 加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。免疫完成10 d之后從免疫小鼠的心臟穿刺取血, 分離抗rCiGAPDH和GST蛋白鼠血清, –30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)鑒定重組蛋白的表達(dá)

蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后, 電轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上, 電轉(zhuǎn)結(jié)束后PVDF膜用3%的脫脂奶粉37℃封閉1 h, 加抗血清(1∶100稀釋), 37℃孵育1 h.用PBS振蕩清洗膜3次后加作為第二抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(MP biomedicals, 加利福尼亞州, 美國)(1∶1000), 37℃孵育1 h.鄰苯二胺(DAB, 0.5 mg/mL)顯色后, 用滅菌去離子水終止顯色反應(yīng)。

1.8 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(Indirect Immunofluorescent Antibody Test, IFAT)檢測天然CiGAPDH蛋白在幼蟲中的定位

收集刺激隱核蟲幼蟲用0.5%的甲醛溶液固定30 min, 離心(1500 r/min, 5 min), 棄上清, 取100只左右的幼蟲制片, 加抗rCiGAPDH蛋白鼠血清(1∶100稀釋于IFAT稀釋液中), 對照組加抗GST鼠血清(1∶100稀釋于IFAT稀釋液中), 37℃孵育1 h。PBS洗玻片3次后分別加入Alexa 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Invitrogen, 加利福尼亞州, 美國)(1∶100稀釋于IFAT稀釋液中), 37℃孵育1 h。4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染核,抗熒光淬滅PVP封片液(碧云天, 上海)封片, 觀察并拍照。

2 結(jié)果及分析

2.1 CiGAPDH基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

該基因的cDNA全長是1143 bp, 開放閱讀框?yàn)?035 bp, 可編碼344個氨基酸, 序列信息詳見圖1。預(yù)測CiGAPDH蛋白的分子質(zhì)量約為37.3 ku, 理論等電點(diǎn)pI為6.66。該基因的開放閱讀框中含有3個非通用密碼子, 兩個TAA和一個TAG。它們在其他大多數(shù)生物中為終止密碼子。為了能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)里表達(dá)CiGAPDH基因, 需要將它們誘變?yōu)榫幋a谷氨酰胺的通用密碼子CAA和CAG。CiGAPDH蛋白含兩個結(jié)構(gòu)域, 即位于N端的輔酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域和位于C端的催化結(jié)構(gòu)域, 詳見圖2。用在線軟件PSORT Prediction對刺激隱核蟲CiGAPDH蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)CiGAPDH蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)CiGAPDH和海水派金蟲及四膜蟲的GAPDH同屬一個進(jìn)化枝(圖3),說明它們彼此的親緣關(guān)系較近, 這與它們同屬于纖毛蟲這一生物學(xué)分類地位相符。

2.2 CiGAPDH基因的時空表達(dá)情況分析結(jié)果

圖1 CiGAPDH基因的開放閱讀框及其編碼蛋白的氨基酸序列Fig. 1 The full-length cDNA sequence of CiGAPDH and its deduced amino acid sequence

以刺激隱核蟲滋養(yǎng)體/前包囊期、包囊和幼蟲的單鏈cDNA為模板, CiGAPDH基因的特異性引物(CP1, CP1)為引物, 體外擴(kuò)增CiGAPDH基因后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(以CiActin基因作為內(nèi)參基因), 大約在1035bp處均有條帶(圖4), 與理論值相符。表明CiGAPDH基因在刺激隱核蟲各發(fā)育階段均有表達(dá),符合GAPDH基因?yàn)槌旨一虻男再|(zhì)。

圖2 刺激隱核蟲CiGAPDH蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 2 The predicted conserved domain of CiGAPGH from C. irritans

圖3 基于11種不同GAPDH蛋白氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 3 Neighbor-joining phylogeny tree of 11 GAPDH proteins

圖4 CiGAPDH基因在刺激隱核蟲不同發(fā)育期的表達(dá)情況Fig. 4 CiGAPDH expression in C. irritans at different stages

2.3 CiGAPDH基因的定向誘變

從刺激隱核蟲的cDNA文庫中篩選克隆的CiGAPDH基因依次進(jìn)行3次定向誘變, 每次誘變后均對目標(biāo)序列經(jīng)過測序確認(rèn)誘變結(jié)果。并利用BioEdit軟件比對誘變前后序列, 結(jié)果表明所有需要誘變位點(diǎn)的T堿基都變成了C堿基。以誘變后的重組質(zhì)粒pTripIEx2/CiGAPDH為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示, 在約1035bp處出現(xiàn)目的條帶(圖5), 與預(yù)期的基因長度值相符。

圖5 CiGAPDH基因的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 5 Amplification of the modified ORF of CiGAPDH

2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

上述PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切, 與同樣進(jìn)行雙酶切的 pGEX-4T-3連接, 得到重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/CiGAPDH, 轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。隨機(jī)挑取3個單菌落并用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定, 酶切產(chǎn)物與預(yù)期大小一致(圖6)。提取初步鑒定成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序, 結(jié)果顯示插入基因與誘變后的CiGAPDH基因完全一致, 證明CiGAPDH基因被成功插入到pGEX-4T-3中, 即pGEX-4T-3/CiGAPDH構(gòu)建成功。

2.5 重組蛋白rCiGAPDH的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/CiGAPDH轉(zhuǎn)化入E. coliBL21(DE3)細(xì)胞中, 用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h后, 超聲破碎, 離心后收集上清和沉淀進(jìn)行檢測, 并用GST純化膠對上清中的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示: 在分子質(zhì)量約為63.3 ku處有一明顯條帶, 與GST-CiGAPDH融合蛋白的預(yù)期大小一致(CiGAPDH的分子質(zhì)量37.3 ku, GST為26 ku), 在可溶相和不溶相中均有表達(dá), 說明CiGAPDH基因在大腸桿菌中成功表達(dá)(圖7)。

圖6 重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/ CiGAPDH的雙酶切鑒定Fig. 6 Identification of the recombinant plasmid pGEX-4T-1/CiGAPDH by double restriction digestion

圖7 大腸桿菌表達(dá)重組蛋白rCiGAPDH的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig. 7 Prokaryotic expression of recombinant CiGAPDH analyzed by SDS-PAGE

2.6 重組蛋白rCiGAPDH的免疫印跡試驗(yàn)鑒定結(jié)果

刺激隱核蟲滋養(yǎng)體/前包囊、包囊和幼蟲全蟲蛋白經(jīng)SDS-PAGE后, 電轉(zhuǎn)到PVDF膜上, 并以GST作對照, 用抗rCiGAPDH免疫鼠血清和抗GST免疫鼠血清分別做第一抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)分析(圖8)。結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為37.3 ku處均有一條特異性反應(yīng)條帶, 說明刺激隱核蟲內(nèi)源性CiGAPDH的分子質(zhì)量是37.3 ku, 與理論預(yù)測值相符; 其次, Ci-GAPDH蛋白在刺激隱核蟲各期蟲體內(nèi)均有表達(dá); 結(jié)果還表明rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性。

圖8 免疫印跡試驗(yàn)分析rCiGAPDH蛋白免疫鼠血清與刺激隱核蟲天然CiGAPDH蛋白的抗原抗體反應(yīng)Fig. 8 Western blot analysis of native CiGAPDH from C. irritans with mouse antiserum against rCiGAPDH

2.7 天然CiGAPDH蛋白在刺激隱核蟲幼蟲中的定位

以抗rCiGAPDH蛋白免疫鼠血清為第一抗體、Alexa 594標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為第二抗體, 同時以抗GST鼠血清作對照, 運(yùn)用IFAT法檢測天然CiGAPDH蛋白在刺激隱核蟲幼蟲中的定位(圖9)。結(jié)果顯示天然CiGAPDH蛋白主要分布在刺激隱核蟲幼蟲的細(xì)胞質(zhì)內(nèi), 且在胞口位置分布最多, 這與CiGAPDH蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測的結(jié)果是一致的。

3 討論

刺激隱核蟲病嚴(yán)重危害我國東南沿海的經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖業(yè), 被農(nóng)業(yè)部列入二級動物疫病名錄[17-18],對該病防治的重要性可見一斑。從分子生物學(xué)水平深入了解其病原生物學(xué)將對阻斷該病的傳播具有積極的意義。本實(shí)驗(yàn)通過對克隆自刺激隱核蟲的GAPDH同源基因(CiGAPDH)的序列分析、對重組蛋白的特征的分析、以及通過重組蛋白制備免疫血清,對刺激隱核蟲各個發(fā)育期的內(nèi)源蛋白的表達(dá)和定位的分析和檢測, 證實(shí)了該基因確屬于GAPDH家族基因, 具有如下特征: CiGAPDH編碼的多肽鏈中包含兩個蛋白結(jié)構(gòu)域, 即位于N端的輔酶NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域和位于C端的催化結(jié)構(gòu)域, 這是該家族蛋白的顯著特征; 該多肽鏈與海水派金蟲及四膜蟲的GAPDH同屬一個進(jìn)化枝, 彼此的親緣關(guān)系較近, 這與它們同屬于纖毛蟲這一生物學(xué)傳統(tǒng)分類地位相符;從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上都可以看出, CiGAPDH 在生活史各期均有表達(dá), 符合持家基因的性質(zhì); 而且重組蛋白的表觀分子量和內(nèi)源蛋白的表觀分子量均符合根據(jù)基因編碼序列推測出的理論值; CiGAPDH主要分布于細(xì)胞質(zhì)中, 這與GAPDH主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)催化糖酵解反應(yīng)這一功能相適應(yīng); CiGAPDH基因還具有一些纖毛蟲基因的特點(diǎn): CiGAPDH基因的開放閱讀框中含有3個編碼谷氨酰胺的非通用密碼子(2個TAA和1個TAG, 它們在其他大多數(shù)生物中卻為終止密碼子)[19]。

圖9 天然CiGAPDH蛋白在刺激隱核蟲幼蟲中的免疫熒光定位結(jié)果Fig. 9 Localization of native CiGAPDH in the theronts by IFAT

為了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)里成功表達(dá)這個帶有非通用密碼子的基因, 本實(shí)驗(yàn)通過PCR定向誘變的方法, 將它們誘變?yōu)榫幋a谷氨酰胺的通用密碼子CAA和CAG, 將誘變成功后的開放閱讀框亞克隆到大腸桿菌中, 將誘導(dǎo)表達(dá)出來的重組蛋白rCiGAPDH用來免疫SPF級雌性昆明小鼠, 獲得抗rCiGAPDH蛋白鼠血清, 免疫印跡試驗(yàn)顯示: rCiGAPDH蛋白具有很好的免疫原性和反應(yīng)原性, 抗rCiGAPDH蛋白鼠血清能夠識別刺激隱核蟲各期蟲體的天然CiGAPDH蛋白。從而表明, 通過基因誘變將纖毛蟲的基因在常規(guī)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)是完全可行的。

GAPDH是多功能的蛋白質(zhì), 除了參與催化糖酵解為細(xì)胞提供能量外, 還參與調(diào)控膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程[20-25]等多種細(xì)胞過程, 對CiGAPDH在刺激隱核蟲的細(xì)胞生理以及感染方面的作用有待進(jìn)一步研究,這些研究將為防治刺激隱核蟲病藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)。

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(本文編輯: 梁德海)

Molecular characterization of a Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Cryptocaryon irritans

FU Guo-liang1, 2, SHAN Jin-hong1, HU Yan-hong1, XIE Jin-zhu1, YAN Yan-hua1, 2, HUANG Xiao-hong1
(1. Fujian Key Laboratory of Developmental and Neural biology, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China; 2. Dongxiang No.1 High School of Jiangxi, Dongxiang 331800, China)

Jul., 7, 2015

Cryptocaryon irritans; glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; prokaryotic expression; location

A GAPDH gene (CiGAPDH) was cloned from the cDNA library of Cryptocaryon irritans trophonts. After modification, the non-universal genetic codons in the open reading frame (ORF) of CiGAPDH were inserted into plasmid pGEX-4T-3 to construct the prokaryotic expression plasmid pGEX-4T-3/CiGAPDH. The recombinant plasmids were transformed to Escherichia coli BL21 (DE3) cells, which were then induced to express the foreign gene by the addition of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside. SDS-PAGE results showed that rCiGAPDH was successfully expressed in E. coli cells. The results from Western blot analysis showed that antiserum against rCi-GAPDH recognized the native CiGAPDH protein from different stages of C. irritans, the molecular mass of which was 37.3 ku, in agreement with the calculated mass. Localization of native CiGAPDH protein in theronts was detected using an indirect immunofluorescence cell imaging technique. The results showed that the native CiGAPDH protein was mainly distributed in the cytoplasm of C. irritans theronts, with notable accumulation around the cytostomes. Further study on the roles of CiGAPDH in the parasite development and infection is expected to provide important information to identify potential drug targets for control of cryptocaryosis.

A

1000-3096(2016)02-0011-09

10.11759/hykx20150412002

2015-07-07;

2015-10-11

福建省教育廳JK項(xiàng)目(JK2013008); 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01120); 福建省農(nóng)業(yè)重大專項(xiàng)(2013NZ0002-5)

付國良(1988-), 男, 江西九江人, 碩士, 主要從事病原分子生物學(xué)研究, E-mail: fu-guo-liang@163.com; 黃曉紅, 通訊作者,教授, E-mail: biohxh@fjnu.edu.cn