馮玲霞，張述斌，蒙琦，張海明

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000；2.甘肅省華亭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，744100）

羊傳染性膿皰皮炎弱毒苗耐熱保護(hù)劑初步優(yōu)化篩選試驗(yàn)研究

馮玲霞1，張述斌1，蒙琦1，張海明2

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅平?jīng)?44000；2.甘肅省華亭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，744100）

試驗(yàn)以羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗為對象,依據(jù)凍干保護(hù)劑的保護(hù)功能，對耐熱保護(hù)劑的組成、混合比例進(jìn)行了初步篩選。通過反復(fù)試驗(yàn)，對其物理性狀觀察、水分含量測定、凍干前后病毒損失量、經(jīng)37℃處理、25℃保存后病毒損失量等指標(biāo)的比較進(jìn)行篩選，優(yōu)選出了符合要求的A3、A6、C4三個(gè)耐熱保護(hù)劑配方。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用保護(hù)劑的羊口瘡疫苗在37℃保存20 d，病毒含量下降0.5～0.7個(gè)滴度，常規(guī)疫苗下降2.3個(gè)滴度；25℃保存60d，病毒含量下降0.3～0.6個(gè)滴度，常規(guī)疫苗下降2.5個(gè)滴度。從而證明了羊orf耐熱活疫苗耐熱效果優(yōu)于常規(guī)疫苗。

羊傳染性膿皰皮炎；弱毒苗；耐熱保護(hù)劑；篩選試驗(yàn)

羊傳染性膿皰皮炎（orf）,俗稱羊口瘡，是危害綿、山羊的一種急性、接觸性的高度傳染病，其中以羔羊最易患本病，一旦發(fā)生，傳染非常迅速，隔離治療法往往收不到理想效果，故最好施行疫苗接種，但傳統(tǒng)的活疫苗熱穩(wěn)定性和保護(hù)功能差，對冷鏈的要求高，2～8℃條件下，保存期只有3～6個(gè)月，大多需在-15℃以下保存，這給疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸帶來很大困難，容易因免疫失敗而造成疫病的流行。為了加快新型有效的耐熱保護(hù)劑的研究和應(yīng)用，本研究以羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗為對象，根據(jù)凍干保護(hù)劑的種類和作用機(jī)制，主要篩選了聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸鈉、維生素C等物質(zhì)作為保護(hù)劑的主要成分。采用單因子試驗(yàn)對耐熱保護(hù)劑的組成和配方比例進(jìn)行篩選，并將其應(yīng)用于羊傳染性膿皰皮炎弱毒活疫苗的試制生產(chǎn)中，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，證明其對羊orf病毒具有良好的耐熱保護(hù)功能。這對提高羊orf疫苗的質(zhì)量，控制羊orf病的發(fā)生與流行具有重大意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)用毒株

生產(chǎn)疫苗的HCE種毒 （即82代羊orf弱毒株）由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 試驗(yàn)用細(xì)胞

犢牛睪丸細(xì)胞由“羊傳染性膿皰皮炎(orf)耐熱性活疫苗的研究”項(xiàng)目組制備。

1.3 試驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱、AD—1型單細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)、Mettler Toledo DL31水分測定儀、真空測定器、高壓蒸汽滅菌器、精密電子天平、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、普通離心機(jī)、磁力攪拌器、移液器、干燥箱等。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

1.4.1 病毒凍干保護(hù)劑：蔗糖、乳糖、脫脂奶粉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉、多聚蛋白胨、維生素C。

1.4.2 其它化學(xué)試劑：199培養(yǎng)基、水解乳蛋白、胰蛋白酶等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 抗原液的制備

取82代羊orf弱毒株（生產(chǎn)用種毒），經(jīng)生長良好的犢牛睪丸細(xì)胞傳代培養(yǎng)至85代后，測定其毒價(jià)，7～9d內(nèi)該種毒TCID50≥106/0.1mL以上；其它按《中華人民共和國獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》方法進(jìn)行檢測合格后，在-15℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 耐熱保護(hù)劑的配制

根據(jù)凍干活疫苗的質(zhì)量要求和各類型原材料的作用機(jī)理，將聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、谷氨酸鈉、維生素C、磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉等幾類物質(zhì)按照不同的物質(zhì)和不同的量組合成An、Bn、Cn多個(gè)配方進(jìn)行耐熱保護(hù)劑的初步篩選。

將保護(hù)劑按組份、比例混合，分別進(jìn)行除菌處理：(1）對可高壓滅菌的聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、多聚蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉，按各自比例溶于蒸餾水中，116℃滅菌 30～40min；（2）將不耐高溫的物質(zhì)組份山梨醇、谷氨酸鈉、維生素C，均按各自比例溶于蒸餾水中，用孔徑0.22μm濾膜過濾除菌；（3）犢牛血清，用孔徑0.22μm 濾膜過濾除菌。 再將（1）、（2）、（3）三種成分按比例混合，即為凍干耐熱保護(hù)劑。使用時(shí)按1∶2比例加入病毒抗原液中，分裝后進(jìn)行冷凍干燥。

2.3 耐熱凍干保護(hù)劑的初步篩選試驗(yàn)

取orf弱毒株病毒液與不同組方的保護(hù)劑，按2:1比例混合，定量分裝，以傳統(tǒng)的保護(hù)劑配方作對照，在同一凍干箱用同一凍干曲線進(jìn)行分批凍干。通過其物理性狀、水分含量、凍干前后病毒損失、經(jīng)37℃處理15d、30d后病毒損失等指標(biāo)的比較進(jìn)行初步篩選。篩選的標(biāo)準(zhǔn)是凍干前后病毒損失小、具有一定的耐熱性，且物理性狀、水份含量合格。

2.4 耐熱凍干保護(hù)劑的優(yōu)化篩選

在初步篩選的基礎(chǔ)上，將測定結(jié)果均達(dá)到試驗(yàn)設(shè)計(jì)要求的配方及配比組成（A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7），在同一個(gè)凍干箱用同一凍干曲線再次進(jìn)行凍干，并用常規(guī)保護(hù)劑疫苗作對照，取凍干樣品進(jìn)行檢測。通過凍干前后病毒的損失量、37℃處理10d、20d及25℃放置 30d和60d后病毒損失量的比較進(jìn)行二次篩選。

2.4.1 耐熱凍干保護(hù)劑疫苗凍干效果檢驗(yàn):按現(xiàn)行《中華人民共和國獸用生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程》方法檢測其物理性狀、真空度和剩余水份，評價(jià)耐熱凍干保護(hù)劑疫苗凍干效果。

2.4.2 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：凍干后取樣分別經(jīng)37℃處理10d、20d，25℃放置 30d和60d，并與傳統(tǒng)的活疫苗進(jìn)行比較，用微量法對樣品進(jìn)行ECID50測定。以其病毒滴度無明顯下降，損失量較小，不影響使用效果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)選。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 耐熱保護(hù)劑初步篩選結(jié)果

依據(jù)冷凍干燥效果觀察、凍干前后病毒損失量、37℃處理15d、30d后病毒損失量等指標(biāo)的比較，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比分析（略），最終獲得比較理想的耐熱保護(hù)劑組方分別為A3、A6、A8；B2、B3、B6；C1、C4、C7。

3.2 耐熱凍干保護(hù)劑的優(yōu)化篩選試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 物理性狀、剩余水分測定結(jié)果:產(chǎn)品凍干后，對其物理性狀進(jìn)行觀察，樣品分別為乳白色、微黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，表面有微小孔隙，搖晃后可與瓶壁脫落，加稀釋液后可迅速溶解；并對其真空度和剩余水分進(jìn)行了測定，結(jié)果見下表。

表：物理性狀、剩余水份及真空度測定結(jié)果

3.2.2 凍干前后：37℃處理 10d、20d；25 ℃放置30d、60d后病毒損失量測定結(jié)果分別見圖1、圖2。

圖1 耐熱保護(hù)劑凍干苗經(jīng)37℃處理后病毒損失量比較

圖2 耐熱保護(hù)劑凍干苗經(jīng)25℃處理后病毒損失量比較

結(jié)果表明，凍干前后各個(gè)組病毒損失量較小，無明顯差異；37℃處理10 d、20 d后，A3、A6和C4配方組的ECID50下降不超過0.7個(gè)滴度。25℃放置 30d、60d 后，A3、A6 和 C4 配方組的ECID50下降幅度較小且不超過0.6個(gè)滴度，其他組別下降幅度較大，普通疫苗組分別下降2.2和2.5個(gè)滴度。通過上述試驗(yàn)，最終獲得比較理想的耐熱保護(hù)劑，分別為A3、A6和C4。

4 小結(jié)與討論

在篩選耐熱保護(hù)劑配方時(shí)，大分子和小分子物質(zhì)配合使用十分重要。大分子物質(zhì)構(gòu)成凍干制品多孔構(gòu)架，小分子物質(zhì)主要作用是防止蛋白質(zhì)變性，防止干燥狀態(tài)下微生物的氧化，大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)配合使用，能有效地增強(qiáng)小分子的保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，耐熱保護(hù)劑疫苗凍型、色澤、質(zhì)地良好，水分含量低，真空度合格，凍干前后病毒損失少，說明我們所選擇的保護(hù)劑配方搭配合理，具有更好的保護(hù)作用。

通過耐熱性試驗(yàn)，常規(guī)保護(hù)劑疫苗病毒損失迅速發(fā)生，說明常規(guī)疫苗用蔗糖脫脂奶保護(hù)劑在高溫條件下的耐熱性能差。A3、A6、C4保護(hù)劑疫苗在37℃耐老化試驗(yàn)和常溫保存中病毒損失量小，說明我們篩選出的耐熱保護(hù)劑在疫苗的生產(chǎn)和保存過程中均表現(xiàn)出了穩(wěn)定的耐熱性能，且具有良好的耐熱效果。

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S858.26

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1003-8655（2016）05-0018-03