黃錦豐　凌國(guó)源　玉石　陳文斗

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L-選擇素在缺血性腦卒中患者外周血中的表達(dá)及其意義

黃錦豐凌國(guó)源玉石陳文斗

530021南寧，中國(guó)人民解放軍第三0三醫(yī)院神經(jīng)外科[黃錦豐凌國(guó)源玉石陳文斗(通信作者)]

【摘要】目的探討L-選擇素在缺血性腦卒中患者中的表達(dá)及其意義。方法選擇缺血性腦卒中患者(病例組)和正常健康體檢者(對(duì)照組)各50例，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，運(yùn)用半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)研究對(duì)象外周血中L-選擇素的表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組比較，病例組L-選擇素水平明顯升高(2.96±0.71 vs 1.22±0.46，P<0.01)。結(jié)論L-選擇素在缺血性腦卒中患者外周血中表達(dá)增加，提示L-選擇素可能與缺血性腦卒中的發(fā)病有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】L-選擇素缺血性腦卒中炎癥

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.002

流行病學(xué)研究表明,中國(guó)每年有150萬～200萬新發(fā)腦卒中的病例[1]。隨著人口老齡化和經(jīng)濟(jì)水平的快速發(fā)展及生活方式的變化,缺血性腦卒中發(fā)病率明顯上升，嚴(yán)重威脅人們的生存質(zhì)量及生命安全。近十幾年,腦卒中發(fā)病機(jī)制研究已獲得諸多進(jìn)展,炎性損傷機(jī)制在缺血性腦損傷中的作用受到廣泛關(guān)注。其中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和相應(yīng)細(xì)胞因子分泌在缺血性腦損傷中發(fā)揮著極為重要的作用[2]。炎癥細(xì)胞因子L-選擇素是細(xì)胞黏附分子選擇素家族的成員之一，它參與了白細(xì)胞的活化、炎癥和創(chuàng)傷等過程，可使白細(xì)胞活化、變形，沿內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)、遷移并黏附于內(nèi)皮細(xì)胞上[3]，還可以通過與配體或者抗體的交聯(lián)作用釋放炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]。因此，本研究對(duì)缺血性腦卒中患者外周血中L-選擇素的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，初步探討L-選擇素和缺血性腦卒中的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2014年3月-2015年8月在本院進(jìn)行住院治療的缺血性腦卒中患者50例作為病例組，所選患者均符合中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2010 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，并經(jīng)頭顱CT或MRI檢查證實(shí)，其中，男23例、女27例，年齡(54.5±7.3)歲。同期選擇到我院進(jìn)行體檢的正常健康體檢者50例作為對(duì)照組，其中，男22例、女28例，年齡(52.8±9.7)歲。所有研究對(duì)象在采血前1個(gè)月內(nèi)無任何感染性疾病，2組性別、年齡等臨床資料具有可比性(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1設(shè)計(jì)及合成引物根據(jù)GenBank中查閱的基因序列，運(yùn)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)，引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶( GAPDH) 為內(nèi)參。

L-選擇素引物序列為：上游為5′-ACAGTCAGCCGC ATC TTCTTT-3′，下游為5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為651 bp；GAPDH引物序列為：上游為5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游為5′-CCATCACGCCACAGTTTCC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為599 bp。

1.2.2采集標(biāo)本所有研究對(duì)象均于清晨采集空腹外周靜脈血2 mL，置于EDTA-k2抗凝管中搖勻備用。

1.2.3提取總RNA嚴(yán)格參照RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒(離心柱型，目錄號(hào)DP433，天根有限公司)說明，在4 h內(nèi)提取外周血總RNA，并置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄RNA采用Fermentas公司生產(chǎn)的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit#K1622逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，并嚴(yán)格參照說明書操作。反應(yīng)體系為20 μL，操作步驟及反應(yīng)條件：加入模板RNA 10 μL，oligo (dT)18 primer 1 μL，Rnasefree-H2O 1 μL，放入梯度PCR儀65 ℃ 5 min后取出，再加入5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，10 mM dNTP Mix 2 μL，RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，再放入梯度PCR儀42 ℃ 60 min。逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA放于-20℃保存。

1.2.5PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，反應(yīng)體系共25 μL，其中模板cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，RNAsefree-H2O 10 ml，2×Taq PCR Master Mix 12 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，61.5 ℃(內(nèi)參為58 ℃)退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)后，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.6電泳及半定量分析取目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μL，置于同一塊1.5%的瓊脂糖凝膠上分孔電泳35 min，電壓120 V；電泳結(jié)束后采用Bio-Rad凝膠圖像分析儀對(duì)瓊脂糖凝膠拍照并保存；采用Quantity One4.5.0軟件對(duì)瓊脂糖照片上的特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以GAPDH產(chǎn)物作校正，計(jì)算目的基因與內(nèi)參GAPDH的灰度比。

2結(jié)果

2.1總RNA的鑒定全血總RNA用經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280比值均在1.8～2.0，表明所提RNA的純度較高，蛋白質(zhì)和DNA 污染少。從凝膠電泳上可以清晰看到28S、18S、5S RNA三條帶。圖1。

2.22組L-選擇素的表達(dá)水平比較病例組L-選擇素表達(dá)的灰度比為2.96±0.71，對(duì)照組為1.22±0.46，2組比較有明顯差異(P<0.01)。在凝膠電泳圖上可以清晰的看出，L-選擇素在病例組中的條帶亮度強(qiáng)于對(duì)照組。圖2。

圖1 全血總RNA凝膠電泳

圖2 從右向左看,1泳道為Marker,2-12泳道為病例組L-選擇素和GAPD的RNA表達(dá)水平,13-19泳道分別為對(duì)照組L-選擇素和GAPDH的RNA表達(dá)水平

3討論

缺血性腦卒中是腦部血管狹窄或管腔閉塞等原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，使局部腦組織發(fā)生不可逆性損害，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死的一種疾病。近十幾年來，很多研究表明炎癥與缺血性腦卒中密切相關(guān)，炎癥可通過促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生而導(dǎo)致缺血性腦卒中。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂、血小板聚集及血栓形成是缺血性腦卒中的主要發(fā)病機(jī)制,其中斑塊的破裂及繼發(fā)性血栓是最重要的始動(dòng)環(huán)節(jié)[6]。目前普遍認(rèn)為急性缺血性腦血管事件的發(fā)生與否主要取決于粥樣斑塊的穩(wěn)定性,與血管的狹窄程度并無直接關(guān)系。而隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展研究的深入,越來越多的證據(jù)表明其可能是一種炎癥性疾病[7]。炎癥反應(yīng)的激活可導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定,觸發(fā)急性缺血性腦卒中的發(fā)生。

L-選擇素屬黏附分子選擇素家族的成員之一，表達(dá)于所有的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,血液和骨髓中大部分T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞及一部分自然殺傷細(xì)胞(NK)上。主要介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的選擇性識(shí)別、黏附,在淋巴細(xì)胞歸巢、白細(xì)胞炎性滲出等過程中起重要作用[8]。而白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮著重要的作用。已有研究表明，L-選擇素與動(dòng)脈粥樣硬化過程密切相關(guān)。Devaraj S[9]及我國(guó)學(xué)者趙學(xué)禮等[10]的研究均發(fā)現(xiàn)：2型糖尿病合并大血管病變者與正常對(duì)照者相比L-選擇素水平顯著增高，推測(cè)L-選擇素可能是糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化的早期標(biāo)志物。劉佳[11]根據(jù)自己的研究結(jié)果認(rèn)為 L-選擇素與樹突狀細(xì)胞表達(dá)的配體相結(jié)合后通過TLR4通路促進(jìn)DCs成熟，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。還有研究證實(shí)，L-選擇素在原發(fā)性高血壓患者外周血中的表達(dá)也顯著增高[12]，而高血壓已證實(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化的高危因素。Wei YS等[13]研究還發(fā)現(xiàn)L-選擇素基因的P213S多態(tài)性及其血清水平均與缺血性腦卒中相關(guān)。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，缺血性腦卒中患者外周血中L-選擇素RNA的表達(dá)水平明顯升高，這提示L-選擇素可能與缺血性腦卒中的發(fā)病相關(guān)。L-選擇素可通過介導(dǎo)白細(xì)胞沿內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)、遷移和黏附，并通過與β2 整合素的黏附加強(qiáng)作用，使白細(xì)胞活化、聚集并粘附在內(nèi)皮表面，從而參與血管炎癥的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)血管的粥樣硬化及斑塊形成。而且持續(xù)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步催化了斑塊的不穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致缺血性腦卒中的發(fā)生。

炎癥反應(yīng)是缺血性腦損傷的重要病理生理機(jī)制之一,參與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展,并與其嚴(yán)重危及生命的并發(fā)癥相關(guān)。本研究結(jié)果提示L-選擇素可能與缺血性腦卒中的發(fā)病有關(guān)，為探究缺血性腦卒中的炎癥機(jī)制提供了線索。

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(2016-02-19收稿2016-05-04修回)

L-selectin in peripheral blood of patients with ischemic cerebral stroke and its significance

HuangJinfeng,LingGuoyuan,YuShi,etal.DepartmentofNeurosurgery,the303rdHospitalofPLA,Nanning530021

【Abstract】ObjectiveTo explore the expression of L-selectin in peripheral blood of patients with ischemic cerebral stroke,and the relationship between L-selectin and the ischemic stroke.MethodsThe expression of L-selectin in peripheral blood of 50 patients with ischemic cerebral stroke,as case group,and 50 normal subjects,as control group,was detected using the semi-quantitative RT-PCR technology,and the expression of glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the internal control.ResultsThe expression of L-selectin in patients with ischemic cerebral stroke was significantly higher than that in normal subjects (2.96±0.71 vs 1.22±0.46,P<0.01).ConclusionThe expression of L- selectin was higher in patients with ischemic cerebral stroke.It is inferred that L- selectin was probably involved in the onset of ischemic cerebral stroke.

【Key words】L-selectinIschemic cerebral strokeInflammation

【中圖分類號(hào)】R743

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1007-0478(2016)03-0154-03