胡郁楠，于湘莉，唐克軒，苗志奇（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

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楸靈素在水環(huán)境下的熱穩(wěn)定性及熱降解動(dòng)力學(xué)

胡郁楠，于湘莉，唐克軒，苗志奇
（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

摘要：用高效液相色譜檢測(cè)不同溫度下楸靈素降解的動(dòng)態(tài)變化。建立楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)模型，定量分析溫度對(duì)楸靈素穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)楸靈素在發(fā)酵液中的熱降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，熱降解速率常數(shù)隨溫度提高而快速上升，符合Arrhenius方程。4℃條件下楸靈素在發(fā)酵液中的半衰期長(zhǎng)達(dá)25 d，25℃條件下則縮短為6 d，而55℃條件則進(jìn)一步下降到14 h。模型預(yù)測(cè)楸靈素在70℃半衰期只有3.7 h，楸靈素發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)會(huì)造成大量降解，收率低下，與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全吻合。

關(guān)鍵詞：藥物；楸靈素；降解；不穩(wěn)定性；溫度；動(dòng)力學(xué)模型

2015-08-03收到初稿，2015-11-06收到修改稿。

聯(lián)系人：苗志奇。第一作者：胡郁楠（1990—），女，碩士研究生。

Received date: 2015-08-03.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (30700061)，STCSM (14431905700 1) and the National Basic Research Program of China (2015CB755700).

引　言

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)[1]，2012年全球癌癥病人有1400萬，并呈現(xiàn)迅猛增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，預(yù)計(jì)2025年將增加到1900萬人。同期癌癥死亡人數(shù)也將從每年820萬飆升至1300萬，已成為僅次于心血管病的人類第二號(hào)殺手。因此，尋找有效的抗癌藥物已成為當(dāng)務(wù)之急。

天然抗癌藥物的典型代表是從紅豆杉中分離獲得的紫杉醇（Taxol）[2-3]。紫杉醇能促進(jìn)微管蛋白聚合，抑制微管解聚，對(duì)乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤具有突出的療效，全球年銷售額達(dá)到40億美元。但紫杉醇有限的天然資源限制了其大范圍應(yīng)用，因此尋找可替代紫杉醇的高效抗癌藥物成為研究的熱點(diǎn)。其中楸樹內(nèi)真菌FSN002合成的黃酮類次生代謝物楸靈素能高效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，沒有明顯的細(xì)胞毒性，灌胃給藥能有效抑制肝癌模型小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，有望開發(fā)成一種具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、資源豐富可口服給藥的高效低毒抗癌一類新藥[4]。但是研究發(fā)現(xiàn)，楸靈素在發(fā)酵等水環(huán)境存在氧化分解現(xiàn)象。本文將從不同溫度下楸靈素在水環(huán)境中的穩(wěn)定性研究入手，建立動(dòng)力學(xué)模型，研究楸靈素的熱降解規(guī)律以及溫度對(duì)楸靈素降解的影響，為楸靈素的高效生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)、給藥提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1　材料與方法

1.1菌株

楸樹內(nèi)生真菌FSN002由上海交通大學(xué)植物生物技術(shù)中心分離并保存[4]。

1.2楸靈素發(fā)酵液制備

本實(shí)驗(yàn)采用PDA液體培養(yǎng)基[4]。

取-80℃保存的真菌孢子，以106孢子/升的接種量接種到含100 ml PDA培養(yǎng)基的250 ml錐形瓶。25℃條件下100 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)一周，發(fā)酵液轉(zhuǎn)變?yōu)榱咙S色，過濾去除菌絲，收集發(fā)酵液于4℃冰箱保存，由于楸靈素在弱堿性條件下更穩(wěn)定，所以將發(fā)酵液調(diào)至pH8后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3楸靈素發(fā)酵液熱處理實(shí)驗(yàn)

取楸靈素發(fā)酵液各10ml，分別放置于4、25、55℃環(huán)境中進(jìn)行熱處理實(shí)驗(yàn)。在處理過程中取樣進(jìn)行HPLC（采用C18反相色譜柱，甲醇/水作為流動(dòng)相梯度洗脫，286 nm紫外檢測(cè)進(jìn)行定量分析）檢測(cè)，確定發(fā)酵液中楸靈素的含量[5]。每組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1楸靈素的降解動(dòng)力學(xué)級(jí)數(shù)分析

為確定楸靈素的熱降解動(dòng)力學(xué)反應(yīng)級(jí)數(shù)[6]，根據(jù)25℃室溫條件下楸靈素的熱降解數(shù)據(jù)，分別統(tǒng)計(jì)楸靈素含量、含量對(duì)數(shù)值以及含量倒數(shù)和熱處理時(shí)間之間的線性相關(guān)性，如圖1～圖3所示。

圖1　楸靈素含量和熱處理時(shí)間的線性相關(guān)分析Fig.1　Linear correlation between content of catalitaxol and time at 25℃

圖2　楸靈素含量的對(duì)數(shù)和熱處理時(shí)間的線性相關(guān)分析Fig.2　Linear correlation between logarithm of content of catalitaxol and time at 25℃

圖3　楸靈素含量的倒數(shù)和熱處理時(shí)間的線性相關(guān)分析Fig.3　Linear correlation between reciprocal of content of catalitaxol and time at 25℃

從中可以看出，楸靈素含量和時(shí)間在降解早期線性相關(guān)性較好，但后期線性預(yù)測(cè)值明顯低于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)值；在整個(gè)降解實(shí)驗(yàn)過程中，楸靈素含量的對(duì)數(shù)值和時(shí)間之間呈現(xiàn)明顯的線性相關(guān)，且線性預(yù)測(cè)誤差的分布和時(shí)間無關(guān)；楸靈素含量的倒數(shù)和時(shí)間之間的相關(guān)性最差，線性預(yù)測(cè)誤差在降解前期和后期為負(fù)誤差，而在中期為正誤差。

由于楸靈素含量的對(duì)數(shù)值和時(shí)間之間的線性相關(guān)性最高，且誤差呈現(xiàn)均勻分布，所以判定楸靈素的降解過程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。

2.2楸靈素降解動(dòng)力學(xué)模型

楸靈素的降解速率可以用式（1）表示

式中，v代表反應(yīng)速率，c代表楸靈素含量，t代表熱處理時(shí)間，k代表降解速率常數(shù)（k＞0）。積分可得

即

兩邊取指數(shù)運(yùn)算，可得

即

采用上述一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型擬合不同溫度下楸靈素的熱降解數(shù)據(jù)，模型預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)值高度吻合（圖4），說明一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型擬合性能良好，可以準(zhǔn)確推測(cè)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)不同溫度下的楸靈素?zé)峤到膺^程。

圖4　楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)間吻合程度分析Fig.4　Fit degree between dynamic degradation model of catalitaxol and experimental results

2.3溫度對(duì)楸靈素降解的影響模型

利用不同溫度下楸靈素?zé)峤到獾膶?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合上述一級(jí)反應(yīng)熱降解模型，可以求得楸靈素在各溫度下的熱降解速率常數(shù)（圖5）：k4℃=0.000726，k25℃=0.005157，k55℃=0.050551。圖5顯示了隨著溫度上升，楸靈素?zé)峤到夥磻?yīng)常數(shù)迅速增加。

圖5　楸靈素?zé)峤到獬?shù)和溫度相關(guān)性分析Fig.5　Correlation analysis between thermal degradation rate constant of catalitaxol and temperature

根據(jù)Arrhenius方程[6-9]化學(xué)反應(yīng)的速率常數(shù)k與反應(yīng)溫度T之間的關(guān)系為

式中，Ea為楸靈素?zé)峤到夥磻?yīng)活化能。將方程兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)可得

式中，k為速率常數(shù)；R為氣體常數(shù)，8.314 J·mol-1·K-1；k0為方程常數(shù)；T為熱力學(xué)溫度，K。

圖5顯示了楸靈素在不同溫度下的熱降解速率常數(shù)的對(duì)數(shù)和溫度的倒數(shù)呈現(xiàn)明顯的線性關(guān)系，符合Arrhenius方程。根據(jù)不同溫度下的熱降解速率常數(shù)可以求出楸靈素?zé)峤到夥磻?yīng)活化能Ea=62.8 kJ·mol-1。

綜上所述，完整的楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)方程如下

2.4楸靈素?zé)峤到饽Ｐ偷耐馔祁A(yù)測(cè)能力檢驗(yàn)

為檢測(cè)楸靈素?zé)峤到饽Ｐ屯馔祁A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，采用高于擬合模型所用數(shù)據(jù)的溫度范圍（4～55℃）的70℃條件對(duì)含楸靈素發(fā)酵液進(jìn)行熱處理驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每隔0.5 h取樣檢測(cè)楸靈素含量，結(jié)果如圖6所示?？梢钥闯瞿Ｐ皖A(yù)測(cè)楸靈素降解曲線和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)獲得的楸靈素含量數(shù)據(jù)完全吻合，說明上述楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)模型具有良好的外推預(yù)測(cè)能力。

2.5楸靈素?zé)峤到獍胨テ诜治?/p>

根據(jù)楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)模型，可以預(yù)測(cè)繪制各溫度下楸靈素的降解動(dòng)力學(xué)曲線，如圖7所示。從中可以看出隨著溫度的上升，楸靈素含量迅速下降。

圖6　70℃楸靈素?zé)峤到饽Ｐ皖A(yù)測(cè)能力分析（其中實(shí)線代表模型預(yù)測(cè)曲線）Fig.6　Predictive capability of thermal degradation model of catalitaxol at 70℃ (Wherein solid line represents prediction curve of model)

圖7　模型預(yù)測(cè)的楸靈素降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.7　Degradation kinetics curves predicted by model

根據(jù)上述熱降解動(dòng)力學(xué)模型，可以計(jì)算各溫度下楸靈素的半衰期。

兩邊取對(duì)數(shù)可得

所以

圖8　不同溫度下楸靈素的半衰期分析Fig.8　Half-life of catalitaxol at different temperatures

楸靈素的半衰期t1/2對(duì)溫度的微分為負(fù)值，說明楸靈素的半衰期隨溫度的升高而迅速降低（圖8）。

按照上述半衰期計(jì)算公式，可知4℃條件下楸靈素的半衰期為25 d，25℃條件下只有不足6 d，55℃條件下則進(jìn)一步縮短到14 h，70℃條件下楸靈素的半衰期只有3.7 h，說明隨著溫度的升高，楸靈素穩(wěn)定性迅速下降，出現(xiàn)大量降解。因此楸靈素水溶液的旋蒸濃縮溫度不能高于55℃，應(yīng)盡量采用提高真空度的方法加快蒸發(fā)過程，否則在旋蒸過程中楸靈素會(huì)由于高溫而出現(xiàn)大量降解，收率低下，同時(shí)產(chǎn)生大量雜質(zhì)。在后續(xù)分離純化過程中含楸靈素發(fā)酵液應(yīng)避免50℃以上的高溫處理，以保證發(fā)酵液中楸靈素的穩(wěn)定。

由楸靈素降解動(dòng)力學(xué)模型推測(cè)，在37℃下楸靈素?zé)峤到獍胨テ诩s為57 h。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示楸靈素在血液中半衰期只有1 d左右。一種可能的原因是部分楸靈素可以通過尿液排出體外。同時(shí)人體作為一個(gè)復(fù)雜生物系統(tǒng)，存在多種酶類，特別是細(xì)胞色素P450氧化酶，可以對(duì)進(jìn)入人體的藥物進(jìn)行修飾降解[10-11]，這也可能是楸靈素體內(nèi)半衰期縮短的原因之一。因此建議楸靈素的給藥頻率為每天一次。

模型顯示低溫下楸靈素相對(duì)穩(wěn)定，因此含楸靈素發(fā)酵液應(yīng)該在低溫下進(jìn)行保存?？紤]冰箱冷藏4℃條件下半衰期為25 d，含楸靈素發(fā)酵液的冷藏保存周期短，應(yīng)盡量在發(fā)酵液制備后一周內(nèi)使用。楸靈素的長(zhǎng)期保藏必須將楸靈素進(jìn)行分離提純，以固體的形式才能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。

3　結(jié)　論

（1）楸靈素對(duì)熱不穩(wěn)定，熱降解反應(yīng)活化能只有62.8 kJ·mol-1。降解過程中楸靈素濃度和時(shí)間呈現(xiàn)明顯的指數(shù)相關(guān)，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；降解速率常數(shù)與溫度間符合Arrhenius方程。在此基礎(chǔ)上建立的楸靈素?zé)峤到鈩?dòng)力學(xué)模型具有良好的擬合和外推預(yù)測(cè)能力。

（2）一般室溫條件（25℃）下楸靈素的半衰期約為6 d，而4℃冷藏下可以延長(zhǎng)到25 d，因此含楸靈素發(fā)酵液應(yīng)進(jìn)行冷藏貯存。

（3）70℃時(shí)楸靈素的半衰期只有3.7 h，因此采用真空旋蒸濃縮發(fā)酵液將導(dǎo)致楸靈素大量降解，在楸靈素分離中應(yīng)避免50℃以上高溫處理。

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Stability and dynamic degradation model of catalitaxol in water

HU Yunan，YU Xiangli，TANG Kexuan，MIAO Zhiqi
(School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200240，China)

Abstract:HPLC was used to study the dynamic degradation of catalitaxol at different temperatures. Establishing the dynamic degradation model of catalitaxol in Endophyte FSN002，the effect of the temperature on the stability of catalitaxol was quantitatively analyzed. It was found that the thermal degradation of catalitaxol in Endophyte FSN002 was first-order reaction kinetics. The thermal degradation rate constant increased rapidly with increasing temperature，fitting the Arrhenius equation. The half-life of catalitaxol at 4℃ was 25 d and it was shortened to 6 d at 25 ℃，while it was only 14 h at 55℃. The model predicted that the half-life of catalitaxol would be only 3.7 h at 70℃. The rotary evaporation of catalitaxol from Endophyte FSN002 would cause substantial degradation and low yield，which was entirely consistent with the experimental verification.

Key words:pharmaceuticals; catalitaxol; degradation; instability; temperature; kinetic modeling

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151237

中圖分類號(hào)：Q 503

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）04—1448—05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700061)；上?？萍贾雾?xiàng)目(14431905700 1)；國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2015CB755700）。

Corresponding author:Prof. MIAO Zhiqi，zqmiao@stju.edu.cn