孔 杰，蔣曉紅，周 洲，張竹青，周 路，李道友

（貴州省水產(chǎn)研究所，貴州貴陽550025）

磁珠富集法開發(fā)長臀鮠微衛(wèi)星分子標(biāo)記

孔 杰，蔣曉紅＊，周 洲，張竹青，周 路，李道友

（貴州省水產(chǎn)研究所，貴州貴陽550025）

為長臀鮠遺傳育種、種質(zhì)鑒定和種苗流放等提供理論依據(jù)，采用磁珠富集法開發(fā)長臀鮠（Cranoglanis bouderius）微衛(wèi)星分子標(biāo)記，篩選獲得陽性克隆進行分析，選取側(cè)翼較長的序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計合成引物。結(jié)果表明：從596個白斑中篩選獲得80個陽性克隆，測序獲得微衛(wèi)星序列47個，其中完美型31個（66%），非完美型14個（30%），復(fù)合型2個（4%）。設(shè)計合成32對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，得到27對引物能擴增特異條帶，其中多態(tài)性引物24對。

磁珠富集；長臀鮠；微衛(wèi)星標(biāo)記

長臀鮠（Cranoglanis bouderius），俗稱牛毛魚、牯魚，隸屬鲇形目（Siluriformes）、長臀鮠科（Cranoglanididae）、長臀鮠屬（Cranoglanis），是珠江水系特有的名貴經(jīng)濟魚類，在《中國瀕危保護動物紅皮書》中被列為易危魚類［1］。其分布于中國南部珠江水系，海南島，云南的元江水系，貴州省南、北盤江和紅水河流域以及越南的紅河水系。長臀鮠肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，含有人體所需的7種必需氨基酸和10種非必需氨基酸，不飽和脂防酸含量高，深受大眾歡迎，具有較高的經(jīng)濟價值［2］。目前，對長臀鮠的研究主要集中在生理、營養(yǎng)和生物學(xué)特性方面，關(guān)于遺傳多樣性的報道甚少，且多為采用線粒體基因組［3］和AFLP分析的方法［4］。微衛(wèi)星是種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、種群遺傳多樣性鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建及生產(chǎn)性狀位點的連鎖分析中最理想的分子標(biāo)記之一，應(yīng)用也最為廣泛。采用生物素包被的磁珠富集分離微衛(wèi)星分子標(biāo)記是一種簡單高效的方法，在水產(chǎn)動物，如鯉魚［5］和草魚［6］等的微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā)中都曾被廣泛使用，但長臀鮠的微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)目前尚未見報道。筆者使用磁珠富集法篩選長臀鮠微衛(wèi)星分子標(biāo)記，以期為此方法在長臀鮠的遺傳多樣性檢測、遺傳圖譜構(gòu)建和品系優(yōu)化等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

長臀鮠樣品采自羅甸龍灘水庫，剪取養(yǎng)殖長臀鮠尾鰭約1cm2大小，放于無水乙醇中4℃保存，共采集6尾魚的鰭條作為樣品提取基因組DNA。

1.2 長臀鮠微衛(wèi)星基因組文庫的構(gòu)建

1.2.1 基因組的提取純化和酶切 采用上海生工的磁珠法DNA提取試劑盒提取6尾長臀鮠鰭條基因組DNA。用限制性內(nèi)切酶Bsp143I（Sau3AI）于37℃環(huán)境，酶切16h，對基因組進行不完全酶切。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下400～900bp片段，用膠回收試劑盒進行回收與純化。

1.2.2 接頭制備與連接 寡核苷核鏈A（Brown A），5′GATCGTCGACCGTACCGAATTCT3′；寡核苷核鏈B（Brown B），5′GTCAAGAATTCGGTA CCGTCGAC 3′。等比例混合Brown A與Brown B，95℃變性10min，然后用4h緩慢降溫冷卻至10℃，形成帶有限制性酶切位點Sau3AI、SalI、EcoRI的雙鏈接頭：BrownA，5′GATCGTCGACG GTACCGAATTCT 3′；Brown B，3′CAGCTGCCATGGCTTAAGAACTG 5′。

將雙鏈接頭與基因組DNA酶切產(chǎn)物混合，建立連接體系：T4DNA Ligase 1μL（350U），10× buffer 2μL，酶切DNA片段（55ng／μL）6μL，雙鏈接頭（25μmol／L）11μL；16℃，連接16h。

1.2.3 長臀鮠基因組PCR文庫的構(gòu)建 以連接雙鏈接頭的DNA片段為模板，Brown B為引物，進行PCR擴增，建立50μL反應(yīng)體系，進行PCR擴增，創(chuàng)建基因組PCR文庫。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化產(chǎn)物。

1.2.4 生物素標(biāo)記探針與基因組的雜交 配制雜交液：生物素探針Biotin－（CA）151.5μL，Brown B 2.5μL，20×SCC 15μL，10%SDS 0.5μL，ddH2O 30.5μL。68℃預(yù)熱雜交液，快速加入15μL基因組片段，95℃變性5min，雜交1h。

1.2.5 磁珠富集法分離微衛(wèi)星序列

1）磁珠的平衡。將磁珠搖勻，吸取100μL至硅化離心管中，放在磁力架（MPC）上1～2min，吸出鹽溶液；加入200μL B＆W洗液，洗2～3次；加入200μL洗液Ⅰ（6×SSC，0.1%SDS）反復(fù)洗滌6～8次，直到磁珠外觀變得順滑易脫。加入200μL洗液Ⅰ，室溫放置。

2）磁珠的吸附富集。將雜交液加入已平衡好的磁珠中，置于25℃水浴鍋中溫育1.5h，并輕輕搖動；將離心管放置在磁力架上1～2min，去除溶液。分別用200μL洗液Ⅰ，室溫下洗2次，每次靜置10min；200μL洗液Ⅱ（3×SSC，0.1%SDS），68℃洗2次，每次靜置15min；200μL洗液Ⅲ（6× SSC），室溫下快速洗2次；200μL 0.1×TE，室溫，快速洗2次；加入30μL 0.1×TE，95℃變性10min，冰浴10min，釋放出含有微衛(wèi)星序列的單鏈DNA。

1.2.6 長臀鮠微衛(wèi)星文庫的構(gòu)建 以含微衛(wèi)星序列的單鏈DNA為模板，Brown B為引物，建立50μL反應(yīng)體系，進行PCR擴增，方法同第1次PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工）純化產(chǎn)物。電泳檢測。

將富集擴增的產(chǎn)物與pMD18－T（TAKARA公司）載體相連，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細胞中（TAKARA公司），建立長臀鮠的微衛(wèi)星富集文庫。藍白斑篩選獲得陽性克隆，進一步采用PCR檢測鑒定陽性克隆，以單克隆菌斑為DNA模板，Brown B為引物，進行PCR擴增，電泳檢測，所得陽性克隆送至上海生工以及北京諾賽公司進行測序。

1.3 微衛(wèi)星序列分析、引物設(shè)計與合成

測序結(jié)果通過軟件SSRHunter探查，記錄位點的重復(fù)情況，根據(jù)微衛(wèi)星兩端的保守序列，去除因為缺乏足夠的側(cè)翼序列或者本身結(jié)構(gòu)原因而無法設(shè)計引物的序列，用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，并將序列送至上海生工合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落PCR鑒定陽性克隆

經(jīng)初次篩選后構(gòu)建長臀鮠微衛(wèi)星文庫，共獲得約3 000個克隆，其中重組克隆約2 100個。隨機挑選白斑596個，通過PCR鑒定出陽性克隆80個，部份電泳情況見圖1。陽性克隆率（PCR鑒定陽性克隆個數(shù)／重組克隆個數(shù)）為13.4%。將80個陽性克隆進行測序，獲得含有重復(fù)次數(shù)＞5次的微衛(wèi)星序列克隆45個，微衛(wèi)星富集效率［7］（測序含有微衛(wèi)星序列克隆數(shù)／PCR鑒定陽性克隆個數(shù)）為56.3%。

2.2 微衛(wèi)星引物的設(shè)計與擴增情況

經(jīng)檢測共獲得微衛(wèi)星位點47個（重復(fù)次數(shù)≥5次）。按照重復(fù)序列堿基數(shù)目劃分：2堿基重復(fù)序列44條，約占94%，除（CA／GT）n重復(fù)外，還獲得（CT）n重復(fù)；3堿基重復(fù)序列1條，約占2%；4堿基重復(fù)序列2條，約占4%。按照Weber提出的測序標(biāo)準(zhǔn)對獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記進行歸類：完美型31個，約占66%；非完美型14個，約占30%，復(fù)合型2個，約占4%。

在47個微衛(wèi)星位點中，設(shè)計合成微衛(wèi)星引物32對。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，摸索適合的退火溫度（圖2），選擇擴增無雜帶且特異性高的退火溫度，得到27對引物。用12尾長臀鮠為樣本進行分析，其中24對具有多態(tài)性，其詳細信息見表。由圖3可見，引物Cb28在其中6個個體中擴增等位基因7個，表明引物具有多態(tài)性。

圖1 PCR鑒定陽性克隆的部份電泳圖譜Fig.1 Part of electrophoresis of positive clones identified by PCR

圖2 不同退火溫度下微衛(wèi)星引物Cb28和Cb30在長臀鮠中擴增的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis map of microsatellites Cb28and Cb30in C.bouderius at different annealing temperature

圖3 多態(tài)性引物Cb28在部份個體中的等位基因峰Fig.3 The electropherogram peaks of polymorphic microsatellite primer Cb28in some individuals

表 長臀鮠微衛(wèi)星分子標(biāo)記及其引物Table Microsatellite markers and their primers in C.bouderius

3 結(jié)論與討論

獲得微衛(wèi)星方法通常有3種：一是從近緣物種中獲得；二是從網(wǎng)上公布序列中獲得；三是直接克隆，包括隨機克隆法和磁珠富集法［8］。自1994年Kandpal R等［9］提出磁珠富集法篩選SSR引物后，此方法在水產(chǎn)動物上應(yīng)用十分廣泛，如草魚［6］、銀鯽［10］、扇貝［11］、大口鯰［12］及施氏鱘［13］等應(yīng)用此法獲得微衛(wèi)星序列的報道。長臀鮠一直是通過近緣物種獲取微衛(wèi)星標(biāo)記，標(biāo)記數(shù)量不足，使得長臀鮠分子標(biāo)記輔助育種受到限制，筆者將此法應(yīng)用到長臀鮠的開發(fā)中，獲得27條在長臀鮠中特異擴增的微衛(wèi)星引物，其中多態(tài)性引物24對，豐富長臀鮠的微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)量。

試驗陽性克隆率為13.4%，這是多次試驗的平均值。由于前幾次使用的連接產(chǎn)物放置時間過久，導(dǎo)致陽性克隆率低，在最后一次試驗中，重新構(gòu)建連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，通過PCR檢測陽性克隆率達46.8%，曹柱［7］等篩選方正銀鯽微衛(wèi)星標(biāo)記陽性克隆率為13.76%，于冬梅［13］篩選史氏鱘微衛(wèi)星標(biāo)記篩選為21.4%，全迎春［12］等篩選大口鯰微衛(wèi)星標(biāo)記為42.36%。該陽性克隆率優(yōu)于同類試驗結(jié)果。

從近緣物種的微衛(wèi)星序列開發(fā)適用標(biāo)記，屬間的微衛(wèi)星適用性較高，若跨科物種的微衛(wèi)星適用性較低，如卜興江［14］等利用21個中華鱉微衛(wèi)星對8個物種進行跨物種檢驗結(jié)果顯示，中華鱉的21個微衛(wèi)星位點在同為鱉科的5個種獲得可適用引物15～20對，平均獲得率約為85%，而在另外2個不同科3個物種獲得可適用引物6～13對，平均獲得率約為46%。目前并無長臀鮠科屬的魚類開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的報道，而在跨科物種間的微衛(wèi)星開發(fā)得率較低，若從同目的其他魚類中篩選長臀鮠適用性微衛(wèi)星標(biāo)記可能會更困難。筆者采用磁珠富集法構(gòu)建長臀鮠的微衛(wèi)星文庫，獲得27對長臀鮠微衛(wèi)星引物，其中多態(tài)性引物24對，引物擴增效果好，可用于長臀鮠及其近緣物種的種群遺傳學(xué)及多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建及親緣關(guān)系鑒定等方面研究，為長臀鮠分子標(biāo)記育種及增殖放流等提供基礎(chǔ)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Development of Microsatellite in Cranoglanis bouderius by Magnetic Beads

KONG Jie，JIANG Xiaohong＊，ZHOU Zhou，ZHANG Zhuqing，ZHOU Lu，LI Daoyou

（Aquaculture Science Institute of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou550025，China）

To provide the theoretical basis for genetic breeding，germplasm identification and releasing.Magnetic beads enriched method was used to isolate microsatellites fromC.bouderius，through sequencing and analysis the positive colonies，the repeats which contained enough flanking region were obtained to design 32microsatellite primers by the software Primer Premier 5.0.Results：80positive colonies were obtained through 596white spots.Sequencing of the 80positive colonies confirmed that 47 microsatellite sequences were obtained.From these sequences，31sequences（66%）were perfect repeats，14（30%）were imperfect repeats，and two sequences（4%）were compound repeats.27pairs of microsatellite primers used successfully to amplify special fragments at appropriate annealing temperature，and 24pairs of them were polymorphism within species.

enrichment by magnetic beads；Cranoglanis bouderius；microsatellite marker

S965.299

A

1001－3601（2016）07－0287－0014－04

2016－04－12；2016－07－02修回

貴州省科技計劃課題項目“長臀鮠生長相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及其應(yīng)用潛力研究”［黔科合NY字（2012）3053］

孔 杰（1986－），女，助理研究員，碩士，從事水產(chǎn)生物技術(shù)與魚類分子鑒定研究。E－mail：kellykj＠126.com

＊通訊作者：蔣曉紅（1968－），女，副研究員，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究。E－mail：243475908＠qq.com