劉 慧，趙依詩，吳 晨，張少斌＊

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院遼寧沈陽110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

糧用豌豆組織培養(yǎng)及植株再生條件優(yōu)化

劉 慧1，趙依詩2，吳 晨2，張少斌2＊

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院遼寧沈陽110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

為了豌豆遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)良品種快速繁殖提供借鑒，進行了豌豆組織培養(yǎng)及植株再生條件試驗。結(jié)果表明：豌豆的葉柄是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料，在MS培養(yǎng)基中添加2，4－D（1mg／L）和BA（0.5mg／L），愈傷誘導(dǎo)率達100%，但愈傷組織在分化培養(yǎng)基中未能分化出芽；豌豆子葉節(jié)是芽分化的最佳材料，在分化培養(yǎng)基上可分化出叢生芽，不同激素條件下萌發(fā)率均達100%。在MS＋ZT（1mg／L）條件下，叢生芽最長；而在MS＋BA（10mg／L）條件下，叢生芽最多。豌豆子葉節(jié)叢生芽在MS＋IBA （0.5mg／L）培養(yǎng)基上生根率最高，達40%以上，試管苗的移栽成活率為90%以上。

豌豆；組織培養(yǎng)；植株再生

豌豆是一種重要的經(jīng)濟作物，種子不僅可以糧用飼用［1］，而且豌豆嫩粒、嫰莢以及嫩苗等還可以作為蔬菜食用［2］。同時，由于豌豆根部共生有固氮根瘤菌，對于養(yǎng)地倒茬具有重要意義［3］。豌豆蛋白質(zhì)含量高［4］，富含膳食纖維、胡蘿卜素和微量元素等，具有較高的營養(yǎng)保健價值［5］。同時，豌豆還具有激活免疫系統(tǒng)及防治腫瘤等作用［6］。我國豌豆栽培歷史悠久，目前豌豆總產(chǎn)量居世界第2位［7］，但豌豆單產(chǎn)不高，經(jīng)濟效益較低，主要在云南、青海和甘肅等干旱、半干旱地區(qū)種植［8］，用于作物輪作倒茬，改良土壤［9－10］。隨著對豌豆制品的需求日益增長［11］，有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展豌豆的遺傳育種等研究工作，提高豌豆的品質(zhì)及其產(chǎn)量［12］。目前，關(guān)于豌豆組織培養(yǎng)以及遺傳轉(zhuǎn)化的研究較為滯后，因此，進行糧用豌豆組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)試驗，為其遺傳轉(zhuǎn)化及優(yōu)良品種快速繁殖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

糧用豌豆由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實驗室保存。

1.2 無菌苗獲得

挑選色澤鮮亮、粒大、飽滿、種皮無破損及無霉病斑的豌豆種子，先用自來水沖洗4～5次，在超凈臺上用75%的酒精浸泡1min，轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2溶液中浸泡10min，無菌水漂洗4～5次，接種于MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7d左右。

1.3 愈傷組織誘導(dǎo)

將一部分無菌苗保留葉柄部分，沿子葉縱向切開，分別放入愈傷培養(yǎng)基［13］MS＋2，4－D（1mg／L）＋BA（0.5mg／L）、MS＋BA（1mg／L）、MS＋2，4－D （1mg／L）＋NAA（0.5mg／L）中進行愈傷組織誘導(dǎo)，統(tǒng)計出愈率并篩選出最佳的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基。

1.4 愈傷組織分化

將成功誘導(dǎo)出的愈傷組織放入附加不同激素濃度的BA和ZT培養(yǎng)基中，統(tǒng)計分化率、芽長等指標。

1.5 芽分化

將無菌苗的兩片子葉從子葉節(jié)處切開，保留3～4mm下胚軸，切去已經(jīng)萌發(fā)的頂芽及側(cè)芽，分別放入芽分化培養(yǎng)基MS＋ZT（1mg／L）、MS＋BA （2mg／L）＋IBA（0.2mg／L）和MS＋BA（10mg／L）進行叢生芽的誘導(dǎo)，統(tǒng)計分化率、芽長等指標。

1.6 根誘導(dǎo)

將叢生芽切下，分別放入生根培養(yǎng)基MS＋IBA （0.5～2mg／L）中進行根的誘導(dǎo)，統(tǒng)計生根情況。

以上各項試驗處理都為3次重復(fù)，培養(yǎng)基中附加3%蔗糖和0.7%瓊脂，pH 5.8，在室溫（25±1）℃，光照為40W日光燈每天光照14h培養(yǎng)，每10d觀察并記錄生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆葉柄愈傷組織的形成及芽分化

從表1看出，MS＋BA（0.5mg／L）＋2，4－D （1mg／L）和MS＋2，4－D（1mg／L）＋NAA （0.5mg／L）的培養(yǎng)條件下均可誘導(dǎo)出愈傷組織，且誘導(dǎo)率均較高，但形成愈傷組織的形態(tài)不一樣，前者愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地較緊實，是理想的愈傷組織材料。但附加不同激素濃度的BA，ZT各處理中均未分化出芽。上述結(jié)果與其他已報道的研究結(jié)果相似［14］。

2.2 豌豆子葉節(jié)的叢生芽萌發(fā)與生長情況

從表2看出，直接把子葉節(jié)接種于各處理中，叢生芽產(chǎn)生率為100%，但平均芽長、生長情況呈一定差異。當培養(yǎng)基中只加ZT（1mg／L）時，叢生芽通常為1～2個，多為2個，較粗，較長，葉片呈張開狀，說明在此濃度下，有利于培養(yǎng)壯芽。當培養(yǎng)基加有BA（2mg／L）和IBA（0.2mg／L）時，叢生芽通常為3～4個，多為4個，較細，較短，葉片呈閉合狀，說明在此濃度下，有利于得到更多的叢生芽。當培養(yǎng)基中只加有BA（10mg／L）時，由于激素濃度過高，雖然所得叢生芽數(shù)較多，但較細，較短，且顏色呈深綠色，無很強的生命力。因此，應(yīng)根據(jù)不同的需要選擇不同類型的培養(yǎng)基。

表2 不同激素組合子葉節(jié)的叢生芽萌發(fā)及生長情況Table 2 Germination and growth of buds clustered on pea cotyledon node treated with different hormone combination

2.3 叢生芽根的誘導(dǎo)

分化的叢生芽生長到3～5cm時，分別接種于IBA（0.5～2mg／L）不同濃度的MS培養(yǎng)基中，10d左右在芽基部開始膨大（圖示－1），15d左右可明顯觀察到在膨大的組織塊上有根出現(xiàn)，且逐漸伸長，25d左右根的長度達3cm以上（圖示－2）。從表3看出，根的誘導(dǎo)與IBA濃度有關(guān)，隨著IBA濃度的升高，根的誘導(dǎo)率反而下降，IBA為0.5mg／L時，誘導(dǎo)率可達43%。

圖示 豌豆子葉節(jié)叢生芽的生根誘導(dǎo)Fig. Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node

表3 IBA對豌豆子葉節(jié)叢生芽根的誘導(dǎo)情況Table 3 Rooting of adventitious buds on pea cotyledon node treated with IBA

2.4 試管苗移栽

當試管苗的主根伸長約2cm，且長出2～3條須根時，揭開封口膜在室溫下煉苗7d后，將其根部的培養(yǎng)基用自來水沖洗干凈，移栽于營養(yǎng)土中，澆足水分，保持濕度，成活率可達90%以上。

3 結(jié)論與討論

1）在組織培養(yǎng)中，選擇適合的外植體是組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵［15－16］。試驗中，豌豆的葉柄是最佳形成愈傷組織的材料。但在隨后的誘導(dǎo)愈傷分化的試驗中，附加不同激素濃度的BA，ZT處理中并未成功，從該愈傷組織中誘導(dǎo)芽有待進一步研究。蘇承剛［2］等研究表明，食莢型豌豆的莖段誘導(dǎo)愈傷組織比率較高，但同樣也沒有誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。由此可見，豌豆葉柄愈傷組織難以誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株，不是遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料。

2）將豌豆的子葉節(jié)接種于附加激素BA、ZT和IBA不同組合的分化培養(yǎng)基中，3d左右直接從節(jié)上萌發(fā)出多個腋芽，萌發(fā)率達100%，腋芽的形態(tài)與其附加的激素種類及濃度有關(guān)，若濃度太高，不但不會促進叢生芽的生長，反而抑制其進一步分化，因此，應(yīng)掌握好濃度的選擇。叢生芽在MS＋IBA （0.5mg／L）培養(yǎng)基上，生根率超過40%，試管苗的移栽成活率為90%以上。

3）目前已經(jīng)獲得的轉(zhuǎn)基因植物中，80%以上都是通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得［17］。而農(nóng)桿菌侵染的組織細胞往往通過組織培養(yǎng)的方式獲得再生植株，如煙草葉盤轉(zhuǎn)化法［18］。在大豆的組織培養(yǎng)中，雖然初生葉，幼胚軸等各種外植體都有成功報道，但子葉節(jié)仍然是用于遺傳轉(zhuǎn)化的主要材料［19－21］。因此，通過農(nóng)桿菌侵染豌豆子葉節(jié)，而后進行組織培養(yǎng)，還是較為理想的豌豆遺傳轉(zhuǎn)化方法。

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（責(zé)任編輯：聶克艷）

Condition optimization on Tissue Culture and Plant Regeneration of Pea

LIU Hui1，ZHAO Yishi2，WU Chen2，ZHANG Shaobin2＊

（1.College of Land and Environment，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning110866；2.Biological Science and Technology College，Shenyang Agricultural University，Shenyang，Liaoning 110866，China）

In order to provide references for pea genetic transformation and the rapid propagation of fine varieties，the experiment of tissue culture and plant regeneration of pea was carried out.Results：Pea petiole is the ideal inducing material for callus，2，4－D（1mg／L）and BA（0.5mg／L）were added into MS medium，and the callus induction rate reached 100%，but there were no buds on differentiation medium.Pea cotyledon was the best differentiation material，the germination rate of the cluster buds was up to 100%using different hormones.Under the condition of MS medium with ZT（1mg／L），the cluster buds were the longest，while the number of buds was the most on the MS medium with BA（1mg／L）.The rooting rate of cluster buds was the highest on the MS medium with IBA（0.5mg／L），which could reach more than 40%.The surviving ratio of transplanted plants could exceed 90%.

pea；tissue culture；plant regeneration

S529

A

1001－3601（2016）07－0284－0006－03

2015－11－02；2016－07－01修回

遼寧省自然科學(xué)基金“肌動蛋白異型體PEAC3在干旱脅迫中的作用及其響應(yīng)機制”（2013020072）

劉 慧（1973－），女，實驗師，從事植物資源與環(huán)境研究。E－mail：187021941＠qq.com

＊通訊作者：張少斌（1973－），男，副教授，博士，從事植物細胞骨架研究。E－mail：zsb010024＠163.com