李寶明,楊織瑞

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學院,甘肅 武威733006)

乳酸菌添加劑對青貯飼料中微生物菌群的影響

李寶明,楊織瑞

(甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學院,甘肅 武威733006)

摘要：為研究乳酸菌添加劑對青貯飼料中微生物菌群的影響，通過添加CaCO3、纖維素酶、淀粉酶、尿素進行玉米秸稈青貯飼料的發(fā)酵試驗。結(jié)果表明，添加CaCO3 0.5%、纖維素酶0.01%、淀粉酶0.01%時青貯過程中乳酸菌生長速度顯著高于其他試驗組，細菌、酵母菌、霉菌顯著低于其他試驗組；有氧暴露后，乳酸菌數(shù)量降低速度顯著低于其他試驗組，細菌、酵母菌、霉菌生長速度顯著低于其他試驗組。

關(guān)鍵詞：青貯飼料；微生物菌群；乳酸菌添加劑

玉米青貯過程是一個復雜的微生物體系，包括乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽胞桿菌等多種微生物，其中乳酸菌被認為是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物。在青貯過程中隨著厭氧和低pH環(huán)境的形成，酵母菌、霉菌、腐敗細菌在青貯飼料的發(fā)酵過程中逐漸減少。但是一旦青貯發(fā)酵池開啟，青貯飼料和空氣接觸，上述腐敗微生物迅速生長和乳酸菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌還會分解乳酸使青貯飼料pH增大，進一步為腐敗微生物的生長創(chuàng)造適宜的條件，從而導致青貯飼料腐敗變質(zhì)。本試驗以優(yōu)良乳酸菌、纖維素酶、淀粉酶、CaCO3和尿素作為添加劑，通過跟蹤青貯過程、有氧暴露后的微生物動態(tài)變化，以及各階段青貯飼料的pH變化從而篩選出更加適合青貯發(fā)酵的優(yōu)良乳酸菌接種劑。

1材料與方法

1.1材料1.1.1 菌種經(jīng)過前期試驗篩選并結(jié)合菌種自身特性和菌種多樣性選取以下菌株用于青貯試驗。腸膜明串珠菌腸膜亞種(Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides)B1-7、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceu)B2-3、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)B3-1eEnterococcus faecium)B5-2、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)E2-3等菌種均為前期試驗分離菌株，由本實驗室分離鑒定并保存。1.1.2培養(yǎng)基MRS：蛋白胨 10 g、牛肉膏 10 g、酵母膏 5 g、K2HPO42 g、葡萄糖 20 g、 乙酸鈉 5 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、蒸餾水 1 000 mL。

瓊脂培養(yǎng)基：牛肉膏 1 g、酵母膏 2 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g。

1.1.3儀器與材料723N可見分光光度計(上?？坪闶聵I(yè)發(fā)展有限公司)、DZ-300A多功能真空封口機(溫州卓越機電有限公司)、酸度計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；22 cm×28 cm聚乙烯包裝袋(東旭化工塑料有限公司)、孟加拉紅培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4青貯樣品及處理青貯用全株玉米采自甘肅省臨洮縣華加畜牧有限公司，將試驗用全株玉米經(jīng)切割機切成2～4 cm后備用。

1.2方法

1.2.1試驗分組設(shè)計試驗乳酸菌為腸系膜明串珠菌腸膜亞種B1-7，戊糖片球菌B2-3，植物乳桿菌B3-1，屎腸球菌B5-2，發(fā)酵乳桿菌E2-3混合菌群。試驗所用乳酸菌的菌種含量為1×109CFU/mL，接種量為5 mL/kg，即5×106CFU/g。如表1添加不同水平的纖維素酶、淀粉酶、CaCO3和尿素作為添加劑，進行青貯。

1.2.2青貯飼料的制作將新鮮玉米秸稈切至2～4 cm左右，用微波爐進行快速干燥，以掌握含水量，當含水量達到70%左右進行青貯。乳酸菌菌液培養(yǎng)物按設(shè)計量用滅菌噴壺均勻噴灑于切碎的玉米秸稈上，其他成分按照表1準確稱量與玉米秸稈均勻混合。按500 g/袋裝入聚乙烯青貯袋中，按緊、壓實，利用真空封口機抽氣封口，每個處理30個重復。于恒溫環(huán)境(20 ℃)中進行發(fā)酵，整個試驗青貯期為30 d，有氧暴露期為15 d。分別在青貯后第0、3、15、30 d，青貯結(jié)束后開啟剩余青貯袋有氧暴露，在開袋后第1、7、15 d取樣，每處理同時取3袋，進行相關(guān)指標的測定。

表1　試驗分組設(shè)計

注：對照組添加5mL培養(yǎng)液

1.2.3微生物計數(shù)及結(jié)果統(tǒng)計準確稱取25 g樣品，加入225 mL的無菌生理鹽水，37 ℃恒溫搖床搖動2 h后做10倍梯度稀釋后備用。乳酸菌的計數(shù)用MRS培養(yǎng)基，將接種好的培養(yǎng)皿密封好后置于37 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計菌落數(shù)；細菌計數(shù)采用普通瓊脂培養(yǎng)基，接種好以后置于37 ℃培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計菌落數(shù)；酵母計數(shù)采用孟加拉紅培養(yǎng)基、真菌計數(shù)采用葡萄糖麥芽浸膏培養(yǎng)基，接種好以后置于25 ℃培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計菌落數(shù)，每組設(shè)3個重復。

1.2.4青貯飼料pH測定采用四分法稱取25 g樣品，加入225 mL的無菌生理鹽水，4 ℃侵泡12 h后測定樣品pH。

1.2.5統(tǒng)計分析用SPSS19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1乳酸菌數(shù)量的變化

由表2可見，在青貯初期各試驗組和對照組乳酸菌數(shù)量快速增加，其中試驗組1、2、4、5、6、7、8乳酸菌生長較快均在4×107CFU/g以上。各組乳酸菌數(shù)量在第15 d時達到最大，試驗組1、2、6乳酸菌數(shù)量達到1×108數(shù)量級以上，其他試驗組以及對照組乳酸菌數(shù)量達到1×107數(shù)量級以上，各試驗組與對照組之間差異顯著。此后乳酸菌數(shù)量逐步減少，各試驗組乳酸數(shù)量均顯著大于對照組，其中試驗組1、6顯著大于其它試驗組。

有氧暴露期間各試驗組和對照組的乳酸菌數(shù)量繼續(xù)減少，有氧暴露第15 d時試驗組乳酸菌數(shù)量下降為1×105數(shù)量級、對照組為1×104數(shù)量級。各試驗組均顯著高于對照組，其中試驗組1和試驗組6的乳酸菌數(shù)量均高于其它試驗組。

表2　青貯飼料中乳酸菌數(shù)量的動態(tài)變化

注： 0 d表示青貯前，1～30 d表示青貯期，31～45 d表示暴露期。

2.2細菌數(shù)量的變化

由表3可見，青貯初期各處理組和對照組的細菌數(shù)量均不同程度增加，第3 d時基本達到最大值，以后細菌數(shù)量逐漸減少，青貯第30 d時試驗組5、6的細菌數(shù)量均顯著低于其它試驗組和對照組。

青貯開啟后各試驗組細菌數(shù)量均有所增加。開啟第7 d時細菌數(shù)量達到最大，第15 d細菌數(shù)相對有所減少但趨于平緩，各組細菌數(shù)量均在1×107CFU/g。

表3　青貯飼料中細菌數(shù)量的動態(tài)變化

2.3酵母菌數(shù)量的變化

由表4可見，青貯期各試驗組和對照組的酵母菌數(shù)量在第3 d達到最大，以后逐漸減少。第30 d時除試驗組7其余各組酵母菌數(shù)量均小于1×102CFU/g。

隨著暴露期延長酵母數(shù)量逐漸增多，第15 d時各組酵母菌數(shù)量均大于1×106CFU/g，各試驗組酵母菌數(shù)量均顯著低于對照組，其中試驗組5、6酵母菌數(shù)量顯著低于其它試驗組。

表4　青貯飼料中酵母菌數(shù)量的動態(tài)變化

2.4霉菌數(shù)量的變化

由表5可見，青貯期各試驗組和對照組的霉菌數(shù)量差異不明顯，隨著青貯發(fā)酵的進行霉菌逐漸減少，在第15 d時各組霉菌數(shù)量均小于1×103CFU/g。

青貯開啟15 d后各組的霉菌數(shù)量上升較大，第15 d時試驗組1和試驗組6霉菌數(shù)量達到1×104CFU/g數(shù)量級，其余試驗組以及對照組霉菌數(shù)量達到1×105CFU/g。試驗組1和試驗組6的霉菌數(shù)量顯著低于其它試驗組。

2.5pH的變化

隨著青貯的進行各試驗組和對照組的pH均下降。第15 d試驗組1、6及對照組pH降至4.2以下。第30 d試驗組1、2、6、7及對照組pH降至4.2以下。有氧暴露后第1 d，試驗組1、4、6及對照組pH繼續(xù)小幅降低，其余試驗組pH有小幅上升。第15 d，試驗組1、6及對照組pH值基本維持在4.2以下，其余試驗組pH都大于4.2。

表5　青貯飼料中霉菌數(shù)量的動態(tài)變化

表6　青貯飼料pH值動態(tài)變化

3討論

3.1玉米青貯過程中乳酸菌數(shù)量的變化

玉米青貯飼料中的乳酸菌是起主要作用的益生菌，它在厭氧狀態(tài)下將原料中的碳水化合轉(zhuǎn)化為乳酸。本試驗中乳酸菌數(shù)量在青貯初期迅速增長，在第 15 d時達到頂峰，之后有緩慢下降，最后維持在107數(shù)量級。在青貯發(fā)酵過程和有氧暴露后，各處理組乳酸數(shù)量均顯著大于對照組，其中試驗組1、6顯著大于其它試驗組，證明青貯時添加優(yōu)良乳酸菌和酶制劑都有利于青貯體系中乳酸菌快速繁殖。青貯裝袋時要求快速而且要壓實，空氣排出的程度對青貯質(zhì)量影響很大，壓實良好的青貯料 30 min內(nèi)可使環(huán)境中含氧量低于 0.5%(Woolofdr，1990)。青貯過程要求的環(huán)境氧最高不能超過 1%(體積比)，高于這個數(shù)值厭氧環(huán)境就會被破壞(Liske 等，1989)，但這種環(huán)境仍可足以維持一些需氧微生物的生長，如果青貯料處理不善這個問題會變得更為嚴重。實際上，隨著青貯飼料發(fā)酵過程的進行，乳酸菌對其他微生物的拮抗作用也有增加(Taylor, 2002)。

3.2玉米青貯過程中細菌數(shù)量的變化

本試驗中在青貯的第3 d細菌數(shù)較青貯前有大幅增長，這主要是由于在青貯早期環(huán)境中殘留部分氧氣從而使細菌快速生長，一般情況下如果青貯制作良好，腐敗菌會因缺氧逐漸停止活動甚至死亡，部分厭氧的芽胞菌繼續(xù)存在。青貯飼料開窖后隨著青貯酸性環(huán)境的喪失以及有氧環(huán)境的形成，腐敗菌的活動慢慢增強。青貯第30 d時試驗組5、6的細菌數(shù)量均顯著低于其它試驗組和對照組。本試驗中腐敗菌在青貯開啟前7 d快速增加，之后腐敗菌緩慢減少可能是由于青貯飼料中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗完導致細菌數(shù)量減少。這說明，添加乳酸菌和酶制劑可有效抑制有害細菌的繁殖，但添加CaCO3和尿素不利于有害細菌數(shù)量的控制，可能是因為CaCO3和尿素這類弱堿性物質(zhì)影響的乳酸的累積。

3.3玉米青貯過程中酵母菌和霉菌數(shù)量的變化

青貯飼料正常發(fā)酵時，隨著氧氣的耗盡酵母菌和霉菌數(shù)量減少。適量的酵母可以使青貯飼料產(chǎn)生酒香味，從而提高飼料的適口性。但當青貯飼料開窖后酵母菌和霉菌的活動加強并且分解乳酸使青貯飼料發(fā)生二次發(fā)酵導致飼料腐敗變質(zhì)。在青貯初期酵母菌和霉菌快速生長，主要是由于青貯制作中殘留空氣造成的，本試驗中青貯發(fā)酵初期酵母菌數(shù)量顯著高于青貯前，隨后酵母菌數(shù)量較少。青貯后期酵母菌和霉菌快速減少，主要是由于青貯飼料中的氧氣隨著發(fā)酵的進行而耗盡形成厭氧環(huán)境，另一方面乳酸菌的快速生長形成低pH環(huán)境和乳酸菌的分泌物抑制了酵母菌和霉菌的繁殖。有氧暴露開始后由于和空氣接觸酵母菌和霉菌的數(shù)量逐漸增加，但在整個有氧暴露階段各試驗組的酵母菌和霉菌數(shù)量均顯著低于對照組的，并且5和6組的酵母菌數(shù)量要少于其他試驗組，1和6組的霉菌數(shù)量要少于其他試驗組，這說明乳酸菌的快速繁殖有抑制酵母菌和霉菌的作用這和文獻的描述相一致。

3.4玉米青貯過程中pH的變化

pH是衡量青貯的酸度指標，pH的高低是青貯飼料是否青貯成功的重要指標，pH在4.0以下的青貯飼料，質(zhì)量優(yōu)等；pH4.1～4.3，質(zhì)量良好；pH4.4～5.0，質(zhì)量一般；pH在5.0以上，質(zhì)量劣等。本試驗中添加了尿素的試驗組pH相對較高，試驗組1、6 和對照組在第15 d都降到4.0以下，效果較好。產(chǎn)生這種效果的原因可能是由于這3組中都未添加尿素，尿素弱堿性，遇到酸可行成鹽，影響了青貯過程中有機酸的累積。Lessard 等用尿素處理玉米青貯，發(fā)現(xiàn)在青貯過程中，用尿素處理后青貯飼料含有較多粗蛋白，并且可降低中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，表明尿素處理玉米秸青貯可以改善玉米秸青貯飼料的營養(yǎng)價值。本試驗青貯飼料的營養(yǎng)成分分析正在進行，能否改善全株玉米青貯品質(zhì)還需后期結(jié)果驗證。

試驗組4在青貯過程中pH下降最慢，在第30 d時還在5.52，屬于劣質(zhì)青貯飼料，究其原因發(fā)現(xiàn)，試驗組4是唯一沒有添加纖維素酶的試驗組，可見纖維素酶在青貯過程中，對乳酸菌產(chǎn)生積累有機酸具有重要的意義，可以考慮在以后的試驗中，在添加CaCO3和尿素等堿性物質(zhì)時可增加纖維素酶的添加量，保證青貯順利進行。

4結(jié)論

玉米秸稈青貯過程中添加乳酸菌及纖維素酶、淀粉酶在促進乳酸菌的快速繁殖產(chǎn)酸、抑制有害細菌、酵母和霉菌的活動,添加CaCO3和尿素則具有相反的作用。

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Effect of Lactic Acid Bacteria Additive on the Microbial Groups in Silage

LI Bao-ming, YANG Zhi-rui

(GasuPolytechnicCollegeofAnimalHusbandry&Engineering,WuweiGansu733006)

Abstract:In order to research the effects of lactic acid bacteria additive on microbial colony in silage, the CaCO3, cellulase, amylase and urea were added to study the fermentation test of corn straw silage. The results showed that when the 0.5 % CaCO3, 0.01% cellulase and 0.01% amylase were added to the process of silage, the growth rate of lactic acid bacteria was significantly higher than the other groups, and the growth rates of bacteria, yeast and mold were significantly lower than the other groups. When silage was exposed to oxygen gas, the velocity of the number reduction of lactic acid bacteria was significantly lower than other treatment groups, and the growth rates of bacteria, yeast and mold were significantly lower than other treatment groups.

Key words:silage；microbial groups；lactic acid bacteria additive

[收稿日期]2015-09-14

[作者簡介]李寶明(1979-)，甘肅環(huán)縣人，本科，講師，主要從事動物檢疫、獸醫(yī)衛(wèi)生檢驗等課程的理論與實踐教學工作。

[中圖分類號]S 816.653

[文獻標識碼]A

[文章編號]1004-6704(2016)01-0013-05