史　蕾, 楊文聰, 曾淑瑩, 莫婷婷,張　召, 曹曼麗, 劉海洋

(1. 廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系, 廣州 510303; 2. 華南理工大學(xué)化學(xué)系, 廣州 510641)

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咔咯鈷(Ⅲ)配合物與DNA的相互作用及抗腫瘤活性

史蕾1, 楊文聰1, 曾淑瑩1, 莫婷婷1,張召2, 曹曼麗1, 劉海洋2

(1. 廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系, 廣州 510303; 2. 華南理工大學(xué)化學(xué)系, 廣州 510641)

摘要合成了10-(4-羥基苯基)-5,15-二(五氟苯基)咔咯鈷(Ⅲ)配合物(1-Co)和10-(4-吩噻嗪苯基)-5,15-二(五氟苯基)咔咯鈷(Ⅲ)配合物(2-Co), 并采用核磁共振波譜、 質(zhì)譜和紫外-可見光譜等對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征, 利用紫外光譜、 熒光光譜、 圓二色譜、 黏度測試和瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)研究了配合物1-Co和2-Co與小牛胸腺DNA(ct-DNA)之間的相互作用. 結(jié)果表明, 配合物1-Co和2-Co與DNA之間的作用模式為外部結(jié)合, 且在光照下均能引發(fā)DNA斷裂. 細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明, 配合物1-Co和2-Co具有很低的暗細(xì)胞毒性, 但在光照條件下均能有效抑制H460, HeLa, A549等腫瘤細(xì)胞株增殖, 表明配合物1-Co和2-Co在光動力治療中具有潛在的應(yīng)用價值. 細(xì)胞核染色和線粒體膜電位檢測結(jié)果表明, 在光照條件下配合物2-Co可能是通過氧化損傷線粒體的途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖.

關(guān)鍵詞咔咯; 吩噻嗪; 卟啉; DNA; 抗腫瘤活性

卟啉類化合物及其衍生物具有獨特的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)及光學(xué)特征, 已被廣泛應(yīng)用于高選擇性熒光和比色離子探針[1]、 燃料敏化太陽能電池[2～5]及光動力學(xué)治療(PDT)[6]等領(lǐng)域. 咔咯(Corrole)是與卟啉具有類似結(jié)構(gòu)的大環(huán)化合物, 在失去3個內(nèi)氫原子變成三價陰離子后可與高價態(tài)金屬形成穩(wěn)定的配合物[7]. 近年來的研究表明, 咔咯及其配合物在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有潛在應(yīng)用前景[8]. 例如, 含單羥基的咔咯衍生物能光誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]; 磺酸型鎵咔咯配合物與乳腺癌細(xì)胞靶向蛋白質(zhì)自組裝形成的非共價復(fù)合物可用于腫瘤組織的檢測和消除[10]; 磺酸型鐵咔咯配合物能有效減緩動脈粥樣硬化的發(fā)生[11]. 許多抗腫瘤藥物分子均以DNA為作用靶點[12～14], 藥物與細(xì)胞內(nèi)DNA間的相互作用可能會抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制, 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡[15]. 因此研究咔咯及其金屬配合物與DNA的相互作用有助于進(jìn)一步了解該類化合物的藥物作用機(jī)理[16]. 研究表明, 咔咯及其鎵、 鐵、 錳等金屬配合物能以外部或插入模式與DNA結(jié)合, 并能在光照或氧化劑條件下有效斷裂DNA[17～20]. Zhou等[21～23]合成了一系列陽離子型咔咯, 發(fā)現(xiàn)它們可通過穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)抑制端粒酶表達(dá). Purrello等[24]發(fā)現(xiàn)+3價陽離子型的吡啶基咔咯及其鍺配合物可識別不同結(jié)構(gòu)類型核酸, 可用作DNA分子探針.

鈷是生物體內(nèi)必需的微量元素, 在生命體內(nèi)起重要生理作用的維生素B12和超氧化物歧化酶的活性中心都含有鈷離子[25,26]. 鈷金屬配合物在生物化學(xué)中的應(yīng)用也引起了科研工作者的注意， 在抗菌[27,28]、 抗腫瘤[29,30]、 抗氧化[31,32]和人工核酸酶[33,34]等領(lǐng)域都有潛在應(yīng)用前景. 本文制備了10-(4-羥基苯基)-5,15-二(五氟苯基)-咔咯鈷(Ⅲ)(1-Co)和10-(4-吩噻嗪苯基)-5,15-二(五氟苯基)咔咯鈷(Ⅲ)(2-Co)(Scheme 1), 并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征, 研究了其與DNA的相互作用及抗腫瘤活性.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

小牛胸腺DNA(ct-DNA)、 吩噻嗪-10-碳酰氯(PTZ)、 1,8-二氮雜二環(huán)[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)均購于Sigma公司; pBR322DNA購于大連寶生物工程有限公司; 三羥甲基甲胺(Tris)、 氯化鈉(NaCl)、 硼酸(H3BO3)、 瓊脂糖、 溴酚藍(lán)和溴化乙錠(EB)均為色譜純, 購于上海生工生物工程公司; H460, HeLa, A549等腫瘤細(xì)胞株均購于American Type Culture Collection公司; 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購于Amresco公司; Hoechst33342購于上海江萊生物科技有限公司; 線粒體膜電位檢測試劑盒(含JC-1原液及JC-1緩沖液). 購于上海前塵生物科技有限公司; 其它試劑均為分析純, 實驗用水為去離子水.

1.2咔咯鈷(Ⅲ)配合物的合成

參照文獻(xiàn)[17]方法合成化合物1和2. 稱取31.1 mg化合物1溶解于30 mL甲醇中, 再加入146 mg四水合乙酸鈷[(CH3COO)2Co54H2O]和105 mg三苯基膦(PPh3), 室溫反應(yīng)20 min. 反應(yīng)結(jié)束后, 旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑, 用二氯甲烷/水(200 mL, 體積比1∶1)萃取, 收集有機(jī)相并用水洗滌3次. 柱層析分離, 以二氯甲烷(DCM)/正己烷(Hex)(體積比1∶2)為洗脫劑, 收集紅色條帶, 旋轉(zhuǎn)蒸干得到血紅色產(chǎn)物1-Co, 產(chǎn)率約為85%.1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 8.69(d, 2H), 8.31(d, 2H), 8.20(d, 2H), 8.01(d, 2H), 7.73～7.68(m, 5H), 7.55(d, 3H), 7.49(d, 5H), 7.11(d, 6H).19F NMR(376 MHz, CDCl3),δ: 136.80～136.92(m, 2F), 137.80～137.94(m, 2F), 154.26(m, 2F), 161.99～162.36(m, 2F), 162.56～162.80(m, 2F). UV-Vis(CH2Cl2),λmax/nm: 381, 402, 554, 589. HR-MS,m/z計算值: 1063.1065(C55H28CoF10N4NaOP); 實測值: 1063.1071[M+Na]+.

配合物2的合成過程與配合物1相同, 只是在合成中用化合物2代替化合物1, 反應(yīng)物的用量分別為40 mg(化合物2)、 30 mL(甲醇)、 196 mg(四水合乙酸鈷)和141 mg(三苯基膦), 反應(yīng)時間為30 min. 產(chǎn)率約為90%.1H NMR(400 MHz, CDCl3),δ: 8.76(d, 2H), 8.28(d, 4H), 8.08(d, 3H), 7.85(d, 2H), 7.73(d, 2H), 7.61(d, 1H), 7.56～7.40(m, 10H), 7.33(d, 2H), 7.05(d, 3H), 6.70(d, 6H).19F NMR(376 MHz, CDCl3),δ: 136.89(d, 2F), 137.88(d, 2F), 154.16(d, 2F), 162.00(d, 2F), 162.51～162.70(m, 2F). UV-Vis(CH2Cl2),λmax/nm: 376, 409, 554, 593. HR-MS,m/z計算值: 1288.1314(C66H35CoF10N5NaO2PS); 實測值: 1288.1327[M+Na]+.

1.3咔咯鈷(Ⅲ)配合物與ct-DNA結(jié)合模式的表征

所有測定均在Tris-HCl緩沖溶液I(5 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L NaCl, 2%(體積分?jǐn)?shù))DMF, pH=7.2)中進(jìn)行. ct-DNA濃度通過測定其紫外吸收光譜來確定, ct-DNA在260 nm處的摩爾消光系數(shù)為6600 mol-1·cm-1·L[35].

1.3.1紫外-可見光譜測試以緩沖溶液I作為空白, 配制濃度為1.0×10-5mol/L的咔咯鈷(Ⅲ)配合物, 逐次加入2 μL濃度為1.5×10-3mol/L的ct-DNA儲備液, 使ct-DNA與配合物濃度的比值不斷增加. 測定前攪拌5 min, 使ct-DNA與配合物完全結(jié)合并分布均勻, 檢測咔咯鈷(Ⅲ)配合物在300～800 nm范圍內(nèi)的紫外-可見光譜變化. 配合物1-Co和2-Co與DNA的結(jié)合常數(shù)(Kb)通過下式計算[36]:

(1)

駱駝城井灌區(qū)水資源管理工作是全縣的示范點，安裝取水計量設(shè)施并實現(xiàn)遠(yuǎn)程傳輸?shù)膬?yōu)點，一是便于管理機(jī)井，通過電腦就可以掌握當(dāng)前的用水機(jī)井?dāng)?shù)、用水量、剩余水量等；二是發(fā)現(xiàn)故障及時排除；三是方便群眾購買，便于查看；四是實現(xiàn)了購水、用水的公開透明，消除了用水矛盾。

1.3.2熒光光譜測試咔咯鈷(Ⅲ)配合物自身沒有熒光, 本文采用溴化乙錠(EB)競爭法間接研究配合物與DNA的相互作用. 在EB-DNA([EB]=5.0×10-6mol/L, [DNA]=3.0×10-5mol/L)體系中, 逐次加入3 μL濃度為1×10-3mol/L的配合物溶液, 攪拌5 min使ct-DNA與配合物完全結(jié)合并分布均勻, 然后測定EB-DNA在500～700 nm范圍內(nèi)的熒光光譜變化(λex=370 nm). 通過Stern-Volmer方程計算不同溫度下的猝滅常數(shù)(KSV)[37]:

(2)

式中:F0和F分別代表EB-DNA 自身熒光強(qiáng)度以及與配合物結(jié)合時的熒光強(qiáng)度; [Q]代表配合物的濃度;τ0表示未加配合物時的熒光平均壽命(～10-8s); 以F0/F對[Q]作圖, 線性擬合的斜率即為KSV.

1.3.3圓二色光譜(CD)測試在固定ct-DNA濃度為1.5×10-4mol/L的溶液中逐次加入咔咯鈷(Ⅲ), 使配合物濃度依次為1.5×10-5, 3.0×10-5和6.0×10-5mol/L. 每次測定前攪拌5 min, 使ct-DNA與配合物完全結(jié)合并分布均勻, 然后再測定在225～600 nm范圍內(nèi)ct-DNA的圓二色光譜(CD)變化.

1.3.4黏度測試黏度測試采用烏氏黏度計, 恒溫槽溶液溫度維持在(30±0.1)℃. 固定 ct-DNA濃度為1.0×10-4mol/L, 逐漸加大咔咯鈷(Ⅲ)配合物的濃度, 分別測定不同配合物濃度下溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間, 按下式計算黏度(η)[38]:

(3)

式中:t0為緩沖溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間,t為含不同濃度配合物的DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需的時間. 以(η/η0)1/3對[配合物]/[DNA]的比值作圖,η0為DNA溶液的相對黏度.

1.4瓊脂糖凝膠電泳

向含有0.1 μg pBR322DNA的溶液中加入不同濃度的咔咯鈷(Ⅲ)配合物, 再加入Tris-HCl緩沖溶液Ⅱ(5 mmol/L Tris-HCl, 18 mmol/L NaCl, 2%DMF, pH=7.2), 使總體積為10 μL. 將反應(yīng)液置于紅光燈(5 W)下照射2 h(將光源和反應(yīng)液置于避光系統(tǒng), 反應(yīng)液和光源之間的距離為10 cm). 瓊脂糖凝膠電泳2 h(77 V, 30 mA)后, 放入EB溶液中染色15 min, 用水沖洗后放入凝膠成像系統(tǒng)中成像.

1.5細(xì)胞毒性實驗

配合物1-Co與2-Co對宮頸癌細(xì)胞(Hela)與肺癌細(xì)胞(H460, A549)生長抑制的光毒性及暗毒性采用MTT方法測試, 具體測試條件參照文獻(xiàn)[39]. 首先選取對數(shù)生長期的測試細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)(5×103Cell/well), 于37 ℃, 含5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育生長12 h, 每組設(shè)6個復(fù)孔, 重復(fù)3次. 吸去上清液, 加入新的包含不同濃度的測試化合物的培養(yǎng)基, 每孔總體積100 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)2 h后, 距離培養(yǎng)皿15.5 cm處用燈光照射1 h(620 nm紅光, 5 W, 60 min, 光照強(qiáng)度為750 lx), 然后培養(yǎng)2 h, 去掉培養(yǎng)基, 每孔加入100 μL MTT(5 mg/mL), 繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上層清液, 每孔加入100 μL DMSO, 振蕩使結(jié)晶完全溶解后, 用酶標(biāo)儀測定波長在570 nm下各孔的吸光度值, 根據(jù)所測得的各細(xì)胞存活率, 計算目標(biāo)化合物對腫瘤的半數(shù)抑制濃度(IC50)值, 得到配合物的光毒性結(jié)果. 配合物的暗毒性測試與光毒性類似, 不同之處在于免去光源照射.

1.6細(xì)胞核染色

將生長對數(shù)期的肺癌H460細(xì)胞首先接種在六孔板內(nèi)(2×105Cell/well), 于37 ℃、 含5%二氧化碳的飽和溶液中培養(yǎng)12 h后, 加入配合物2-Co (20 μmol/L), 在與1.5節(jié)中相同的光照條件下, 光照后繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 以沒有進(jìn)行任何處理的細(xì)胞作為對照測試. 借助Hoechst 33342(5 μg/mL)染色[39], 使用倒置熒光顯微鏡觀察加入配合物2-Co后肺癌細(xì)胞核的狀態(tài)變化.

1.7線粒體膜電位的變化

將生長對數(shù)期的肺癌H460細(xì)胞首先接種在六孔板內(nèi)(2×105Cell/well), 于37 ℃, 含5%二氧化碳的飽和溶液中培養(yǎng)12 h后, 加入配合物2-Co (20 μmol/L), 在與1.5節(jié)中相同的光照條件下, 光照后繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 以沒有進(jìn)行任何處理的細(xì)胞作為對照測試. 肺癌細(xì)胞首先用0 ℃的PBS洗滌3次, 然后加入JC-1原液, 于避光、 37 ℃下培養(yǎng)染色20 min. 再用JC-1緩沖溶液洗滌3次后, 通過倒置熒光顯微鏡觀察加入配合物2-Co后肺癌細(xì)胞線粒體膜電位的變化.

2結(jié)果與討論

2.1化合物與DNA的結(jié)合模式

2.1.1紫外-可見吸收光譜分析小分子配合物與DNA結(jié)合后, 由于小分子所處環(huán)境發(fā)生變化, 電子結(jié)構(gòu)受到DNA擾動, 會引起其紫外-可見吸收光譜變化, 可以通過變化幅度推測其與DNA結(jié)合強(qiáng)度和模式. 對于卟啉類分子, 通常插入結(jié)合會導(dǎo)致卟啉Soret帶發(fā)生較大幅度減色效應(yīng)(大于35%), 并伴隨明顯紅移現(xiàn)象(大于15 nm); 而當(dāng)發(fā)生外部結(jié)合模式時常伴隨較小程度紅移和減色效應(yīng)[40]. 如圖1所示, 隨著ct-DNA的加入, 配合物1-Co和2-Co的紫外光譜Soret帶都發(fā)生了較小程度的減色效應(yīng), 減色率分別為14.0%和10.9%, 并伴有微弱的紅移(3 nm). 計算結(jié)果表明, 配合物1-Co和2-Co與DNA的結(jié)合常數(shù)分別為1.21×106L/mol和2.65×105L/mol, 推測這2種咔咯鈷(Ⅲ)配合物與DNA結(jié)合模式可能均為外部結(jié)合.

2.1.2熒光光譜分析咔咯鈷(Ⅲ)配合物沒有熒光, 因此采用溴化乙錠(EB)作為熒光探針間接探究2種配合物與DNA的相互作用. EB自身熒光很弱, 但與DNA結(jié)合后形成的EB-DNA體系在610 nm會有很強(qiáng)的熒光[41]. 如圖2所示, 隨著配合物1-Co的加入, EB-DNA的熒光強(qiáng)度不斷降低, 表明1-Co與DNA之間發(fā)生了相互作用. 熒光猝滅通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅, 動態(tài)猝滅是由于處于激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生碰撞而導(dǎo)致熒光猝滅, 溫度升高, 有效碰撞幾率增大, 進(jìn)而猝滅常數(shù)(KSV)相應(yīng)地增大; 靜態(tài)猝滅是指猝滅劑與熒光分子在基態(tài)時形成了不發(fā)光的基態(tài)復(fù)合物而導(dǎo)致熒光猝滅, 溫度升高使得基態(tài)復(fù)合物穩(wěn)定性下降,KSV相應(yīng)減小[42]. 由Stern-Volmer方程擬合結(jié)果可以看出, 不同溫度下配合物1-Co的F0/F與[Q]之間有很好的線性關(guān)系, 表明猝滅方式只有一種. 且隨著溫度升高,KSV減小, 分別為5.22×104(298 K), 3.12×104(304 K)和2.41×104(310 K)(表1), 遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅常數(shù)(2×102L/mol)[42,43]. 配合物2-Co與1-Co表現(xiàn)出相似的規(guī)律(圖3), 隨著溫度升高, 猝滅常數(shù)也相應(yīng)減小, 分別為4.87×104(298 K), 4.83×104(304 K)和4.03×104(310 K)(表1). 因此, 推測這2種咔咯鈷(Ⅲ)配合物對EB-DNA體系熒光猝滅過程可能均為靜態(tài)猝滅過程.

2.1.3圓二色譜分析利用圓二色譜進(jìn)一步研究了咔咯鈷(Ⅲ)配合物與DNA的結(jié)合模式. ct-DNA自身在246 nm處有1個B型DNA螺旋引起的負(fù)CD吸收峰, 在275 nm處有1個由DNA堿基對堆積引起的正CD吸收峰[44]. 通常, 小分子與DNA以插入模式結(jié)合會導(dǎo)致2個正、 負(fù)峰吸收強(qiáng)度增加, 而發(fā)生外部結(jié)合或靜電相互作用對正、 負(fù)CD峰吸收強(qiáng)度影響不大[45]. 如圖4所示, 隨著配合物2-Co和1-Co的加入, ct-DNA的正、 負(fù)CD信號峰強(qiáng)度都發(fā)生了微小的減弱, 且峰形沒有發(fā)生變化. 因此可以推測2種配合物與DNA之間沒有發(fā)生插入模式結(jié)合, 且未導(dǎo)致DNA的構(gòu)象產(chǎn)生變化. 此外, 對于非手性卟啉分子, 其在Soret帶沒有吸收峰, 但與DNA發(fā)生相互作用可能會產(chǎn)生誘導(dǎo)CD(ICD): 當(dāng)非手性卟啉分子與DNA發(fā)生外部結(jié)合時, 會產(chǎn)生正的ICD或沒有ICD; 當(dāng)采取插入模式結(jié)合時, 會產(chǎn)生負(fù)的ICD; 而采取自堆積模式結(jié)合時, 會同時出現(xiàn)正、 負(fù)ICD[24,40]. 由圖4可以看出, 隨著2種配合物的加入, 均未看到有ICD峰的出現(xiàn), 因此可進(jìn)一步確定這2種咔咯鈷(Ⅲ)配合物與ct-DNA發(fā)生的均是外部結(jié)合.

2.1.4黏度測試分析當(dāng)配合物插入到DNA堿基對間時, 會導(dǎo)致DNA雙螺旋延長, 使得DNA溶液的黏度增加(如經(jīng)典插入劑EB); 部分插入模式可能會使DNA雙螺旋發(fā)生扭結(jié), 導(dǎo)致DNA溶液的黏度減小; 而配合物與DNA發(fā)生外部結(jié)合時, 對DNA構(gòu)象影響不大, DNA黏度也無明顯變化[46～48]. 如圖5所示, 隨著配合物1-Co和2-Co的加入, DNA溶液的黏度呈上升趨勢, 但增加幅度不大, 遠(yuǎn)小于經(jīng)典插入劑EB引起DNA黏度增大的程度. 因此, 綜合黏度測試和光譜學(xué)實驗結(jié)果, 可判斷配合物1-Co和2-Co均以外部模式與DNA相互作用.

2.2 咔咯鈷(Ⅲ)光斷裂pBR322 DNA

圖6為配合物1-Co 和 2-Co的紫外-可見吸收光譜圖. 可以看出這2種咔咯鈷配合物均表現(xiàn)出咔咯典型的Soret帶(400 nm附近)和Q帶(500～700 nm), 配合物2-Co與配合物1-Co相比, 在260 nm附近多出1個吩噻嗪的吸收峰; 這2個化合物在紅光區(qū)均有一定的吸收. 圖7為不同濃度的配合物1-Co和配合物2-Co在紅光照射下斷裂DNA的電泳圖. DNA空白樣品(無光照)、 DNA空白樣品(光照2 h)以及DNA中加入320 μmol/L配合物1-Co而無光照條件下均未發(fā)現(xiàn)DNA有明顯的斷裂[圖7(A)中Lanes 1～3]. 在光照下, 當(dāng)配合物1-Co的濃度為40 μmol/L時, 其能使7%的Form Ⅰ DNA(SC)轉(zhuǎn)變?yōu)镕orm Ⅱ DNA(NC)[圖7(A)中Lane 4]; 增大配合物濃度, 其光斷裂DNA的活性相應(yīng)增強(qiáng); 當(dāng)配合物濃度為320 μmol/L時, 其光斷裂DNA的活性最強(qiáng), 斷裂分?jǐn)?shù)為14%[圖7(A)中Lane 8]. 配合物2-Co表現(xiàn)出相似的規(guī)律, 但是其光斷裂DNA的活性明顯高于配合物1-Co, 當(dāng)配合物2-Co的濃度為40 μmol/L時, 其能使28%的Form I DNA(SC)轉(zhuǎn)變?yōu)镕ormⅡ DNA(NC)[圖7(B)中Lane 4]; 當(dāng)濃度增大為320 μmol/L時, 其斷裂分?jǐn)?shù)達(dá)到41%[圖7(B)中Lane 8]. 可以看出, 配合物2-Co在紅光照射下表現(xiàn)出良好的光斷裂DNA活性, 預(yù)示著其在光動力治療(PDT)方面具有潛在的應(yīng)用前景.

2.3抗腫瘤活性

2.3.1細(xì)胞毒性分析采用MTT法評估了在暗條件或光照下, 配合物1-Co和2-Co分別對H460, HeLa和A549等腫瘤細(xì)胞株增殖的影響. 從表2數(shù)據(jù)可以看出, 配合物1-Co和配合物2-Co在暗條件下對所選用的3種細(xì)胞株生長抑制作用不明顯. 然而, 在光照條件下, 配合物1-Co和配合物2-Co對H460, HeLa和A549細(xì)胞的增殖均表現(xiàn)出有效的抑制作用. 配合物1-Co和2-Co極低的暗毒性和良好光細(xì)胞毒性表明它們作為新型光敏劑在光動力治療中具有潛在應(yīng)用. 從表2中可以看出, 在所選用的3種腫瘤細(xì)胞株中, 配合物1-Co和2-Co對H460的細(xì)胞毒性最強(qiáng). 此外, 配合物2-Co具有更低的IC50值, 表明配合物2-Co的細(xì)胞毒性高于配合物1-Co. 此現(xiàn)象可能與配合物2-Co中吩噻嗪基團(tuán)潛在的抗腫瘤作用及脂溶性的吩噻嗪基團(tuán)能夠增強(qiáng)其和細(xì)胞的跨膜吸收等諸多因素有關(guān)[17,49].

2.3.2細(xì)胞凋亡分析為了進(jìn)一步研究咔咯鈷(Ⅲ)配合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的潛在機(jī)理, 以配合物2-Co為例, 采用Hoechst 染色H460細(xì)胞核的方法觀測細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)變化. 如圖8所示, 在不加化合物單獨光照條件下, 細(xì)胞呈現(xiàn)完整的細(xì)胞核形態(tài). 然而, 在光照和配合物2-Co共同作用下, H460細(xì)胞核發(fā)生皺縮, 染色質(zhì)凝結(jié)并伴有細(xì)胞核碎片出現(xiàn), 這都是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)[50]. 因此, 推測配合物2-Co可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖[39].

2.3.3線粒體膜電位分析線粒體在細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用[51,52], 在細(xì)胞凋亡早期會不可逆地發(fā)生線粒體跨膜電位的降低[53]. JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針. 當(dāng)線粒體跨膜電位處正常水平時, JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物, 發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光; 一旦線粒體膜電位下降或喪失, JC-1會以單體的形式存在于胞漿中, 產(chǎn)生綠色熒光[54]. 如圖9所示, 在單獨光照條件下, JC-1發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光, 表明線粒體膜電位處于正常水平. 光照條件下隨著配合物2-Co的加入, JC-1發(fā)出綠色熒光, 且隨著配合物2-Co濃度升高, 綠色熒光強(qiáng)度增加, 表明配合物2-Co可以氧化損傷肺癌細(xì)胞線粒體膜, 導(dǎo)致線粒體膜電位下降, 且損傷程度具有濃度依賴性. 綜合細(xì)胞核形態(tài)變化可進(jìn)一步推測配合物2-Co可能是通過氧化損傷線粒體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖的.

3結(jié)論

合成并表征了咔咯鈷(1-Co)和咔咯-吩噻嗪鈷(2-Co)2種配合物, 采用紫外-可見光譜、 熒光光譜、 圓二色譜、 黏度測試和瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)研究了其與DNA的相互作用. 結(jié)果表明, 配合物1-Co和配合物2-Co均是通過外部模式與DNA相結(jié)合, 且在光照下能夠引起DNA發(fā)生斷裂, 且配合物2-Co的活性大于配合物1-Co. MTT實驗結(jié)果表明, 在光照下配合物1-Co和配合物2-Co能有效抑制H460, HeLa和A549細(xì)胞增殖, 同樣配合物2-Co的細(xì)胞毒性更強(qiáng). 通過觀察細(xì)胞核形態(tài)并測試線粒體膜電位, 推斷配合物2-Co可能是通過氧化損傷線粒體的途徑導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡的.

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? Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21171057, 21371059), the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China(No.S2012040006270), the Science and Technology Innovation Foundation of Guangdong University Students(Special Foundation for Glimbing Plan) of China and the National Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates(No.201514278005).

(Ed.: F, K, M)

DNA-binding and Anti-tumor Activities of Cobalt Corrole Complexes?

SHI Lei1*, YANG Wencong1, ZENG Shuying1, MO Tingting1,ZHANG Zhao2, CAO Manli1, LIU Haiyang2*

(1.DepartmentofChemistry,GuangdongUniversityofEducation,Guangzhou510303,China;2.DepartmentofChemistry,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510641,China)

KeywordsCorrole; Phenothiazine; Porphyrin; DNA; Anti-tumor activity

Abstract10-(4-Hydroxylphenyl)-5,15-bis(pentafluorophenyl)corrolatocobalt(1-Co) and 10-(4-phenothiazine)-5,15-bis(pentafluorophenyl)corrolatocobalt(2-Co) were synthesized and characterized by NMR, HR-MS and UV-Vis spectrometries. The interactions of the two complexes with ct-DNA were studied by fluorescence, UV-Vis and circular dichroism spectrometries, viscosity measurements as well as agarose gel electrophoresis. The results suggested that complexes 1-Co and 2-Co both interact with DNAviaan outside binding mode. Furthermore, the two cobalt corrole complexes can effectively cleavage DNA under irradiation. MTT experiments indicated that both complexes display low levels of dark toxicity, but have high photocytoto-xic activity against H460, HeLa and A549 cell lines. This implies complexes 1-Co and 2-Co may have potential application in photodynamic therapy(PDT) as photosensitizer. Through the observation of the nucleus morphological and the measurement of mitochondrial membrane potential, we speculated that complex 2-Co can constrain tumor cell proliferation through the oxidative damage of mitochondria possibly.

收稿日期:2016-01-13. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-26.

基金項目:國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21171057, 21371059)、 廣東省自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: S2012040006270)、 廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項資金(攀登計劃專項資金)和國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(批準(zhǔn)號: 201514278005)資助.

中圖分類號O614.81

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

聯(lián)系人簡介: 史蕾, 女, 博士, 講師, 主要從事咔咯大環(huán)化合物的合成及生物學(xué)性質(zhì)研究. E-mail: shil@gdei.edu.cn

劉海洋, 男, 博士, 教授, 主要從事咔咯大環(huán)化合物的合成及性質(zhì)研究. E-mail: chhyliu@scut.edu.cn