牛曉艷（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

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豬ITGB-5基因外顯子多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)性研究

牛曉艷
（山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

摘 要：采用PCR—測(cè)序的方法對(duì)豬ITGB-5基因所有17個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，經(jīng)多重比對(duì)后找到該基因內(nèi)的SNPs。對(duì)該基因外顯子內(nèi)所有SNPs進(jìn)行Snap-shot分型并與黏附表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明：ITGB-5外顯子內(nèi)共發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNPs，其中有3個(gè)SNPs關(guān)聯(lián)分析結(jié)果呈現(xiàn)顯著，分別位于該基因的5號(hào)及13號(hào)外顯子。結(jié)合該基因的生物學(xué)功能以及本試驗(yàn)的結(jié)果表明：ITGB-5可能是與仔豬腹瀉相關(guān)的基因。

關(guān)鍵詞：仔豬腹瀉；ITGB-5基因；Snap-shot分型；關(guān)聯(lián)分析

仔豬腹瀉是導(dǎo)致畜牧業(yè)損失的重要原因之一，由于仔豬腹瀉造成的損失占到畜牧業(yè)總產(chǎn)值的20%左右，腹瀉造成的死亡占仔豬總死亡數(shù)的40%左右。仔豬腹瀉常常導(dǎo)致飼料報(bào)酬率下降，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，產(chǎn)生僵豬等。在所有腹瀉當(dāng)中，由ETEC（產(chǎn)腸毒素大腸桿菌）引起的腹瀉是最為常見的一種，這種腹瀉發(fā)生的機(jī)理是以大腸桿菌和宿主小腸上皮細(xì)胞的黏附為前提，所以可以表達(dá)受體蛋白的個(gè)體為易感個(gè)體，不表達(dá)受體蛋白的個(gè)體為抗性個(gè)體。根據(jù)大腸桿菌表達(dá)菌毛的種類，又分為F4ab，F(xiàn)4ac和F4ad三種類型。ETEC粘附于豬小腸上皮細(xì)胞后，釋放毒素，導(dǎo)致腸道內(nèi)電解質(zhì)平衡紊亂，從而導(dǎo)致腹瀉。

豬ITGB-5基因位于豬13號(hào)染色體31q41區(qū)段。ITGB-5屬于整合素家族成員，編碼細(xì)胞表面糖蛋白，主要功能是參與免疫細(xì)胞的黏附作用。該基因在生物進(jìn)程中具有多種功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)的細(xì)胞遷移，細(xì)胞變異和細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)潛在的一些腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和癌細(xì)胞的擴(kuò)散等。ITGB-5通常以二聚體的形式存在，包括α和β亞基，該異二聚體優(yōu)先結(jié)合在細(xì)胞黏附分子上，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的成分。該基因已經(jīng)徐如海［1］等經(jīng)抑制消減雜交篩選技術(shù)而得到，可作為研究仔豬腹瀉的候選基因之一。

本研究基于PCR-測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬ITGB-5基因外顯子的SNPs，通過Snap-shot技術(shù)對(duì)該基因所有外顯子內(nèi)的SNPs進(jìn)行分型，再經(jīng)卡方檢驗(yàn)獲得其與黏附表型之間的關(guān)聯(lián)性。為進(jìn)一步研究該基因和仔豬腹瀉之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)所采用的動(dòng)物個(gè)體來源于中國農(nóng)科院畜牧所。是由大白，長(zhǎng)白和松黑三個(gè)品種所組成的群體，該群體為兩代半同胞家系，包括366頭子代和77頭父母代個(gè)體。根據(jù)黏附表型，選取6頭黏附個(gè)體（case：Y）以及6頭非黏附個(gè)體（control：NY）作為測(cè)序反應(yīng)的試驗(yàn)樣本，case組與control組之間無親緣關(guān)系。

1.1.2試驗(yàn)試劑 PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；超純dNTP，PCR反應(yīng)Buffer（10X），Taq酶，Marker DL2000，6X上樣緩沖液均購自Invitrogen公司；雙蒸水，II型瓊脂糖為實(shí)驗(yàn)室自備。

SNP基因型分型：Snapshot委托上海捷瑞生物公司進(jìn)行。

用于測(cè)量黏附表型的菌株分別為：195（F4ab，C83901，O8；K87，豬源），200（F4ac，C83907，O149：K91，豬源），216（F4ad，C83923，O8：K87，豬源），238（C83286，O38：K99，牛源，陰性對(duì)照菌）。以上菌株均購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.3引物設(shè)計(jì) 通過軟件Primer 3.0對(duì)ITGB-5基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)，用于PCR反應(yīng)的引物如下表所示：

表1　ITGB-5引物序列

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1黏附表型測(cè)定 三個(gè)品種小腸上皮細(xì)胞與大腸桿菌菌毛之間的黏附情況通過顯微鏡觀察后記錄［2］。根據(jù)小腸上皮細(xì)胞吸附大腸桿菌的個(gè)數(shù)，分為黏附（Y）和非黏附（NY）兩種類型。

黏附標(biāo)準(zhǔn)采用單個(gè)小腸上皮細(xì)胞：黏附多于5個(gè)細(xì)菌為黏附。

1.2.2DNA提取 取大小為1 g的耳組織樣本，放入Eppendorf管中剪碎。耳組織DNA提取過程采用《分子克隆試驗(yàn)指南》中所提供的酚-氯仿法［3］，提取獲得的DNA用雙蒸水溶解后，將樣品在50 ℃下放置1小時(shí)，滅DNA酶。

1.2.3PCR反應(yīng)體系和條件 PCR反應(yīng)體系：DNA模板（50～75 ng/ul）：1.5 ul；上游引物（10 μmol/L）：0.5 ul，下游引（10 μmol/L）：0.5 ul；dNTP（10 μmol/L）：1.6 ul；Buffer：2.0 ul；Taq酶（5 U/ul）：0.4 ul；ddH2O：14.1～14.6 ul。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃預(yù)變性30 s，55 ℃～65 ℃退火30～45 s，72 ℃延伸30～45 s，72 ℃終末延伸7 min～10 min，20 ℃保存。

1.2.4測(cè)序比對(duì) 將PCR產(chǎn)物收集后送至北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果用Chromas軟件判讀。部分片段（F1，F(xiàn)3，F(xiàn)6，F(xiàn)9）由于片段內(nèi)存在高GC含量的區(qū)域（在70%以上），普通測(cè)序反應(yīng)無法實(shí)現(xiàn)，采用克隆測(cè)序的方法進(jìn)行。

質(zhì)粒小提：質(zhì)粒小提采用試劑盒進(jìn)行。

克隆測(cè)序：將PCR產(chǎn)物切膠回收后與T-easy載體連接，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)獲得的陽性菌落送公司進(jìn)行克隆測(cè)序。

測(cè)序結(jié)束后將所獲得的試驗(yàn)個(gè)體各外顯子的序列采用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，獲得各外顯子內(nèi)SNPs和片段缺失的信息。

1.2.5Snapshot分型

對(duì)選定區(qū)段的DNA擴(kuò)增樣本進(jìn)行混池后采用多重PCR進(jìn)行分型。加入熒光染料后，在ABI3730核酸檢測(cè)儀上進(jìn)行測(cè)序分析，收集熒光信號(hào)，并對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行總結(jié)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)F4ab和F4ac黏附（Y）以及非黏附（NY）個(gè)體在群體內(nèi)的基因型頻率。對(duì)各SNPs在群體中進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為：自由度df=k-1，即自由度df=3+3-1=5，經(jīng)檢驗(yàn)獲得ITGB-5內(nèi)顯著的SNPs。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1黏附表型檢測(cè)

經(jīng)顯微鏡觀察，得到兩組個(gè)體的體外黏附結(jié)果，如表2所示：

表2　Case-control設(shè)計(jì)所選擇的樣本

2.2測(cè)序結(jié)果

2.2.1ITGB-5基因各外顯子內(nèi)的突變 對(duì)ITGB-5進(jìn)行測(cè)序后結(jié)果如下表所示：

由測(cè)序結(jié)果可以看出，在ITGB-5基因的5號(hào)，6號(hào)，7號(hào)以及11，13，16號(hào)和17號(hào)外顯子內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)一些SNPs，在17號(hào)外顯子內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)SEXA1的酶切位點(diǎn)。

表3　ITGB-5外顯子測(cè)序結(jié)果

2.2.2酶切位點(diǎn) 通過在線的分子生物學(xué)軟件（http：//rna.Lundberg.gu.se/cuttter2/）對(duì)ITGB-5基因外顯子進(jìn)行酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因外顯子5，6，7，11，13，16內(nèi)的突變位點(diǎn)為非酶切位點(diǎn)，而17號(hào)外顯子中存在酶切位點(diǎn)SEXAI。進(jìn)一步分析這些酶切位點(diǎn)和黏附表型間的關(guān)系，檢測(cè)了7個(gè)黏附型個(gè)體和7個(gè)非黏附型個(gè)體，但這些個(gè)體的酶切基因型和黏附表型之間并沒有關(guān)聯(lián)關(guān)系，所以認(rèn)為試驗(yàn)檢測(cè)到的酶切位點(diǎn)并非因果突變。

在第17號(hào)外顯子中存在SEXA1酶切位點(diǎn)，其PCR和酶切結(jié)果如下圖所示，酶切序列（5'…A/ CCWGGT…3'/3'…TGGWCC/A…5'），經(jīng)分析，這個(gè)突變不是影響基因功能的突 變：

圖1　ITGB-5基因17號(hào)外顯子SEXA1酶切位點(diǎn)

2.3ITGB-5外顯子內(nèi)SNPs的卡方檢驗(yàn)結(jié)果

采用卡方檢驗(yàn)的方法對(duì)ITGB-5內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的9個(gè)SNPs進(jìn)行分析，取顯著性閾值X2（5）0.05=11.07，X2（5）0.01= 15.09?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4　對(duì)于ITGB-5內(nèi)各SNPs的卡方檢驗(yàn)結(jié)果

由卡方檢驗(yàn)結(jié)果可知：F4ac檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著，F(xiàn)4ab號(hào)外顯子的2個(gè)SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.05），13號(hào)外顯子的1個(gè)SNP與F4ab黏附表型存在極顯著關(guān)聯(lián)（P＜0.01）。但這些突變與腹瀉之間的關(guān)系，還需要進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證。

3　討論

3.1ITGB-5可能是導(dǎo)致黏附的候選基因

ITGB-5蛋白由α和β兩個(gè)亞基組成，這兩個(gè)亞基在宿主細(xì)胞表面表達(dá)，該蛋白是由整合素所編碼的，玻璃體蛋白Vn可以和整合素的β亞基結(jié)合，而大腸桿菌又可以和Vn結(jié)合，它們共同構(gòu)成復(fù)合體通過小腸上皮細(xì)胞侵入宿主細(xì)胞，形成包涵體的形式。在這個(gè)過程中，整合素發(fā)揮了重要的橋梁作用。

ITGB-5在細(xì)胞內(nèi)具有多重功能，該蛋白屬于跨膜蛋白家族成員，可以和RGD序列相結(jié)合。該序列是整合素蛋白所特有的序列，包含了一系列的氨基酸序列，整合素屬于跨膜受體，可以結(jié)合在RGD氨基酸的多肽當(dāng)中。整合素介導(dǎo)了細(xì)胞分化，遷移，擴(kuò)增，形態(tài)改變以及細(xì)胞死亡過程。與整合素結(jié)合的配體氨基酸包括Arg-Gly-Asp序列，這個(gè)序列可以通過整合素蛋白進(jìn)行識(shí)別，而該蛋白是RGD依賴的蛋白，該整合素蛋白是B3整合素家族的成員。Maki ISHII等檢測(cè)了整合素家族的兩個(gè)成員在小鼠性腺細(xì)胞中的表達(dá)模式，并認(rèn)為它們和該基因中的RGD序列有關(guān)，該研究檢測(cè)了ITGB-5在不同日齡，主要是10.5～13.5天內(nèi)的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在性腺細(xì)胞中廣泛表達(dá)［4］。R.Pasqualini等研究了ITGB-5在不同組織中的表達(dá)模式，也證明了ITGB-5與器官發(fā)育，炎癥，組織修復(fù)以及細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持有關(guān)，黏附過程是通過玻璃體蛋白以及纖維蛋白所介導(dǎo)的［5，6］。上述這些研究都說明了ITGB-5在細(xì)菌侵入細(xì)胞過程中的介導(dǎo)作用，但除此之外，ITGB-5還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列功能。通過對(duì)該基因外顯子序列的測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了9個(gè)SNPs，其中5號(hào)外顯子內(nèi)的2個(gè)SNPs和13號(hào)外顯子內(nèi)的1個(gè)SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)。

ITGB-5和MUC4具有相似的結(jié)構(gòu)、基因大小和功能，并在染色體上處于相近位置［7］。但對(duì)于它們的功能以及黏附表型與腹瀉關(guān)系的研究還停留在基本的統(tǒng)計(jì)分析階段，并不能真正的揭示其與腹瀉的關(guān)系。

圖5　Vn與整合素結(jié)合，侵染宿主細(xì)胞的過程

3.2與腹瀉有關(guān)的其他基因

黏液素家族成員（MUC4，MUC13，MUC20）等是細(xì)胞膜上表達(dá)的蛋白，Jorgensen等2003，2006年所發(fā)表的文章中認(rèn)為MUC4是導(dǎo)致黏附以及腹瀉的重要候選基因，該基因7號(hào)內(nèi)含子中存在一個(gè)XbaI的酶切位點(diǎn)，通過RFLP，在相關(guān)群體中得到驗(yàn)證，并在表型為黏附及非黏附的個(gè)體中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，該關(guān)聯(lián)分析可以得到基本吻合的結(jié)果［8］。該突變被認(rèn)為是一個(gè)可能的分子標(biāo)記并在2004年申請(qǐng)了專利。但MUC4本身屬于一個(gè)多能性基因，在消化道表面表達(dá)，形成黏液，該基因所表達(dá)的蛋白可以形成屏障，防止病原微生物侵入消化道。除此之外，該基因還具有多種功能，并與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，在人類中，該基因的mRNA具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。而黏液素家族的系列基因MUC13，MUC20等都具有類似功能。MUC4位于消化道和呼吸道的內(nèi)表面，一般由消化道和呼吸道內(nèi)表面的腺體所分泌，它可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及維持細(xì)胞的生存。其結(jié)構(gòu)和生化組成可以為細(xì)胞表面提供保護(hù)并且使細(xì)胞處于穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中，不僅如此，MUC4還可以防止細(xì)胞的癌變［9］。

對(duì)于MUC13和MUC20，國內(nèi)黃路生等對(duì)該基因cDNA序列內(nèi)所存在的突變進(jìn)行了測(cè)序研究。并在MUC13 2 679 bp的cDNA序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個(gè)突變（c.576C＞T，c.908C＞G，c.935A＞C）。并且比較了豬和人該基因序列的差異，對(duì)于550 bp的cDNA進(jìn)行了純化以及擴(kuò)增的過程，并通過3'以及5'RACE，獲得該基因的全長(zhǎng)以及基因內(nèi)部的各個(gè)功能元件。并通過UTRSCAN尋找該基因內(nèi)部的SNPs。通過RTPCR，檢測(cè)了該基因在不同組織中的表達(dá)情況，并且在黏附以及非黏附兩組個(gè)體中找到位于外顯子內(nèi)的多態(tài)（SNPs）以及進(jìn)行傳遞不平衡研究（TDT）［10］。

對(duì)于MUC20，該研究小組也對(duì)該基因內(nèi)的多態(tài)進(jìn)行了研究，研究方法與MUC20相似，通過擴(kuò)增得到該基因全長(zhǎng)的mRNA，在ORF處鑒別出兩個(gè)18 bp片段的缺失，該區(qū)段包含一個(gè)1 527 bp的開放閱讀框，并編碼532個(gè)氨基酸。RT-PCR分析表明，該基因在腎臟，前列腺，上皮以及膀胱中的表達(dá)量最高。SNP分析顯示，該基因內(nèi)存在7個(gè)多態(tài)，分別是內(nèi)含子5中g(shù).191C＞T，以及外顯子6中c.1 600C＞T，通過TDT分析可以得到這兩個(gè)多態(tài)與黏附表型之間存在顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系［11］。

4　結(jié)論

上述研究通過對(duì)ITGB-5基因外顯子的測(cè)序和突變分析，在基因的外顯子部分區(qū)段（外顯子5，6，7 和11，13，16和17）檢測(cè)得到突變，其中17號(hào)外顯子350 bp處存在SEXAI酶切位點(diǎn)。通過Snap-shot分型后發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs與F4ab的黏附表型之間具有顯著關(guān)聯(lián)，但這些突變是否是與仔豬腹瀉相關(guān)的因果突變，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。從生物學(xué)功能上分析，ITGB-5很可能是影響?zhàn)じ降暮蜻x基因。本研究為從分子水平研究仔豬腹瀉的機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］徐如海，胡錦平，翁經(jīng)強(qiáng)等.抑制消減雜交篩選仔豬ETEC K88ab/ac受體候選基因［C］.中國動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集.

［2］李玉華.仔豬大腸桿菌F4受體基因的精細(xì)定位.2006博士學(xué)位論文.

［3］J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著.［M］.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社.2003年.

［4］Maki I，T.W.Tay，Masamichi K et.al.Expression parttern of avB3 and avB5 Integrin mrna in mouse fetal gonads.［J］. Journal of Reproduction and development.Vol 52，No 3.2006.

［5］Pasqualini.R，Bodorova J，Ye S et.al.A study of the structure，function and distribution of B5 integrins using novel anti-B5 monoclonal antibodies.［J］.Journal of Cell Science 105，101-111，1993.

［6］Memmo.L.M & McKeown-Longo.P.The alpha v beta 5 integrin functions as an endocytic receptor for vitronecin.［J］.Cell Sci.111，425-433.1998.

［7］Antonio R，Jacoben M.J.，Joller D.et.al.The receptor locus for Escherichia coli F4ab/F4ac in the pig maps distal to the MUC4-LMLN region.［J］.Mammalian Genome.Nov.2010.

［8］Jorgensen C.B.，Cirera S.，Anderson S.I.et.al.Linkage and comparative mapping of the locus controlling susceptibility towards E.coli F4ab/ac Diarrhoea in pigs.［J］.Cytogenetic Genome Research.102：157-162，2003.

［9］Hollingsworth M.A.and Swanson B.J.Mucins in cancer：protection and control of the cell surface.［J］.Nature.Review Cancer.Jan.Vol.4.45-57.2004.

［10］Zhang B，Ren J & Huang H.Investigation of the porcine MUC13 gene：isolation，expression，polymorphisms and strong association with susceptibility to E.coli F4ab/ac.［J］.Animal Genetics.June.Vol 39（3）：258-266，2008. ［11］M.Schroyen，E.Cox and N.Buys.Susceptibility of piglets to ETEC is not related to the expression of MUC13 and MUC20.［J］Animal Genetics.April 4，2011.

（編輯：晏兵兵）

中圖分類號(hào)：S828

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1006-799X（2016）06-0089-04

作者簡(jiǎn)介：牛曉艷（1984-），女，山西太原人，助理研究員，主要從事海貍色獺兔育種工作。