何　婉， 成志強， 黃思銓， 許瑞蓮， 譚文勇， 黃凱斌， 鐘克力， 陳亦欣， 陳明樂， 傅宇翔， 夏利剛**

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院， 深圳市人民醫(yī)院， 廣東 深圳　518020； 2.香港理工大學， 香港； 3.香港中文大學， 香港)

FZD3基因和蛋白在大腸癌中的表達*

何婉1， 成志強1， 黃思銓2， 許瑞蓮1， 譚文勇1， 黃凱斌1， 鐘克力1， 陳亦欣1， 陳明樂3， 傅宇翔1， 夏利剛1**

(1.暨南大學第二臨床醫(yī)學院， 深圳市人民醫(yī)院， 廣東 深圳518020； 2.香港理工大學， 香港； 3.香港中文大學， 香港)

[摘要]目的： 探討WNT信號通路受體FZD3mRNA及蛋白在大腸癌細胞及組織中的表達。方法: 取正常大腸細胞株CCD18-Co、大腸癌細胞株SW480和SW620，以WNT信號通路PCR芯片篩選大腸癌細胞株中差異性表達的基因，并選擇FZD3基因采用Taqman PCR法進行驗證其在大腸癌細胞中的高表達，同時比較FZD3蛋白在大腸癌組織、腺瘤組織及癌旁正常組織的表達。結果: 與大腸正常細胞株CCD18-Co比較，19個基因在大腸癌細胞株SW480和SW620中表達上調(diào)，其中FZD3基因為CCD18-Co的195倍和105倍；驗證結果顯示，與大腸正常細胞株CCD18-CoFZD3比較， FZD3 mRNA在SW480和SW620細胞株中較中升高820倍和622倍，驗證了FZD3 mRNA在大腸癌細胞株中的高表達；免疫組化結果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中表達為100%，大腸腺瘤中的表達為88%，而癌旁正常組織中僅為17.5%，與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中免疫組化分數(shù)高6.6倍(P<0.01) ； FZD3蛋白的高表達與腸癌TNM分期顯著相關(P<0.005) 。結論： FZD3可能在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起到潛在癌基因的作用。

[關鍵詞]FZD3基因；WNT信號通路；大腸；腫瘤；PCR芯片；免疫組織化學；TNM分期

WNT信號通路在大腸癌致瘤過程中通過WNT配體結合Frizzled(FZD)受體，引起核β-catenin的轉錄活動，從而促進腫瘤細胞生長。以上稱為WNT信號通路的經(jīng)典通路[1]。WNT信號通路還包括非經(jīng)典通路及平面細胞極性通路[2]。人類FZD3基因編碼WNT配體的受體，在FZD基因家族的10個成員中，F(xiàn)ZD3定位于8號染色體短臂21位點，高表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域、睪丸、腎臟、子宮、前列腺和骨骼肌，而RT-PCR或northern雜交檢測FZD3在其他正常人類組織低表達[3]。FZD3被認為是多功能的蛋白，它既可在經(jīng)典WNT/β-catenin途徑又可在非經(jīng)典的WNT途徑甚至PI3K-AKT途徑起作用[4]。相對于來自于人外周血中正常B細胞， 定量PCR方法檢測到FZD3 mRNA的表達在慢性淋巴細胞白血病細胞中升高[5]。乳腺癌中，F(xiàn)ZD3基因聯(lián)合其他5種基因(ITGB5，M-RIP，MMP16，RDX和RhoA)是負向預后指標，以特異性siRNA 敲減FZD3基因可降低乳腺癌細胞株MDA-MB-231的侵襲和遷移能力[6]。肝癌細胞中，F(xiàn)ZD3，6,7常常高表達，與活化的FZD依賴的包括經(jīng)典β-catenin 途徑和非經(jīng)典PKC和JNK瀑布的信號通路相關[7]。更顯著的是，大腸癌細胞株中FZD3 mRNA 強烈表達，且在46%的家族性腺瘤性息肉(FAP)和67%散發(fā)性結腸腺瘤中檢測到FZD3 mRNA的表達，表明FZD3在大腸癌的成瘤過程中起到關鍵的作用[8]。然而大腸癌中FZD3基因和蛋白的表達模式尚不清楚，且表達的意義值得進一步探索。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑RPMI-1640、胎牛血清購于美國Gibco公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司、Qiagen試劑盒購自德國Roche公司；TaqMan 逆轉錄試劑、FZD3特異性引物(Hs00907279_m1)、內(nèi)參照GAPDH特異性引物 (Hs99999905_m1)和TaqmanMGB探針購自美國Life technologies公司，人類WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array及逆轉錄試劑盒RT2 First Strand Kit (#C-03)購于德國QIAGEN公司。

1.1.2細胞株人類大腸癌細胞株SW480、SW620和正常大腸細胞株CCD18-Co購買自美國ATCC公司(http://www.atcc.org/)，細胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 ml/L 胎牛血清的RPMI-1640 (#31800-022;Invitrogen Corporation,CA,USA)完全培養(yǎng)液中， 37 ℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后至指數(shù)增長期用于實驗。

1.1.3大腸癌組織從香港伊麗莎白醫(yī)院病理科收集福爾馬林固定、石蠟包埋的40例大腸癌組織及41例大腸腺瘤組織。大腸癌患者中男性25例(62.5%)，女性15例 (37.5%)，中位年齡59歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)的標準：Ⅰ期5例 (12.5%)為，Ⅱ期13例 (32.5%),Ⅲ期14例 (35.0%)及Ⅳ期8例 (20.0%)。研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核，患者簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1大腸癌細胞中人類WNT信號通路中高表達基因的篩選采用人類WNT signaling pathway RT2 ProfilerTMPCR Array篩選，取SW480、SW620及CCD18-Co單層細胞，采用Trizol裂解細胞，提取總RNA，NanoDrop分光光度計測定總RNA的濃度及純度；取2 μg總RNA，根據(jù)逆轉錄試劑盒the RT2 First Strand Kit (#C-03)說明書進行逆轉得到cDNA。25 μL PCR Array反應體系包括 cDNA、2×SABiosciences RT2 qPCR反應混合液和水，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸 1 min，共40個循環(huán)，計算每孔達到閾值的循環(huán)數(shù)(Ct)。采用2-ΔΔCt法分析結果，重復檢測3次。按以下公式計算各轉移相關基因mRNA相對表達量：ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt對照組-ΔCt試驗組，F(xiàn) =2-ΔΔCt。根據(jù)比較結果，選出WNT信號通路中高表達基因為FZD3。

1.2.2驗證大腸癌細胞中FZD3 mRNA表達采用實時定量PCR法，取1.2.1提取的總RNA 2 μg，采用TaqMan 逆轉錄試劑將RNA逆轉錄為cDNA。20 μL PCR反應系統(tǒng)包括20×TaqMan?基因表達預混液1 μL， TaqMan?統(tǒng)一預混液10 μL，水7 μL及cDNA 2 μL。50 ℃擴增2 min，95 ℃預變性 10 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火/延伸1 min,共40個循環(huán)。計算每個孔的達到閾值的循環(huán)數(shù)(Ct)。按1.2.1項下方法進行結果分析。

1.2.3大腸癌組織中FZD3蛋白表達采用免疫組織化學法，大腸癌組織石蠟切片在二甲苯中脫蠟，分別經(jīng)100%、95%和70%乙醇再水化，最后在蒸餾水中洗滌?？乖迯图芭cFZD3抗體(1∶100稀釋)結合的過程在Ventana BenchMark XT 自動染色機上完成，室溫孵育約1 h 32 min，采用媒染二氨基聯(lián)苯沉積物DAB檢測蛋白表達；玻片以蘇木精復染，經(jīng)70%、95%及100%乙醇中脫水，最后加載蓋玻片。不加一抗作為陰性對照。由二位病理醫(yī)師獨立盲評結果并計分，400倍放大倍數(shù)取5個視野進行評估得分。IHC評分=陽性細胞百分比×染色強度[9]。

1.3統(tǒng)計學處理

2結果

2.1大腸癌細胞株中高表達基因的篩選

PCR芯片結果顯示, 與大腸正常細胞株CCD18-Co比較，19個基因在大腸癌細胞株SW480和SW620中表達上調(diào)，其中FZD3基因的表達在SW480和SW620細胞中較在CCD18-Co中為195倍和105倍，見表1。

表1　WNT信號通路芯片中大腸癌細胞株SW480和SW620中的高表達基因

2.2FZD3 mRNA在大腸癌細胞中的高表達驗證

Taqman探針PCR法驗證FZD3 mRNA在大腸癌細胞株中的表達。結果顯示，與大腸正常細胞株CCD18-CoFZD3比較， FZD3 mRNA在SW480和SW620細胞株中較中升高820倍和622倍，驗證了Sybr Green PCR 芯片檢測到的FZD3 mRNA在大腸癌細胞株中的高表達，見圖1。

2.3FZD3蛋白在大腸癌組織中的表達

免疫組化結果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中表達為100%，大腸腺瘤中的表達為88%，而癌旁正常組織中僅為17.5%(圖2)。與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ZD3蛋白在大腸癌組織中免疫組化分數(shù)高6.6倍(P<0.01) ，見圖3。FZD3蛋白的高表達與腸癌TNM分期顯著相關(P<0.005) ，見圖4。

圖1　FZD3 mRNA在大腸癌細胞株中高表達驗證 Fig.1　Validation of FZD3 mRNA over-expression in CRC cell line

A為癌旁正常組織，B為大腸腺瘤組織，C為大腸癌組織圖2　FZD3蛋白在大腸癌及大腸腺瘤組織中的表達Fig.2　Expression of FZD3 protein in colorectal carcinoma and colorectal adenoma

圖3　石蠟組織切片上FZD3染色的IHC評分Fig.3　IHC score of FZD3 staining on paraffin sections

圖4　不同TNM分期大腸癌患者組織中ZD3 蛋白表達IHC評分Fig.4　IHC score of protein expression in the tissues of patients with colorectal cancer in different TNM staging

3討論

經(jīng)典WNT信號通路的激活在大腸癌的發(fā)展中起主導作用。本研究結果顯示包括AXIN1,NKD1,PORCN,WNT10A,WNT3,WNT6,FZD3,FZD5, CTNNB1(β-catenin), CTNNBIP1和TCF7在內(nèi)的11個經(jīng)典WNT信號通路基因在SW40和SW620 中表達增高，其中β-catenin的表達是WNT信號通路生理性或異常激活的標志, 同時WNT信號靶基因MYC在2種大腸癌細胞株中亦表達增高，至少部分因為經(jīng)典WNT/ β-catenin信號通路的過度激活導致[10]。除經(jīng)典途徑外，非經(jīng)典WNT信號通路亦參與了大腸癌的發(fā)展[11]。例如WNT3和WNT6既參與經(jīng)典途徑又參與非經(jīng)典途徑，他們在SW480細胞中的高表達都曾有報道[12]，本研究結果與之相符。大腸癌細胞株SW620和SW480來自同一病人的不同病情階段，前者取自大腸癌Duke’s C的病人1年后廣泛轉移至淋巴結的細胞。SW620細胞中WNT3和WNT6仍然高表達可能提示W(wǎng)NT信號通路仍然異常激活。

FZD3作為WNT信號通路的受體，在Ewing 肉瘤細胞中WNT誘導的神經(jīng)元軸突生長中起主導作用[13]。FZD3在分化差的食管鱗狀細胞癌組織中高表達[14]。本研究采用Taqman PCR方法證實大腸癌細胞株SW480和SW620較正常腸細胞株CCD18-Co高表達FZD3，仔細比較侵襲性高的SW620細胞和侵襲性較低的SW480，F(xiàn)ZD3的表達呈降低趨勢，這個現(xiàn)象曾在卵巢癌中報道，即發(fā)生轉移的卵巢癌中表達的FZD3 mRNA水平較局限的卵巢癌中低[15]。免疫組化的結果顯示，F(xiàn)ZD3蛋白表達水平隨著腫瘤的從腺瘤發(fā)展到大腸癌升高，與此相反，Caldwell等[16]發(fā)現(xiàn)FZD3 mRNA在11/14 (79%)大腸腺瘤中過表達，但僅僅在9/23(39%)大腸癌中過表達。另一項來自Kyoto基因及基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)也顯示，大腸癌相對于大腸腺癌FZD3基因表達下降[16]。對于這種基因和蛋白表達的不一致性可能的解釋是mRNA表達水平可能因為轉錄后、翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)相關[17]。但真正原因還需進一步研究。課題組下一步還將探索同一大腸癌患者組織表達FZD3基因及蛋白的關系及潛在的機制，以期闡明FZD3促進腫瘤進展可能的信號通路。

腫瘤組織FZD3 IHC分數(shù)高于327分的患者主要是Ⅲ和Ⅳ期患者，而分數(shù)≤327主要是Ⅰ和Ⅱ期患者[9]。結合本研究結果，F(xiàn)ZD3蛋白在患者大腸癌組織中隨著臨床TNM分期越晚表達越高，提示FZD3可能作為一項大腸癌有用的預后工具。課題組也將進一步比較FZD3表達和傳統(tǒng)大腸癌生物標志物CEA的表達的關系，并試圖探索FZD3蛋白在外周血的表達，尋找新的輔助預后生物學標志。

總之，F(xiàn)ZD3基因在大腸癌細胞株中高表達，蛋白水平亦在大腸腺瘤和大腸癌中表達升高，并且具有一定的預后價值。

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(2016-03-15收稿，2016-05-29修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 劉華

Expression of FZD3 Gene and Protein in Colorectal Cancer

HE Wan1, CHENG Zhiqiang1, HUANG Siquan2, XU Ruilian1, TAN Wenyong1, HUANG Kaibin1,ZHONG Keli1, CHEN Yixin1, CHAN Mingle3, FU Yuxiang1, XIA Ligang1

(1.TheSecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,ShenzhenPeople'sHospital,Shenzhen518020,Guangdong,China；2.HongKongPolytechnicUniversity,HongKong,China; 3.TheChineseUniversityofHongKong,HongKong,China)

[Abstract]Objective: To explore mRNA and protein expression of FZD3 receptor for WNT signaling pathway in colorectal cancer (CRC) cell lines and tissue and its clinical significance. Methods: Normal colorectal cell line CCD18-Co, colorectal cancer cell line SW480 and colorectal cancer cell line SW620 were selected in this study. The differentially expressed genes in colorectal cancer cell lines and normal colorectal cell line were screened by WNT signaling pathway PCR array, and FZD3 gene was chosen to validate the overexpression in CRC cell lines by using Taqman PCR assay. Meanwhile, FZD3 protein expression profile was also detected and compared between colorectal cancer tissue, adenoma tissue and adjacent normal tissue. Results: Compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, nineteen genes up-regulated their expression in CRC cell lines SW480 and SW620, of which FZD3 gene expression was up-regulated by 195 and 105 folds in SW480 and SW620, respectively. Identification results showed compared with normal colorectal cell line CCD18-Co, FZD3 mRNA up-regulated its expression in SW480 and in SW620 by 820 folds and 622 folds, respectively. Immunohistochemical results showed that the expression of FZD3 protein in colorectal cancer tissue was 100%, the expression in colorectal adenoma was 88%, and the expression in the adjacent normal tissues was only 17.5%. There was a 6.6-fold up-regulation of FZD3 protein expression in CRC tissue compared with in adjacent normal tissue (P<0.01). The high expression of FZD3 protein was significantly correlated with the TNM staging of colorectal cancer (P<0.005). Conclusion: FZD3 may play a role in CRC tumorigenesis and development as a potential oncogene.

[Key words]FZD3 gene; WNT signaling pathway; colon; cancer; PCR array; immunohistochemistry; TNM staging

*[基金項目]深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目(201401013)

[中圖分類號]R735.34

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0681-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.014

**通信作者 E-mail:393322301@qq.com

網(wǎng)絡出版時間：2016-06-16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1632.012.html