馮海潮， 孫朝琴， 何　蕓， 吳　瓊， 張　然， 莫　非， 羅昭遜*

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽　550004； 2.山東聊城人民醫(yī)院， 山東 聊城　252000)

頭花蓼對淋巴細胞分泌干擾素γ和白介素4的影響*

馮海潮1**， 孫朝琴1， 何蕓1， 吳瓊1， 張然2， 莫非1， 羅昭遜1***

(1.貴州醫(yī)科大學， 貴州 貴陽550004； 2.山東聊城人民醫(yī)院， 山東 聊城252000)

[摘要]目的： 研究苗藥頭花蓼對淋巴細胞分泌干擾素γ(IFN-γ)及白介素4(IL-4)的影響。方法： 制備C57BL/6小鼠脾淋巴細胞懸液，同刀豆蛋白A(ConA)及不同濃度的頭花蓼(終濃度分別為：1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 mg/L)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)72 h，細胞活性檢測試劑盒(CCK-8)檢測頭花蓼對體外T淋巴細胞增殖的影響，酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定細胞上清中的IFN-γ和IL-4含量，分析不同濃度的頭花蓼對ConA活化的脾淋巴細胞增殖和分泌IFN-γ、IL-4的影響。結果： 頭花蓼濃度>128 mg/L時，明顯抑制T淋巴細胞的增殖，抑制其分泌IFN-γ的水平，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；頭花蓼濃度為8～128 mg/L 時，ConA活化的脾淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4的水平明顯高于空白對照，而T淋巴細胞的增殖無明顯變化；頭花蓼的濃度低于32 mg/L時，ConA活化的淋巴細胞的IFN-γ分泌水平隨頭花蓼濃度升高而增加。結論： 一定濃度的頭花蓼刺激小鼠脾淋巴細胞增殖、IFN-γ和IL-4分泌，參與機體細胞免疫過程。

[關鍵詞]植物藥； 淋巴細胞； 頭花蓼； 干擾素γ； 白介素4

頭花蓼(polygonumcapitatum)為蓼科蓼屬植物頭花蓼的全草，為貴州精選苗藥。有“清熱利濕，活血解毒之功效”[1]，全草入藥，民間常用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[2]。目前關于頭花蓼的研究多局限于種植技術及成分分析，其藥理活性研究報道少見。已有研究報道，頭花蓼對淋病奈瑟菌、幽門螺桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抗菌活性[3-4]，其有效成分黃酮和沒食子酸具有確切的免疫調節(jié)作用。T細胞參與免疫調節(jié)的重要環(huán)節(jié)，輔助性T淋巴細胞(T helper cell，Th)占T細胞總數的65%，具有識別抗原，分泌多種細胞因子的效應，從多方面引起和增強免疫能力。Th細胞分為Th1細胞和Th2細胞兩個細胞亞群，Th1細胞主要分泌干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α等細胞因子，主要介導宿主細胞免疫應答；Th2細胞主要分泌白細胞介素(interleukin-4，IL-4)、IL-10等細胞因子，介導宿主體液免疫應答。正常狀態(tài)下，Th1和Th2細胞因子相互制約、相互調節(jié)，處于動態(tài)平衡，維持機體正常的細胞和體液免疫功能[5]。本研究應用頭花蓼與脾淋巴細胞在體外進行共培養(yǎng)，觀察不同濃度的頭花蓼作用于脾淋巴細胞后，Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)細胞因子的表達水平，評價頭花蓼的免疫調節(jié)功能。

1材料和方法

1.1材料

頭花蓼浸膏由浙江眾益公司提供，清潔級C57BL/6雄性小鼠體質量(20±5)g[批號SYXK(渝)2007-0001]，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，改良RPMI-1640 培養(yǎng)基(hclone及批號NAF1417)，IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒購自Ausrtian Bender MedsystemsMT公司，刀豆蛋白A(ConA)購自 Sigma公司及批號NO.C8110， CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自日本同仁，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)及酶標儀(BIO-xMAark)。

1.2方法

1.2.1頭花蓼工作液用無菌雙蒸水配制頭花蓼母液，濃度為25.6 g/L，進行一系列倍比稀釋，得到頭花蓼工作液濃度分別為12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 g/L，4 ℃放置備用。

1.2.2脾淋巴細胞懸液頸椎脫臼處死小鼠，無菌取小鼠脾臟。剪碎，置于2張無菌載玻片毛玻璃面之間，研磨，200目無菌篩網過濾，4 ℃離心(1 000 r/min，10 min)。棄上清，加入紅細胞裂解液作用3 min，4 ℃離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，Hank’s液洗滌2次。Hank’s液重懸細胞，小心重疊于等體積的淋巴細胞分離液上，4 ℃離心(2 000 r/min，20 min)，吸出淋巴細胞層，加入預冷的RPMI-1640培養(yǎng)液，4 ℃離心(1 000 r/min，10 min)。棄上清，10%的小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞。臺盼藍染色確定細胞存活率大于95%，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)2 h時，去除貼壁細胞，調整細胞濃度約2×109/L。

1.2.3頭花蓼對脾淋巴細胞的毒性試驗將制備好的脾細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，86 μL/孔，然后添加10 μL ConA(終濃度為5 mg/L)。頭花蓼干擾組再加入上述梯度濃度的頭花蓼工作液4 μL(使頭花蓼的終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L)，空白對照組加入4 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)板置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，加入CCK-8液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定在450 nm波長下吸光度值(OD)。每孔100 μL，設3個復孔，試驗重復3次，取均值。

1.2.4IL-4和IFN-γ的水平將脾淋巴細胞懸液加入96孔培養(yǎng)板，加入ConA，每孔終濃度為5 mg/L，再加入不同濃度的頭花蓼工作液，終濃度分別為(512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L)，空白組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個藥物濃度及對照平行做3孔，每孔100 μL。培養(yǎng)板置37 ℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)72 h。收集上清液，4℃離心(2 000 r/min，10 min)，上清液于-20 ℃保存，待測。嚴格按照酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno rbent assay，ELISA)試劑盒操作說明，通過繪制標準曲線求出IL-4和IFN-γ的濃度。實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1頭花蓼對T淋巴增殖水平的影響

培養(yǎng)72 h時，頭花蓼<128 mg/L時，對小鼠脾臟體外淋巴細胞增殖沒有明顯的影響；≥128 mg/L濃度時，淋巴細胞數量明顯降低，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示頭花蓼濃度低于128 mg/L時，對淋巴細胞沒有毒性，不影響其增殖，見表1。

表1　不同濃度頭花蓼對小鼠脾淋巴細胞增值的影響±s)

(1)與空白對照組比較，P<0.05

2.2頭花蓼對IFN-γ和IL-4的影響

頭花蓼濃度4～128 mg/L時，IFN-γ的分泌水平明顯增高，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在32 mg/L時，IFN-γ的分泌量達到頂峰。頭花蓼濃度≥256 mg/L時，淋巴細胞分泌IFN-γ的水平明顯降低，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學意義，(P<0.05)；頭花蓼的濃度在4～128 mg/L時，IL-4分泌量明顯增高，與空白對照組比較具有統(tǒng)計學差異；濃度大于512 mg/L時，淋巴細胞分泌IL-4的水平低于空白對照組，差異無統(tǒng)計學意義，見表2。提示適宜濃度的頭花蓼對體外培養(yǎng)的小鼠分泌Th1、Th2細胞因子具有一定的刺激作用，對Th1細胞因子的分泌水平呈現(xiàn)出一定的濃度相關性。

表2　頭花蓼對體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞分泌IFN-γ及IL-4的影響(ng/L)

(1)與空白對照組比較，P<0.05

3討論

細胞因子是由活化的免疫細胞和某些基質細胞分泌的具有高活性、多功能的小分子物質，它們涉及免疫和炎癥的每個環(huán)節(jié)，可以調節(jié)和決定免疫應答的性質[5-8]。依據Th分泌產生細胞因子及功能特征的不同，把Th淋巴細胞分為Th1細胞和Th2細胞兩個細胞亞群。Th1細胞主要分泌產生IFN-γ、TNF-α等細胞因子，IFN-γ作為Th1型代表細胞因子，它在初級免疫應答中可提高MHCⅡ類分子的表達和細胞抗原遞呈能力，導致記憶型T細胞水平增高[10]，主要促進細胞免疫；Th2細胞主要分泌產生IL-4、IL-10等細胞因子，對B細胞、T細胞、單核細胞、樹突狀細胞、內皮細胞、纖維細胞等非特異細胞具有多種調節(jié)功能，是體液免疫應答的重要調節(jié)因子[11]。在正常狀態(tài)下，體內Th1和Th2細胞因子相互制約、相互調節(jié)，處于動態(tài)平衡，維持機體正常的細胞和體液免疫功能[12-13]，而IFN-γ、IL-4作為Th1/Th2型免疫相關因子，在一定程度上可反映出機體細胞免疫和體液免疫的基本狀況[14]。

有研究報道幽門螺桿菌感染后可介導異常的細胞免疫導致胃黏膜屏障受損，進一步促進潰瘍形成[15]。本實驗通過觀察不同濃度的頭花蓼對體外脾淋巴分泌Th1/Th2型典型細胞因子的誘生效果，初步了解頭花蓼免疫調節(jié)作用，為后續(xù)關于頭花蓼治療幽門螺桿菌相關性胃炎、消化性潰瘍的免疫調節(jié)機制奠定基礎。結果顯示4～128 mg/L的頭花蓼對ConA活化的淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4均具有明顯的促進作用，這可能與其中的多糖、黃酮、槲皮素等有效成分有關。已有報道多種中藥的多糖成分通過誘生IFN-γ和IL-4增強機體的抗病力[16]，維持機體的細胞免疫和體液免疫；Farhadi L[17]報道類黃酮可促進淋巴細胞增殖，刺激IFN-γ分泌，降低IL-4含量，發(fā)揮其免疫調節(jié)效應。但高劑量的頭花蓼對ConA活化淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-4有不同程度的抑制分泌作用，可能通過抑制淋巴細胞的增殖，進而抑制Th1細胞、Th2細胞分泌相應的細胞因子。此外中藥的成分比較復雜，高劑量時，其中的某些活性成分與中藥的蛋白質和鞣質等成分結合，致使藥液中的一些有效成分凝固變性，一定程度上影響了藥效。所以，采用中藥進行免疫調節(jié)時，需選擇合適的劑量。

本研究結果顯示頭花蓼可刺激IFN-γ和IL-4的分泌作用，但兩者濃度需在一定的范圍內，才能使Th1/Th2免疫調節(jié)處于平衡狀態(tài)，以維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能。觀察系列濃度的頭花蓼刺激脾淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-4效果，不僅顯示了該藥對兩者的分泌的促進作用，還顯示了兩者不同分泌水平下頭花蓼的濃度趨勢，為頭花蓼關于免疫調節(jié)方面的深入研究提供相關濃度依據。而關于頭花蓼在機體內是否能夠刺激IFN-γ和IL-4的分泌，調節(jié)Th1/Th2免疫平衡及其有效的調節(jié)途徑還需通過體內實驗進行觀察驗證，進一步探索其調節(jié)途徑及作用機理。

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(2016-03-03收稿，2016-05-24修回)

中文編輯： 劉平； 英文編輯： 趙毅

Influence ofPolygonumcapitatumon IFN-γand IL-4 Secretion in Spleen Lymphocytes

FENG Haichao1, SUN Chaoqin1, HE Yun1, WU Qiong2, ZHANG Ran2, MO Fei1, LUO Zhaoxun1

(1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China； 2.LiaochengPeople'sHospital,Liaocheng252000,Shangdong,China)

[Abstract]Objective: To investigate the effect of Polygonum capitatum on the secretion of IFN-γ and IL-4 in mice spleen lymphocytes. Methods: A series of concentrations of Polygonum capitatum (final concentrations were 1，2，4，8，16，32，64，128，256，512 mg/L) in splenic lymphocytes of C57BL/6 mice that were activated by ConA for 72 h at the condition of 37 ℃ and 5%CO2。Following Counting Kit-8 was used to detected lymphocytes proliferation and double antibody sandiwich ELISA was used to detect changes，the effect of Polygonum capitatum with different concentration on proliferation and secretion of IFN-γ and IL-4 was analyzed. Results: The T-cell proliferation and IFN-γ secretion was restrained when the concentration of Polygonum capitatum was higher than 128 mg/L. The level of IFN-γ and IL-4 secreted by mice spleen lymphocytes after ConA activation was higher obviously with Polygonum capitatum at the concentration between 8 to128 mg/L，compared with the blank control group (P<0.05). T-cell proliferation had no obvious change.When the concentration of Polygonum capitatum was lower than 32 mg/L,secretion amount of IFN-γ increased as the concentration of Polygonum capitatum become higher. Conclusion: Polygonum capitatum at a certain concentration could participate in cellular immunity that stimulate the mice spleen lymphocytes proliferation, and secretion IFN-γ and IL-4 in vitro .

[Key words]Polygonum capitatum; spleen lymphocytes; interferon-γ; interleukin-4

*[基金項目]貴州省科學技術基金[黔科合(2014)2027號]； 貴州省科技合作計劃基金[黔科合LH(2015)7417號]； 貴州省衛(wèi)生計生委科學技術基金(gzwikj2015-1-003)； 貴陽市科技局計劃項目[筑科合同(2014001)]

[中圖分類號]R931

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)06-0645-04

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.006

**貴州醫(yī)科大學2013級研究生 E-mail:461698511@qq.com

***通信作者 E-mail:418611578@qq.com

網絡出版時間：2016-06-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160617.1035.002.html