劉　瑤， 石　祥， 方　文*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床生化教研室， 貴州 貴陽(yáng)　550004)

人hnRNPA2/B1shRNA慢病毒載體的構(gòu)建*

劉瑤**， 石祥， 方文***

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床生化教研室， 貴州 貴陽(yáng)550004)

[摘要]目的： 構(gòu)建人核內(nèi)不均一核糖核蛋白 A2/B1(hnRNPA2/B1)基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)慢病毒載體。方法: 根據(jù)hnRNPA2/B1基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)hnRNPA2/B1 shRNA的干擾序列和1對(duì)陰性對(duì)照序列(NC-ShRNA)；合成靶序列雙鏈DNA，與pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體連接，通過(guò)測(cè)序鑒定陽(yáng)性克??；用構(gòu)建的慢病毒表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染病毒72 h后細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)，以驗(yàn)證共轉(zhuǎn)染是否成功，超濾法濃縮病毒原液并測(cè)定病毒滴度。結(jié)果: 經(jīng)酶切和BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果比對(duì)，重組克隆中插入的序列與設(shè)計(jì)合成的4對(duì)shRNA及1對(duì)陰性對(duì)照oligo DNA完全一致，提示慢病毒載體構(gòu)建成功；熒光顯微鏡下，HEK 293T細(xì)胞可見(jiàn)強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)，慢病毒載體成功共轉(zhuǎn)染入HEK 293T細(xì)胞，病毒滴度為5×1011TU/L。結(jié)論: 成功構(gòu)建人hnRNPA2/B1基因shRNA 慢病毒載體，病毒滴度達(dá)5×1011TU/L。

[關(guān)鍵詞]RNA干擾； 慢病毒； 293T細(xì)胞； 載體； 短發(fā)夾RNA； 核內(nèi)不均一核糖核蛋白基因

目前，癌癥的治療主要以化療為主，但由于腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)多數(shù)的化療藥物不敏感[1]。本課題組前期采用洛鉑作用于宮頸癌細(xì)胞后，經(jīng)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)不均一核糖核蛋白 A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1, hnRNPA2/B1)表達(dá)下調(diào)[2]。研究發(fā)現(xiàn)hnRNPA2/B1 基因參與了RNA的拼接、前體信使RNA(Pre-mRNA)的成熟和降解，端粒、端粒酶DNA序列的調(diào)節(jié)及細(xì)胞的增值、分化和凋亡等過(guò)程[3]，因此推測(cè)對(duì)hnRNPA2/B1基因的研究可有助于尋找治療腫瘤的新靶點(diǎn)。本研究用含hnRNPA2/B1的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)與pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體連接，構(gòu)建含靶向hnRNPA2/B1 shRNA的重組慢病毒載體，為研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體(含表達(dá)綠色熒光蛋白基因，上海吉滿(mǎn)公司)、大腸桿菌菌株 DH5α(上海吉滿(mǎn)公司)、HEK293T(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))、限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、EcoR I和Taq polymerase

(NEB公司，美國(guó))，Trizol 、Plasmid大抽Kit(QIAGEN公司，美國(guó))，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司，美國(guó))，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1shRNA靶點(diǎn)選擇及引物的設(shè)計(jì)針對(duì)目的基因hnRNPA2/B1序列(GeneID 3181)，利用INVITROGENE公司提供的RNA干擾序列設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，根據(jù)NCBI BLAST 同源性分析，選擇最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的4個(gè)靶點(diǎn)ShNRA，同時(shí)隨機(jī)選擇1個(gè)陰性對(duì)照NC-shRNA(表1)，根據(jù)選擇的基因序列分別設(shè)計(jì)并合成4對(duì)shRNA及1對(duì)陰性對(duì)照寡聚單鏈(oligo)DNA(表2)。

表1　hnRNPA2/B1 基因的4條特異性靶序列

表2　shRNA和NCshRNA序列

1.2.2ShRNA慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建吸取上下游引物10 μL放入PCR管內(nèi)，95 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min、37 ℃ 2 min和25 ℃ 2 min進(jìn)行退火。酶切體系為shRNA 5 μg、10×Buffer 5 μL、BamHI 2 μL和EcoRI 2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。37 ℃酶切30 min后進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，切下包含目的片段的膠條，回收載體。按照3 μL回收載體、Oligo引物1 μL、T4 DNA ligase buffer 1.5 μL和T4 DNA連接酶1 μL，用ddH2O補(bǔ)足體積至15 μL，于25 ℃水浴中孵育30 min，使shRNA載體與引物的連接。把連接產(chǎn)物全部加入感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置20 min，后于42 ℃水浴中熱擊90 s。然后迅速置于冰上放置2～3 min。加入不含抗生素的LB培養(yǎng)基1 000 μL于37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)45 min。3 000 r/min離心2 min，棄掉約850 μL的上清液，將管底的菌液吹打散開(kāi)，加入到含有相應(yīng)抗性的培養(yǎng)皿中，用滅菌的涂布器涂勻，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)。測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.3慢病毒包裝將293T細(xì)胞置于含10% FBS的1640培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%時(shí)細(xì)胞換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1～2 h后轉(zhuǎn)染。取無(wú)菌1.5 mL EP管，加入DMEM培養(yǎng)基1 mL、shRNA 10 μg、 Lenti-HG Mix 10 μL和HG transgene reagent 60 μL，混勻后，室溫放置15～20 min后均勻滴加到提前換過(guò)液的培養(yǎng)皿中共轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染10～12 h時(shí)，均勻滴加100×Enhancing buffer(120 μL/平皿)促進(jìn)轉(zhuǎn)染。共轉(zhuǎn)染18～20 h時(shí)換液，48 h后，吸取細(xì)胞上清液于50 mL離心管，4 ℃，4 500 r/min離心5 min；上清液用0.45 μm濾器過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中，最后將濾液分批轉(zhuǎn)移到濃縮裝置中，4 ℃，4 500 r/min離心10 min，此時(shí)濾器上層的液體即為病毒濃縮液。將病毒濃縮液以50 μL/管進(jìn)行分裝， -80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4病毒滴度的測(cè)定將HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞胰酶消化計(jì)數(shù)，按照8 000細(xì)胞/孔接種96孔板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；細(xì)胞長(zhǎng)至30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用含有10% FBS的細(xì)胞培養(yǎng)液以10為倍數(shù)進(jìn)行病毒梯度稀釋?zhuān)x取所需的細(xì)胞孔，吸去培養(yǎng)基90 μL，取90 μL慢病毒稀釋液加入每孔細(xì)胞中，放入37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后去除含慢病毒的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基100 μL，48 h后在熒光顯微鏡下觀察各孔中表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量，病毒滴度為表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)。

2結(jié)果

2.1pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建的pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體如圖1。圖2B中的泳道4為pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體DNA經(jīng)過(guò)BamHI和EcoRI酶切后，形成線(xiàn)性的DNA分子；而泳道2和3 均為未酶切的質(zhì)粒DNA，可見(jiàn)環(huán)形和超螺旋的質(zhì)粒DNA條帶，泳道1、5為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物(marker)，電泳結(jié)果驗(yàn)證所提取的DNA 為pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體DNA。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)BLAST軟件比對(duì)，重組克隆中插入的序列與設(shè)計(jì)合成的4對(duì)shRNA及1對(duì)陰性對(duì)照oligo DNA完全一致(圖2)，慢病毒載體構(gòu)建成功。

注:A為pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體模式，B為電泳結(jié)果圖1　pGMLV-SC1 RNAi慢病毒載體模式及電泳結(jié)果Fig.1　Map of pGMLV-SC1 RNAi lentiviral vector

圖2　慢病毒干擾載體中oligo DNA測(cè)序Fig.2　Map of Sequence lentiviral interfered vector

2.2慢病毒載體的包裝及滴度測(cè)定

hnRNPA2/B1-shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及NC-shRNA病毒感染HEK 293T細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)強(qiáng)的綠色熒光(圖4)，說(shuō)明慢病毒載體包裝成功，在含有10×10-5個(gè)/L細(xì)胞濃度的慢病毒液孔中觀察到表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)均>50。病毒的滴度為5×1011TU/L。

3討論

RNA干擾(RNA interference, RNAi)是導(dǎo)入一條RNA序列，此序列與目的基因的mRNA序列同源，因此可以將目的基因的mRNA有效的特異降解，使目的基因失去應(yīng)有的功能[4]。目前, RNA干擾的方法最常用的是直接轉(zhuǎn)染 siRNA 和構(gòu)建shRNA 載體。在感染的細(xì)胞中，shRNA 序列能夠被加工成需要的 siRNA，并穩(wěn)定地傳到子代細(xì)胞中發(fā)揮作用[5-6]。RNA干擾技術(shù)現(xiàn)已在腫瘤發(fā)生、發(fā)展轉(zhuǎn)移及腫瘤的耐藥廣泛應(yīng)用[7-8]。有研究表明利用RNA干擾技術(shù)干擾基因的表達(dá)后，會(huì)增加列腺癌細(xì)胞、頭頸部鱗癌、胰腺癌細(xì)胞等對(duì)抗癌藥物的敏感性[9-13]。課題組前期用洛鉑處理宮頸癌Caski細(xì)胞，經(jīng)雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)hnRNPA2/B1表達(dá)下調(diào)[2]。hnRNPA2/B1基因能參與RNA的一系列生理活動(dòng)和對(duì)端粒以及端粒酶的調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞的分化和凋亡也起到一定作用[3]。特別是對(duì)端粒酶的影響非常重要，參與了腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]，hnRNPA2/B1是一種原癌基因，有研究證實(shí)hnRNPA2/B1基因在多種癌癥中均高表達(dá)，干擾hnRNPA2/B1會(huì)增加抗癌藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞的敏感性，hnRNPA2/B1的表達(dá)降低,抑制腫瘤形成[15-16]。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA克隆經(jīng)過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞，懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)[17]。本研究用含hnRNPA2/B1的shRNA與pGMLV-SC5RNAi慢病毒載體連接，構(gòu)建含靶向hnRNPA2/B1 shRNA的重組慢病毒載體，期望為研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究設(shè)計(jì)的4個(gè)靶點(diǎn)ShNRA及1個(gè)陰性對(duì)照oligo DNA經(jīng)過(guò)測(cè)序并經(jīng)BLAST對(duì)比證實(shí)了插入慢病毒中的干擾序列的方向和序列。將構(gòu)建的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，成功并且獲得高濃度的病毒顆粒。

綜上，本研究成功構(gòu)建高濃度的hnRNPA2/B1 shRNA 慢病毒載體，為研究hnRNPA2/B1基因的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

注:A為shRNA1，B為shRNA2，C為shRNA3，D為shRNA4及E為NC-shRNA圖3　慢病毒shRNA感染的HEK 293T細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)Fig.3　Fluorescence photos of the HEK 293T cells infected by shRNA lentiviral

4參考文獻(xiàn)

[1] Shekhar MP. Drug resistance: challenges to effective therapy[J]. Curr Cancer Drug Targets， 2011(5):613-623.

[2] Li XQ，Ran L，F(xiàn)ang W. Lobaplatin arrests cell cycle progression，induces apoptosis and alters the proteome in human cervical cancer cell Line CaSki[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2014(3):291-297.

[3] Zech VF，Dlaska M，Tzankov A，et al. Prognostic and diagnostic relevance of hnRNPA2/B1，hnRNPB1 and S100 A2 in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Detect prev， 2006(30):395-402.

[4] Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J]. Nature， 2001(18) :363-372.

[5] Tijsterman M，Ketting RF，Plasterk RH. The genetics of RNA silencing[J]. Annu Rev Genet， 2002(36):489-519.

[6] Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells [J]．Science， 2002(67): 550-553.

[7] 田瑞敏，鄢佳程，王含彥，等. RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中的研究現(xiàn)狀[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2013(7):811-814.

[8] Perry JK，Emerald BS，Mertani HC，et al. The oncogenic potential of growth hormone[J]. Growth Horm IGF Res， 2006 (5-6):277-289.

[9] Gill C，Dowling C，O'Neill AJ，et al. Effects of cIAP-1，cIAP-2 and XIAP triple knockdown on prostate cancer cell susceptibility to apoptosis，cell survival and proliferation[J]. Mol Cancer， 2009(8):39-47.

[10]Nozawa H，Tadakuma T，Ono T，et al. Small interfering RNA targeting epidermal growth factor receptor enhances chemosensitivity to cisplatin，5-fluorouracil and docetaxel in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Cancer Sci， 2006(10): 1115-1124.

[11]Fujioka S，Son K，Onda S，et al. Desensitization of NFkappaB for overcoming chemoresistance of pancreatic cancer cells to TNF-alpha or paclitaxel[J]. Anticancer Res， 2012 (11):4813-4821.

[12]Arlt A，Muerkoster SS，Schafer H. Targeting apoptosis pathways in pancreatic cancer[J]. Cancer Lett， 2013(2):346-358.

[13]Lee S，Yoon CY，Byun SS，et al. The Role of c-FLIP in Cisplatin Resistance of Human Bladder Cancer Cells[J]. J Urol， 2013(6): 2327-2334.

[14]Sinha P，Poland J，kohl S，et al. Study of the development of chemoresistance in melanoma cell line using proteome analysis[J]. Electrophoresis， 2003(14):2386-2404.

[15]Golan-Gerstl R，Cohen M，Shilo A，et al. Splicing factor hnRNPA2/B1 regulates tumor suppressor gene splicing and is an oncogenic driver in glioblastoma[J]. Cancer Res， 2011(13):4464-4472.

[16]Gu WJ，Liu HL，Liu WH， et al. Induction of pancreatic cancer cell apoptosis，invasion，migration，and enthancement of chemotherapy sensitivity of gemcitabine，5-FU and oxaliplation by hnRNPA2/B1 siRNA [J]. Anti-cancer durgs， 2013(6):566-576.

[17]Sakuma T，Barry MA，Ikeda Y. Lentiviral vectors: Basic to translational[J]. Biochem J， 2012(3):603-618.

(2016-03-28收稿，2016-05-19修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 劉華

Construction and Identification of Lentivirus Vector of shRNA for Human hnRNPA2/B1 Gene

LIU Yao, SHI Xiang, FANG Wen

(DepartmentofClinicalBiochemistry,GuizhouMedcialUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To construct lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/B1 gene. Methods: According to the sequence of hnRNPA2/B1 gene, 4 pairs of interference sequence containing hnRNPA2/B1 shRNA and 1 pairs of interference sequence containing negative control were designed. Targeted double chain DNA was synthesized and connected to the lentivirus vector. Positive clones were identified by sequencing. The constructed vector of slow virus expression vector and packaging plasmids were co-transfected to HEK293T cells. The expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope 72 h after virus transfection in order to verify whether co-transfection was successful or not. Ultrafiltration concentrated virus solution and the virus titer was determined. Results: Comparison of the results of enzyme digestion and blast sequencing showed that the insertion sequence of the recombinant clones was completely consistent with 4 pairs of shRNA and 1 pair negative control DNA oligo, indicating that the Lentivirus vector containing shRNA hnRNPA2/B1 was successfully constructed. Under the fluorescence microscope, the 293T HEK cells showed strong green fluorescent protein expression, indicating that the slow virus vector was successfully co-transfected into 293T HEK cells. The virus titer was 5×1011tu/L. Conclusions: Lentivirus vector of shRNA for human hnRNPA2/B1 gene is successfully constructed, and the virus titer is 5×1011tu/L.

[Key words]RNA interference; lentivirus; 293T cells; vector; Short hairpin RNA; heterogeneous nuclear ribosomal protein gene

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81560481)

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q782

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)06-0630-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.06.003

**貴州醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)碩士研究生

***通信作者 E-mail:281123997@qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-06-16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160616.1648.024.html