李丹王衛(wèi)龍盧連軍張建彬米文娟邱陽陳俊宋勇莉田克勇唐曉旭第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科（西安700）第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科（西安700）第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室（西安700）解放軍后勤學(xué)院門診部五官科（北京00858）

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錳誘導(dǎo)體外培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞的損傷與凋亡研究

李丹1王衛(wèi)龍2盧連軍2張建彬3米文娟1邱陽1陳俊1宋勇莉1田克勇1唐曉旭4
1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科（西安710032）
2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科（西安710032）
3第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室（西安710032）
4解放軍后勤學(xué)院門診部五官科（北京100858）

【摘要】目的探討錳誘導(dǎo)體外培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞損傷與凋亡的關(guān)系。方法將出生3天的新生Sprague Dawley大鼠的耳蝸器官體外培養(yǎng)，將貯存濃度為100mM氯化錳用SFM稀釋到終濃度為1mM，3mM，5mM后進(jìn)行體外染毒處理耳蝸基底膜。應(yīng)用鬼筆環(huán)肽染色特異性顯示耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛，同時用β-Tubulin對神經(jīng)纖維進(jìn)行染色，用TUNEL試劑盒；Cleaved caspase-3抗體對耳蝸基底膜進(jìn)行染色，在激光共聚焦顯微鏡下分別觀察耳蝸基底膜的毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維。結(jié)果耳蝸基底膜培養(yǎng)24小時，1mM氯化錳對耳蝸毛細(xì)胞及神經(jīng)纖維損傷甚微，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），內(nèi)，外毛細(xì)胞排列整齊規(guī)律，聽神經(jīng)纖維分布均勻，成束排列。最高濃度5mM氯化錳處理24小時后對神經(jīng)纖維造成明顯的損害，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)濃度逐漸增加，損傷愈加顯著并呈濃度依賴性。2mM氯化錳處理，對耳蝸基底膜底轉(zhuǎn)損傷較中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)明顯。不同濃度氯化錳處理24小時TUNEL染色陽性細(xì)胞隨著氯化錳濃度的增加而增多；Cleaved caspase-3染色陽性細(xì)胞亦隨著氯化錳濃度的增加而增多。結(jié)論通過大鼠耳蝸器官體外培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)氯化錳會造成毛細(xì)胞缺失，神經(jīng)纖維變細(xì)變少，而這種損傷的機(jī)制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】錳；毛細(xì)胞；神經(jīng)纖維；耳蝸；凋亡

Fund Project:Natural Science Foundation of China（81172635）

Conflict of interest The authors declare that there are no conflicts of interest.

錳是人體必需的微量元素之一，涉及人體多種生化功能和代謝過程。但長期攝入過量錳可引起錳中毒，臨床上出現(xiàn)椎體外束損傷表現(xiàn)，如手指震顫，肌張力增高，腱反射亢進(jìn)等癥狀，其表現(xiàn)與帕金森綜合癥類似。流行病學(xué)調(diào)查研究表明長期接觸錳塵的礦工其聽力下降可能與錳中毒有關(guān)，動物實驗結(jié)果提示慢性錳中毒后錳可在內(nèi)耳聚集，通過損傷耳蝸毛細(xì)胞，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞引起大鼠聽力下降，進(jìn)而提供了錳中毒對耳蝸器官影響的直接證據(jù)，其發(fā)生機(jī)制仍有待于進(jìn)一步探究［1］。本研究組通過大鼠慢性錳中毒的動物模型，研究錳對聽力的影響，發(fā)現(xiàn)錳在大鼠體內(nèi)具有耳毒性，慢性錳中毒通過損傷耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞引起大鼠聽力下降［2］。本文通過對新生3天SD大鼠的耳蝸器官體外培養(yǎng)并在培養(yǎng)基中加入不同濃度氯化錳，觀察錳對離體培養(yǎng)耳蝸毛細(xì)胞（HC）、周圍神經(jīng)纖維（ANF）的損害作用，利用TUNEL染色以及免疫熒光染色方法探究損傷與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為進(jìn)一步探討錳誘導(dǎo)毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維凋亡的分子機(jī)制做好基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗動物

選用出生3天（P3）發(fā)育正常的Sprague-Dwaley （SD）新生大鼠，由第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供。

1.2大鼠耳蝸器官培養(yǎng)

預(yù)先制備膠原凝膠（Collagen Gel）。A：0.02醋酸和（50X）Collagen gel溶液（Corning-354249）。B：10X Basal Medium Eagle溶液（sigma）。C：2％碳酸鈉（Sodium Carbonate）溶液。A:B:C=9：1:1比例配成。在直徑35mm培養(yǎng)皿中滴入15μl新鮮配置的膠原凝膠液，放置30分鐘后加入1ml按如下方法配置的無血清培養(yǎng)液（Serum-free medium，SFM）。

1.3SFM培養(yǎng)液制備

牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin）2g（sigmaA-4919）；Serum-free Supplement 2ml（sigmaI-1884）；20％葡萄糖4.8ml（sigmaG-7021）；青霉素G 0.2g（sigmaP-3414）；200mmol/L谷氨酰胺2ml；碳酸氫鈉0.2g；1X BME190.8ml（sigmaB-1522）。

1.4氯化錳處理

氯化錳的存儲濃度為100mmol/L，分別用SFM稀釋成1mmol/L，3mmol/L，5mmol/L。

1.5TUNEL染色

將1mM Mn處理后培養(yǎng)24小時帶膠滴的基底膜用0.1mol/L PBS液漂洗2遍后，4％多聚甲醛固定20分鐘，轉(zhuǎn)入96孔板中，加入含1％tritonX-100的0.1mol/L PBS打孔15分鐘，用TUNEL凋亡檢測試劑盒（Roche），分別向96孔板中，加入TUNEL反應(yīng)液50μL，將96孔板移入溫度恒定在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱孵育60分鐘，0.1mol/L PBS液漂洗3遍，加入用0.1mol/L PBS液稀釋的FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）（1:100）與DAPI（1:500）共染。

1.6Cleaved caspase-3染色

帶膠滴的基底膜用0.1mol/L PBS液漂洗2遍后，4％多聚甲醛固定20分鐘，轉(zhuǎn)入96孔板中，加入含1％tritonX-100的PBS打孔15分鐘，用Cleaved caspase-3抗體（CST）1:200作為一抗，分別向96孔板中加入50μl，將96孔板移入4℃冰箱72小時，0.1mol/L PBS液漂洗3遍，加入免疫熒光二抗1:200（Life technology）50μl，4℃冰箱過夜，0.1mol/L PBS液漂洗3遍，加入用0.1mol/L PBS液稀釋的（1:100）FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）與（1:500）DAPI共染。

1.7免疫熒光染色

取SD新生大鼠耳蝸，分為4組，第一組：正常對照組，第二組：1mmol/L氯化錳處理組，第三組：3 mmol/L氯化錳處理組及第四組：5 mmol/L氯化錳處理組。用75％酒精噴灑消毒動物的頭頸部，斷頭后剪開頂骨，去除腦組織暴露顱底，在Hanker's培養(yǎng)液中（Solarbio）用尖鑷挑開內(nèi)聽道骨壁以暴露耳蝸底回的基底膜，用游絲鑷沿蝸殼分離去除耳蝸螺旋韌帶，保留全耳蝸基底膜及螺旋神經(jīng)節(jié)，然后將耳蝸器官移入新鮮配制的膠原凝膠并鋪放平整。將培養(yǎng)皿移入溫度恒定在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4小時后向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的氯化錳無血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時終止培養(yǎng)［3］。帶有樣本的膠滴經(jīng)4％多聚甲醛固定，用0.1mol/L PBS液漂洗。1％triton×100室溫20分鐘，用0.1mol/L PBS液漂洗3遍后，5％的驢血清（博士德）室溫封閉1h，用0.1mol/L PBS液漂洗3遍后，加入用0.1mol/L PBS液稀釋的β-Tubulin （1：100 Millipore）50μL，于4℃冰箱中孵育72小時，漂洗后加入0.1mol/L PBS液稀釋的β-Tubulin二抗驢抗鼠（1:200，Life technology）4℃冰箱中過夜，漂洗后加入用0.1mol/L PBS液稀釋的（1:100）FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）與（1:500）DAPI共染。室溫避光30分鐘，漂洗后把帶有樣本的膠滴移入載玻片上的甘油滴上，鋪放平整并蓋上蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照（Olympus FV1000），參照有關(guān)文獻(xiàn)用Adobe Photoshop CS6處理圖像并于24h選取3組基底膜中轉(zhuǎn)分別計算單位長度（100μm）的毛細(xì)胞計數(shù)，測量單位長度（200μm）的神經(jīng)纖維數(shù)目。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗數(shù)據(jù)的處理和計算采用SPSS16.0 （SPSS公司，美國）軟件完成，實驗結(jié)果均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組3個平行重復(fù)（n=3），每種實驗重復(fù)3次，各組間是否存在差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1正常培養(yǎng)情況下耳蝸器官

培養(yǎng)24小時外毛細(xì)胞，內(nèi)毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維以及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)（圖1）。FITC偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記耳蝸毛細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下，耳蝸毛細(xì)胞呈綠色熒光，毛細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)和表面結(jié)構(gòu)正常，3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)良好，輪廓清楚。神經(jīng)纖維，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及神經(jīng)終末被β-tubilin標(biāo)記，神經(jīng)纖維呈紅色熒光，聚集成束，粗細(xì)均勻，排列有序，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的外圍神經(jīng)纖維向外輻射到內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞，并在內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞上形成神經(jīng)終末。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及突起呈紅色熒光，細(xì)胞基本呈橢圓形，胞漿被深染，而胞核淡染，著色均勻，有細(xì)長突起［3，4］。

2.2染毒培養(yǎng)24小時后耳蝸毛細(xì)胞以及神經(jīng)纖維

將P3天的大鼠耳蝸器官在含有不同濃度氯化錳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，耳蝸毛細(xì)胞和聽神經(jīng)纖維在1mmol/L氯化錳培養(yǎng)條件下3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞仍可保持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量，神經(jīng)纖維聚集成束，排列輕度紊亂，但數(shù)量仍保持正常，但當(dāng)氯化錳的濃度達(dá)到5mmol/L，出現(xiàn)3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞明顯缺失，排列紊亂，細(xì)胞數(shù)明顯減少，聽神經(jīng)纖維數(shù)量明顯減少，神經(jīng)纖維成束排列消失，出現(xiàn)單根神經(jīng)纖維絲，與內(nèi)毛細(xì)胞底部的交聯(lián)明顯減少（圖2）。2mmol/L氯化錳體外培養(yǎng)24小時，耳蝸基底膜底轉(zhuǎn)內(nèi)外毛細(xì)胞明顯缺失，3排外毛細(xì)胞及1排內(nèi)毛細(xì)胞排列紊亂，中轉(zhuǎn)內(nèi)外毛細(xì)胞缺失數(shù)目較底轉(zhuǎn)數(shù)目減少，細(xì)胞排列較底轉(zhuǎn)整齊，頂轉(zhuǎn)內(nèi)外毛細(xì)胞缺失數(shù)目較底轉(zhuǎn)明顯減少，細(xì)胞排列較底轉(zhuǎn)整齊，可見，氯化錳對體外耳蝸器官培養(yǎng)基底膜的底轉(zhuǎn)損傷最重（圖3）。24小時含有不同濃度氯化錳的培養(yǎng)基中取耳蝸基底膜中轉(zhuǎn)進(jìn)行毛細(xì)胞計數(shù)，1mM氯化錳毛細(xì)胞計數(shù)與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3mM和5mM氯化錳毛細(xì)胞計數(shù)組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。24小時含有不同濃度氯化錳的培養(yǎng)基中進(jìn)行神經(jīng)纖維計數(shù)，1mM氯化錳神經(jīng)纖維計數(shù)組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；3mM和5mM氯化錳神經(jīng)纖維計數(shù)組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。2mM氯化錳培養(yǎng)24h，取耳蝸基底膜頂轉(zhuǎn)，中轉(zhuǎn)，底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，頂轉(zhuǎn)，中轉(zhuǎn)，底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞與對照組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；中轉(zhuǎn)，底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞與對照組之間差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（One-way ANOVA；P＜0.01）。（圖5）

圖1　毛細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時，激發(fā)光570nm，神經(jīng)纖維和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈紅色熒光，激發(fā)光495nm，毛細(xì)胞的纖毛和表面結(jié)構(gòu)呈綠色熒光，神經(jīng)纖維排列有序，粗細(xì)均勻，從毛細(xì)胞胞體的底部一直延續(xù)到螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞處。激光共聚焦顯微鏡×200。Fig.1 Photomicrograph of control organotypic culture from the middle of the cochlea after 24h without Mn treatment（0mM Mn）.HaircellslabeledwithAlexaFluor488-phalloidin.Nervefiberslabeledwithantibodyagainstβ-tubilinandAlexaFluor594conjugated secondary antibody.Three rows of OHC and the single row of IHCweremarkedwithgreenfluorescence；SomaofSGNsandbundlesofANFweremarkedwithredfluorescence；AbundleofANF radiatingoutfromtheSGNtowardsthehaircells.Scalebar:100μm.

圖2　應(yīng)用不同濃度氯化錳對培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞和聽神經(jīng)纖維的破壞作用。圖A顯示0mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時的耳蝸的毛細(xì)胞（綠色）和聽神經(jīng)纖維（紅色）；圖B、C、D分別顯示1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時后耳蝸結(jié)構(gòu)；可見應(yīng)用1mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞排列仍可保持整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，聽神經(jīng)纖維粗細(xì)分布仍均勻，但當(dāng)氯化錳的濃度增加到5mmol/L時，毛細(xì)胞和聽神經(jīng)纖維遭到嚴(yán)重破壞。Fig.2 Photomicrographs show cochlear organotypic cultures from the middle of the cochlea after 24h treatment with Mn.Hair cells labeled with FITC-phalloidin.Nerve fibers labeled with antibody against β-tubulin and Alexa Fluor 594 conjugated secondary antibody.Mn concentration is shown in each panel.Bracket shows three rows of OHC；arrowhead marks the single row of IHC，green arrow points to a bundle of ANF radiating out towards the hair cells.Scale bar in 20 μm.

圖3　2mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時的耳蝸基底膜頂轉(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞損傷作用?？梢姡c對照組比較，2mmol/L氯化錳處理對耳蝸基底膜底轉(zhuǎn)損傷最為嚴(yán)重，毛細(xì)胞數(shù)目明顯減少，3排外毛細(xì)胞及1排內(nèi)毛細(xì)胞排列紊亂，表皮板缺失。Fig.3 Photomicrographs show cochlear organotypic cultures from the apex to basal of the cochlea after 24h treatment with Mn.Hair cells labeled with FITC-phalloidin.The image show that the basal of the cochlear basement membrane was most seriously damaged.Scale bar in 20 μm.

圖4　不同濃度氯化錳對培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞和聽神經(jīng)纖維損傷作用的統(tǒng)計分析。體外培養(yǎng)耳蝸基底膜毛細(xì)胞（個╱100μm）體外培養(yǎng)耳蝸基底膜神經(jīng)纖維（個╱200μm），3mmol/L和5mmol/L氯化錳毛細(xì)胞及神經(jīng)纖維計數(shù)組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.01）。Fig.4 Manganese caused HC/100μm（A）and ANF/200μm（B）reduction in cochlear basement membrane.In vitro cochlear basement membrane were exposed in 1mM，3mM and 5mM Mn for 24h.（A）HCs were analyzed and quantified.（B）The ANFs were examined using confocal laser scanning microscopy and quantified.The data are representative of 3 independent experiments.The values are the means±SEM；* P＜0.01 vs.the control group.Asterisks show Mn conditions that were significantly different （P＜0.01）fromuntreatedcontrolcultures（0mM）.

圖5　2mmol/L氯化錳對培養(yǎng)24小時的耳蝸基底膜頂、中、底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞統(tǒng)計分析。體外培養(yǎng)耳蝸基底膜毛細(xì)胞（個╱100μm）頂轉(zhuǎn)毛細(xì)胞與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）；中、底轉(zhuǎn)毛細(xì)胞與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（**P＜0.05）Fig.5 The 2mM doses of Manganese caused HC/100μm reduction from the apex to the basal of cochlear basement membrane after 24h treatment.HCs were analyzed and quantified using confocal laser scanning microscopy.The data are representative of 3 independent experiments.The values are the means± SEM；* P＜0.05 vs.the control group；** P＜0.01 vs.the control group.Single Asterisks show Mn conditions that were significantly different（P＜0.05）from untreated control cultures （0mM）；Double Asterisks show Mn conditions that were significantly different（P＜0.01）from untreated control cultures（0mM）.

2.3毛細(xì)胞TUNEL染色結(jié)果

目前，對錳誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維的毒性作用與哪一種細(xì)胞凋亡通路有關(guān)仍不明確，為探究錳的耳毒性作用是否與凋亡相關(guān)，對培養(yǎng)24小時不同濃度氯化錳處理組用凋亡檢測試劑盒（Roche）進(jìn)行TUNEL染色（圖6），對照組3排外毛細(xì)胞和1排內(nèi)毛細(xì)胞用FITC鬼筆環(huán)肽標(biāo)記呈綠色熒光，凋亡染色為紅色熒光，毛細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)良好，輪廓清楚。未見凋亡染色陽性毛細(xì)胞。當(dāng)1mM氯化錳處理后，毛細(xì)胞排列尚整齊，輪廓尚清楚，可見少許凋亡染色陽性細(xì)胞，但當(dāng)氯化錳濃度達(dá)到5mM時，F(xiàn)ITC鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的毛細(xì)胞3排外毛細(xì)胞嚴(yán)重缺失，內(nèi)毛細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)大量的凋亡染色陽性細(xì)胞，并對耳蝸中轉(zhuǎn)毛細(xì)胞及凋亡陽性細(xì)胞以200μm為計數(shù)單位進(jìn)行計數(shù)（圖7），（n=3），1mM氯化錳處理組凋亡陽性細(xì)胞與對照組相比無顯著性差異（One-way ANOVA；P＜0.05），而3mM，5mM氯化錳處理組凋亡陽性細(xì)胞與對照組相比有顯著性差異（One-way ANOVA；P＜0.01）

圖6　用不同濃度氯化錳處理耳蝸基底膜，體外培養(yǎng)24小時后，取3組耳蝸基底膜，在毛細(xì)胞范圍內(nèi)，進(jìn)行單位長度（200μm）TUNEL計數(shù)（圖5），結(jié)果顯示對照組以及1mM氯化錳處理組未見TUNEL染色陽性細(xì)胞，3mM以及5mM氯化錳處理后，出現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞，并且隨著氯化錳處理濃度的升高TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多。Fig.6 Representative confocal images showing hair cells from upper middle turn of the cochlea labeled for TUNEL（red）and FITC-phalloidin（green）after 24h in culture.Images shown for controlsandaftertreatmentwith1-5mMMn.Scalebarin20μm.

圖7　體外培養(yǎng)24小時不同濃度氯化錳處理耳蝸基底膜進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計分析。TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)（個╱200μm）；3mmol/L和5mmol/L氯化錳處理組TUNEL染色陽性細(xì)胞計數(shù)與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Fig.7 Manganese caused cochlear basement membrane of haircells apoptosis in vitro.Cochlear basement membrane of hair cells were exposed to 1mM，3mM and 5mM for 24h.The number of TUNEL positive cells（個╱200μm）were examined using confocal laser scanning microscopy and quantified.The data are representative of 3 independent experiments.The results are expressed as a percentage of control，which was set at 100％.The values are the means±SEM；* P＜0.01 vs.the control group.Mean percentages of TUNEL positive cell in cochlear organotypic cultures；The graph show 3mM，5mM Mn treatment that was significantly different（p＜0.01）from control cultures.

2.4毛細(xì)胞Cleaved Caspase-3染色結(jié)果

Cleaved Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物，不同濃度氯化錳處理，基底膜體外培養(yǎng)24小時后，對照組Cleaved Caspase-3染色未檢測到陽性細(xì)胞，1mM氯化錳毛細(xì)胞排列仍可保持整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，出現(xiàn)Cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞，但當(dāng)氯化錳濃度達(dá)到5mmol/L時，毛細(xì)胞損傷嚴(yán)重，Cleaved Caspase-3陽性細(xì)胞明顯增多（圖8）。

圖8　應(yīng)用不同濃度氯化錳對培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞Cleaved caspase-3染色。0mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時的耳蝸的毛細(xì)胞（綠色）和Cleaved caspase-3染色（紅色）；如圖顯示1mmol/L氯化錳培養(yǎng)24小時的耳蝸毛細(xì)胞排列仍可保持整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，Cleaved caspase-3染色陽性細(xì)胞增多，但當(dāng)氯化錳的濃度增加到5mmol/L時，毛細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞，Cleaved caspase-3染色陽性細(xì)胞明顯增多。Fig.8 Representative confocal images showing HC from upper middle turn of the cochlea.Specimens labeled with Cleaved caspase-3（red）and FITC-phalloidin（green）after 24h in culture.Images shown for controls and after treatment with 1-5 mM Mn.Scale bar in 20μm.

3　討論

過量接觸錳對人體造成最顯著的損害即椎體外系損傷，表現(xiàn)為肌肉震顫，肌張力增高，腱反射亢進(jìn)等類似帕金森綜合征癥狀，目前研究已表明，其發(fā)病機(jī)制與多巴胺合成減少和乙酰膽堿遞質(zhì)系統(tǒng)的興奮性增強(qiáng)有關(guān)，并因此導(dǎo)致一系列的精神-神經(jīng)癥狀［3，6］。

近年來，醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中有越來越多的證據(jù)表明，長期接觸錳塵的工人中，會出現(xiàn)或引發(fā)聽力下降，或錳塵會使噪音誘發(fā)的聽力下降加劇［6，7］。國外醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中，錳對耳蝸聽覺細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的毒性作用已有研究，但國內(nèi)在此方面的研究仍未見報道。如上所述，本文通過對新生3天SD大鼠的耳蝸器官體外培養(yǎng)實驗，觀察錳對毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維的損傷作用。初步證實了錳可誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞，神經(jīng)纖維凋亡。這種細(xì)胞的凋亡形態(tài)學(xué)特征，與細(xì)胞水樣變性和破裂出現(xiàn)的細(xì)胞壞死恰好相反［8］。紋狀體神經(jīng)元原代培養(yǎng)研究表明錳的毒性與細(xì)胞凋亡的特性有關(guān)，如線粒體功能障礙、自由基形成、DNA斷裂［9，10］。錳引發(fā)的ROS會激活多個程序性細(xì)胞死亡的信號通路，包括TUNEL染色增強(qiáng)、核苷體間DNA裂解、JNK激活、P38（應(yīng)激活化蛋白激酶）、半胱氨酸蛋白酶活化、PARP半胱氨酸蛋白酶依賴性裂解［11，12］。

基底膜體外培養(yǎng)24小時，1mmol/L的錳對耳蝸毛細(xì)胞及神經(jīng)纖維損傷甚微，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。內(nèi)，外毛細(xì)胞排列整齊規(guī)律，聽神經(jīng)纖維分布均勻，成束排列。以此得知在24小時1mmol/L錳濃度仍不足以引起耳蝸聽覺細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷，TUNEL染色肯定了這一實驗結(jié)果。當(dāng)濃度逐漸增加，損傷愈加顯著，與毛細(xì)胞形成交聯(lián)的末梢神經(jīng)纖維對錳的毒性亦較敏感。損傷的嚴(yán)重程度與錳的劑量成正相關(guān)。最高劑量為5mmol/L的錳處理24小時后對末梢神經(jīng)纖維造成明顯的損害。耳蝸器官體外培養(yǎng)24小時2mmol/L氯化錳處理對耳蝸基底膜底轉(zhuǎn)損傷程度較中轉(zhuǎn)，頂轉(zhuǎn)嚴(yán)重；由此可見，氯化錳對聽力損傷是以高頻聽力損失為重。

一般而言，細(xì)胞死亡方式可以分為細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死，二者在細(xì)胞體積上差別非常明顯，細(xì)胞凋亡往往表現(xiàn)為細(xì)胞固縮變小，而壞死則表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹增大，常規(guī)內(nèi)耳病理學(xué)檢查中，如果只是進(jìn)行常規(guī)染色而沒有檢測凋亡和壞死的專門鑒別指標(biāo)，是很難區(qū)分細(xì)胞死亡的方式。本文通過對細(xì)胞凋亡的特異性染色，TUNEL染色能對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征和生化特征［13］。為了進(jìn)一步探究細(xì)胞凋亡的上游機(jī)制，本研究進(jìn)行了Cleaved Caspase-3染色，Caspase家族介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程，在凋亡早期階段，Caspase-3被激活，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但在細(xì)胞凋亡晚期和死亡細(xì)胞，Caspase-3的活性明顯下降［14］。

最近文獻(xiàn)報道了新霉素敏感期（p8-p14）的小鼠，在注射了新霉素之后，凋亡因子Casp3，Casp9，Diablo，Htra2的表達(dá)水平明顯高于對照組，說明了凋亡因子參與了新霉素引起的耳毒性過程［14］，而過表達(dá)凋亡抑制因子XIAP可以完全保護(hù)新霉素引起的耳蝸基底膜頂轉(zhuǎn)的毛細(xì)胞缺失，但是XIAP不能保護(hù)新霉素引起的耳蝸基底膜中轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)的毛細(xì)胞缺失，其中可能的原因是中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)的毛細(xì)胞死亡不是由于經(jīng)典的凋亡途徑所介導(dǎo)的，可能是由于壞死造成的，或者就是在轉(zhuǎn)基因鼠中廣泛表達(dá)的人XIAP不足以保護(hù)耳蝸基底膜中轉(zhuǎn)或者底轉(zhuǎn)高濃度新霉素所導(dǎo)致的毛細(xì)胞缺失［15］?？傊甔IAP過表達(dá)可以保護(hù)敏感期新霉素所導(dǎo)致基底膜頂轉(zhuǎn)毛細(xì)胞的缺失，并證實了一些凋亡因子參與了這一過程，所以XIAP可能成為新霉素導(dǎo)致的毛細(xì)胞缺失和聽力喪失的治療靶標(biāo)［14，15］。

在本實驗中，3mM以及5mM氯化錳處理后，耳蝸基底膜出現(xiàn)TUNEL染色陽性細(xì)胞核，并且隨著氯化錳處理濃度的升高TUNEL染色陽性細(xì)胞數(shù)增多，后續(xù)的實驗需更進(jìn)一步探討氯化錳引起的毛細(xì)胞凋亡機(jī)制以及驗證XIAP能否保護(hù)氯化錳導(dǎo)致的毛細(xì)胞缺失，來探究錳誘發(fā)內(nèi)耳細(xì)胞死亡的機(jī)理。因此，錳有可能與鉛，鎘，汞同樣列為與聽力下降或耳蝸病理相關(guān)的重金屬［16，17，18］。

哺乳動物的耳蝸由高度分化的穩(wěn)定細(xì)胞群體所組成，通常不具有分裂增殖能力，所以耳蝸器官培養(yǎng)相對其他組織培養(yǎng)有更高的要求和難度。

本研究采用大鼠耳蝸器官體外培養(yǎng)技術(shù)，為進(jìn)一步研究耳蝸損害機(jī)制以及預(yù)防，治療措施研究模型的建立提供了實驗依據(jù)和基礎(chǔ)，在大鼠耳蝸器官體外培養(yǎng)過程中，本研究的總結(jié)經(jīng)驗如下：一、基底膜剝離在富含營養(yǎng)的透明Hank's液中。二、鼠尾膠凝固的速度受溫度影響，根據(jù)膠滴凝固時的顏色變化來確定加入培養(yǎng)基的時間。三、盡可能小心的將前庭膜鋪在基底膜內(nèi)側(cè)，有利于樣本中毛細(xì)胞的免疫組化染色以及共聚焦顯微鏡觀察。四、將樣本移到膠滴表面時，游絲鑷夾持基底膜hook區(qū)，逐步將其以螺旋前進(jìn)的方式移到膠滴表面并鋪放平整，避免毛細(xì)胞面卷曲或者折疊。五、加入培養(yǎng)基的量和膠滴的大小和形狀有關(guān)，培養(yǎng)基太多，則基底膜不容易被粘住，培養(yǎng)基過少，則基底膜暴露在空氣中，容易死亡。

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Manganese-induced Damage and Apoptosis of Cochlear organotypic cultures

LI Dan1，WANG Weilong2，LU Lianjun2，ZHANG Jianbin3，MI Wenjuan1，QIU Yang1，CHEN Jun1，SONG Yongli1，TIAN Keyong1，TANG Xiaoxu4
1 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Xijing Hospital，F(xiàn)ourth Military University，Shannxi，710032，China
2 Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military University，Shannxi，710032，China
3 Department of Occupational&Environment Health，School of Pubic Health，F(xiàn)ourth Military Medical University，shannxi，710032，China
4 Outpatient Department，Logistics Academy，Beijing100858，P.R.China
Corresponding author:LU LianjunEmail:lulianj@fmmu.edu.cn

【Abstract】To study relations between manganese toxicity the damage and apoptosis of cochlear hair cells.Methods Cochlear organotypic cultures were prepared using postnatal day 3 Sprague-Dawley rats.Mn chloride stock solution was prepared at a stock concentration of 100 mM in serum-free medium and diluted to final concentrations of 1，3 and 5 mM.Cochlear basilar membrane explants were incubated in the presence of the prepared Mn chloride solution.Stereocilia bundles of hair cells were immunolabeled with FITC phalloidin while nerve fibers were labeled with an antibody against the β-tubulin so that hair cells and nerve fibers in the cochlear basilar membrane were respectively observed under a fluorescent micro-scope.TUNEL kit and Cleaved caspase-3 antibody were used to label apoptosis of basilar membrane cells.Results Cochlear organotypic cultures treated for 24 h with 1mM Mn showed no obvious damage to the hair cells and auditory nerve fibers in the cochlear basilar membrane compared to the control group（P＞0.05）.Mn treatment at5 mM for 24 h caused noticeable damage to nerve fibers compared to the control（P＜0.05）.Damage by Mn treatment at 2 mM was more obvious in the basal turn than in the middle and apical turns.At 24 h of Mn treatment，the number of TUNEL（as well as cleaved caspase-3）labeling cells increased along with increasing Mn concentrations.Conclusion In this in vitro organotypic culture of rat cochlea，Mn can cause missing of hair cells and reduced number and size of nerve fibers，which may be related to the mechanisms of cellular apoptosis.

【Key words】Mn，hair cells，nerve fibers，cochlea，apoptosis

【中圖分類號】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）02-265-7

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.02.028

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81172635）

作者簡介：李丹，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：耳聾的基礎(chǔ)與臨床

通訊作者：盧連軍，Email:lulianj@fmmu.edu.cn

收稿日期：（2015-12-03審核人：郭維維）