王鑫毅 韓艷楠 金 珊 王 麗 趙青松 陳寅兒（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

研究簡報

烏鱧產(chǎn)吲哚金黃桿菌的鑒定及其胞外產(chǎn)物特性分析

王鑫毅 韓艷楠 金 珊 王 麗 趙青松 陳寅兒
（寧波大學海洋學院，寧波 315211）

烏鱧（Channa argus）俗稱烏魚、黑魚、火頭等，因其骨刺少，肉味鮮美，且具有去瘀生薪、生肌補血、滋補調養(yǎng)等多種生理功能，一直廣受國內外消費者的親睞。近十多年來，為順應國內外貿(mào)易市場的需要，我國人工養(yǎng)殖烏鱧迅速發(fā)展。但由于高密度養(yǎng)殖、種質退化、環(huán)境惡化及人為因素干擾等多種原因，使得養(yǎng)殖烏鱧病害日趨增多，新的病原也不斷出現(xiàn)。2013年5—6月，在浙江寧波部分烏鱧養(yǎng)殖池塘出現(xiàn)了批量死亡事件，病魚主要癥狀為體表鱗片大面積脫落，有的爛眼、爛鰓、腹部膨脹、皮膚變黃并伴有少量體表出血現(xiàn)象； 解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟顏色變黃，有淡色斑點，組織糊化，偶有腹水。作者對典型癥狀的病魚進行了取樣、病原分離和初步鑒定，認為引起本次烏鱧疾病的病原為金黃桿菌屬（Chryseobacterium sp.）細菌。據(jù)資料顯示［1—3］，金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）是一類革蘭氏陰性菌，其廣泛存在于土壤、水、植物等自然環(huán)境及醫(yī)院環(huán)境，為條件致病菌，是人感染性疾病的重要病原，也可引起畜禽［4］和魚類［5］、蛙類［6—9］、中華鱉［10］、河蟹［11］等多種水產(chǎn)動物嚴重疾病。目前國內外關于金黃桿菌病的研究資料很少，已有的報道大多是針對病癥的描述、醫(yī)院臨床感染分布及耐藥性分析等。為了盡快明確烏鱧金黃桿菌病的病原及致病機理，作者采用常規(guī)生理生化試驗結合16S rRNA序列分析等方法對所分離的病原菌進行了鑒定，并對病原菌的胞外產(chǎn)物成分及致病性進行了研究，以期為魚類金黃桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源

病魚取自浙江寧波某烏鱧養(yǎng)殖池塘，共3批次，每次至少解剖3尾病魚，體重350—500 g； 健康魚購自寧波水產(chǎn)市場，體重350—400 g，外觀檢查并經(jīng)抽樣解剖檢驗確認無病。

1.2 病原菌的分離培養(yǎng)

取發(fā)病癥狀典型的烏鱧，無菌解剖取病魚血液、肝、腎等組織分別劃線接種于TSA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)48h后，挑取形態(tài)特征一致的5株優(yōu)勢菌進行純培養(yǎng)，轉接斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)觀察及生理生化試驗

取1.2純培養(yǎng)的細菌轉接TSA斜面，經(jīng)28℃培養(yǎng)20h，用生理鹽水制成約108cell/mL的菌懸液后作革蘭氏染色及電鏡（日立H-7650）觀察。電鏡樣品采用醋酸鈾染色10s。生理生化試驗參考伯杰氏細菌鑒定手冊（第九版）［12］和趙乃盺等資料［1，2］進行。

1.4 16S rRNA基因擴增及其序列分析

以分離菌基因組DNA為模板，用細菌通用引物27f和1492r進行16S rRNA序列的PCR 擴增［13］。PCR反應條件為:94℃預變性3min； 94℃變性30s，55℃復性1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)； 最后72℃溫育6min。PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收，連接到pMD18-T載體上，作TA克隆，轉化至大腸桿菌DH5α，由上海英俊生物技術有限公司完成測序。

將所測的菌株的16S rRNA基因序列上傳至Genbank數(shù)據(jù)庫，并通過數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行序列相似性比較，選取與所測序列同源性高的已知菌株，采用ClustalX軟件進行多序列比對（Multiple Alignments），利用MEGA5.05軟件，采用鄰位相連（Neighbor-joining method）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉分析（Bootstrap）進行置信度檢測，自舉數(shù)集1000次。

1.5 人工感染試驗

根據(jù)1.3和1.4實驗結果，所分離的5株菌相似度在99%以上，應為同一種菌，因此，人工感染實驗僅采用WL20130525菌株進行。實驗在120 cm×80 cm×50 cm的塑料桶中進行，每桶放養(yǎng)體重350—400 g的健康烏鱧10尾，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)2d后進行感染試驗。WL20130525菌株培養(yǎng)24h后，用無菌生理鹽水制成濃度約2.68×108、2.68×107、2.68×106、2.68×105、2.68×104cfu/mL的菌懸液，細菌量根據(jù)M cF濁度管結合活菌計數(shù)方法確定。感染組共10組，每個菌濃度肌肉注射20尾，每尾注射0.3 mL，對照組10尾注射同量無菌生理鹽水。用SPSS軟件計算細菌半致死濃度［14］。

1.6 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的制備及活性測定

細菌胞外產(chǎn)物的制備采用玻璃紙?zhí)崛》ǎ?5］，考馬斯亮藍法測定胞外產(chǎn)物蛋白濃度。胞外產(chǎn)物活性采用杯碟法測定［16］，在TSA培養(yǎng)基上進行。溶血試驗血瓊脂平板分別采用脫纖維綿羊血、脫纖維兔血、烏鱧血、鯽魚血，pH 7.5。

1.7 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的致病性試驗

試驗設5個實驗組和1個對照組，分別在120 cm× 80 cm×50 cm的塑料桶中進行。每桶放養(yǎng)體重350—400 g健康烏鱧10尾，連續(xù)充氣，暫養(yǎng)2d后進行試驗。取1.6中制備的胞外產(chǎn)物，用PBS稀釋成70、104、156、235、352 μg/mL系列濃度，每個濃度肌肉注射 10尾，每尾注射0.3 mL，對照組注射等量無菌PBS。胞外產(chǎn)物的注射量根據(jù)預實驗確定。用改良寇氏法計算胞外產(chǎn)物半致死濃度［17］。

1.8 WL20130525菌的藥敏試驗

以涂布法接種0.1 mL WL20130525菌于TSA平板上，貼上藥敏紙片，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，測抑菌圈直徑。所用藥敏紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司。

2 結果

本實驗從患病烏鱧體內共分離5株病原菌，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化試驗及16S rRNA基因序列分析，所分離的5株菌相似度在99%以上，應為同一種菌，因此，本實驗結果僅針對WL20130525菌株。

2.1 病原菌的致病性

采用從患病烏鱧中分離到的病原菌WL20130525感染健康烏鱧，感染初期烏鱧躁動不安，狂游，有躍出水面的現(xiàn)象； 隨著感染時間的延長，魚活力明顯下降，精神萎頓，感染第2天魚開始出現(xiàn)死亡，體表注射部位明顯紅腫，感染3d后注射部位出現(xiàn)一塊圓形病灶，該處鱗片向外張開，松動易脫落，鱗下體表充血腫脹； 隨著病情加重，魚鱗大片脫落，皮膚或成黃色，注射部位潰爛； 解剖發(fā)現(xiàn)腹腔內組織松軟糜爛，肝腎略有腫大，腸組織黏連。5個感染菌濃度168h的死亡率分別為100%、90%、75%、40%、10%，WL20130525菌對烏 鱧的LD50為4.63×105cfu/mL。感染魚癥狀與自然發(fā)病魚相似，從感染發(fā)病魚體內的血液、肝、腎等組織中又可以分離到與WL20130525菌株形態(tài)特征完全一致的菌株，說明WL20130525菌株確為烏鱧的致病菌。

2.2 WL20130525菌株形態(tài)及生理生化特征

革蘭氏染色和電鏡觀察顯示，WL20130525菌株為革蘭氏陰性桿菌，菌體兩端鈍圓，大小約為（0.3—0.5）μm×（1.0—2.3）μm，大多單個散在，無鞭毛，不能運動，無莢膜和芽孢（圖 1）在TSA平板上培養(yǎng)24h，菌落為黃色，圓形，直徑約1—2 mm，表面隆起、光滑，邊緣整齊且有光澤。生理生化特征見表 1，經(jīng)查閱相關資料［1，2，13］，可知WL20130525菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacteriumindologenes）。

表 1 WL20130525菌的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of WL20130525

2.3 16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用引物27F和1492R擴增菌株的16S rRNA基因，共包括1549個堿基。在GenBank中的注冊號為JX515610。將測定的16S rRNA基因序列與GenBank中的參考序列進行比對，找出相關序列，利用生物學聚類軟件MEGA5.05進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建（圖 2）。從N-J法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出菌株WL20130525屬于金黃桿菌（Chryseobacterium）家族，與該菌序列最接近的兩個菌株產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）和黏金黃桿菌（C.gleum），其相似度分別為98.3%和97.8%。綜合2.2和2.3結果，作者認為WL20130525菌株應為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）。

2.4 WL20130525菌胞外產(chǎn)物的活性和致病性

采用玻璃紙?zhí)崛》ㄖ苽鋀L20130525菌胞外產(chǎn)物，考馬斯亮藍法測得蛋白濃度為704 μg/mL。以杯碟法測定WL20130525菌胞外產(chǎn)物的酶活性，結果顯示，用50 μL的胞外產(chǎn)物提取液所產(chǎn)生的各酶透明圈直徑分別為卵磷脂酶31 mm，蛋白酶20 mm，淀粉酶13 mm，脂肪酶8 mm，說明酶活性卵磷脂酶>蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。WL20130525菌胞外產(chǎn)物對烏鱧血呈完全（β）溶血，對綿羊血和鯽魚血部分溶血，對兔血不溶血。注射WL20130525胞外產(chǎn)物后，烏鱧發(fā)病癥狀與感染菌病魚癥狀相似，5個實驗組168h的死亡率分別為100%、60%、40%、20%、0，胞外產(chǎn)物對烏鱧的LD50為158.49 μg/kg體質量，說明WL20130525胞外產(chǎn)物具有較強毒性。

2.5 WL20130525菌藥敏試驗結果

從表 2可知，WL20130525菌對米諾環(huán)素、利福平、恩諾沙星、頭孢西丁、強力霉素、依諾沙星、諾氟沙星等7種藥物較敏感，對鏈霉素等10種藥物耐藥。

3 討論

本實驗從患病烏鱧（C.argus）體內分離到菌株WL20130525，經(jīng)人工感染試驗證實，WL20130525可使烏鱧的生活狀態(tài)、體表和肝腎等主要組織器官出現(xiàn)明顯的病癥，且在人工感染患病魚的體內又可分離到與WL20130525完全一致的菌株，說明WL20130525具有強致病性。通過對WL20130525的16S rRNA基因分析，發(fā)現(xiàn)它與產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）的親緣性最接近，且相似度為98.3%； 形態(tài)學觀察及生理生化特征試驗進一步確定WL20130525菌株為產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）。

圖 2 菌株WL20130525及其相關菌株16S rRNA基因鄰位連接法系統(tǒng)發(fā)育樹

表 2 WL20130525菌的藥敏試驗結果Tab.2 Drug sensitive test results of WL20130525

1994年Vandamme等根據(jù)菌體形態(tài)和生理生化特性提出將黃桿菌屬（Flavobacterium）中的部分菌統(tǒng)一劃歸新建立的金黃桿菌屬（Chryseobacterium）［18］，主要有大比目魚金黃桿菌（C.balustinum）、黏金黃桿菌（C.gleum）、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）、腦膜膿毒性金黃桿菌（C.meningosepticum）、吲哚金黃桿菌（C.indoltheticum）、大菱鲆金黃桿菌（C.scophthalmum）等6個種，這一歸屬和命名得到了普遍認可。后來趙乃盺等根據(jù)Vandamme的分類及金黃桿菌屬的特征，在原有6個種的基礎上增加了污水金黃桿菌（C.defluvii）、臺灣金黃桿菌（C.formosense）、宙斯特氏金黃桿菌（C.joostei）、C.daecheongense、C.Miricola等共11個種［1］。

自1992年首次發(fā)現(xiàn)豹蛙產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）感染性疾病，其后西班牙、日本、中國等多個國家和地區(qū)陸續(xù)有報道產(chǎn)吲哚金黃桿菌引起人類疾?。?9，20］。據(jù)資料顯示，產(chǎn)吲哚金黃桿菌是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，可引起人肺炎、敗血癥、膿毒血癥、局部組織傷口感染等嚴重疾病，由于其耐藥范圍廣、臨床癥狀與體征復雜，因此死亡率高，近幾年已引起國內外醫(yī)學界的廣泛重視［3，19］。目前關于產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）感染動物的報道不多，已有的資料大多也是針對病癥的描述，如Olson等［2 1］報道了該菌引起豹蛙敗血癥，Callon等［22］報道了該菌感染奶羊，祖國掌等［11］報道該菌可引起河蟹疾病，Kampfer等［23，24］報道了該菌可引起大西洋鮭魚疾病，Ilardi［25］等報道了該菌感染了大馬哈魚。而至今還未見國內有關產(chǎn)吲哚金黃桿菌對養(yǎng)殖魚類感染致病的報道。由于產(chǎn)吲哚金黃桿菌（C.indologenes）是人和動物的共患病原，它不僅對人類健康嚴重危害，而且對養(yǎng)殖動物也產(chǎn)生潛在威脅，因此，值得進一步的關注和深入研究。

目前關于產(chǎn)吲哚金黃桿菌致病機理的研究很少，已有的研究顯示可能與其胞外蛋白有關［18］。本實驗結果也顯示，WL20130525菌胞外產(chǎn)物具有強致病性，而其胞外產(chǎn)物中蛋白酶活性較強。此外，已有的研究也表明，產(chǎn)吲哚金黃桿菌具有多重耐藥性，其耐藥機制復雜，除細菌外膜通透性屏障外，還存在多種超廣譜β-內酰胺酶及金屬β-內酰胺酶，可導致碳青霉烯類、頭孢菌素類、氨基糖甙類等抗生素廣泛耐藥［3，26］。本實驗結果顯示，WL20130525菌對米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、強力霉素、恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等7種化學療劑高度敏感，但由于農(nóng)業(yè)部第2292號公告已把恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等列入禁用漁藥，2016年12月31日起禁止使用，因此可考慮把米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、強力霉素等4種作為治療烏鱧金黃桿菌病的首選藥物。由于產(chǎn)吲哚金黃桿菌廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環(huán)境中，為條件致病菌，且化學藥物大量的使用不僅會滋生大量的耐藥菌株，而且污染環(huán)境，甚至危害人類食品安全，因此，該病的控制一定要以防為主，特別是在初夏和初秋季節(jié)是該病的高發(fā)期。

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IDENTIFICATION AND ANALYSIS ON EXTRACELLULAR PRODUCTS CHARACTERISTICS OF CHRYSEOBACTERIUM INDOLOGENES ISOLATION FROM CHANNA ARGUS

WANG Xin-Yi，HAN Yan-Nan，JIN Shan，WANG Li，ZHAO Qing-Song and CHEN Yin-Er
（School of Marine Sciences in Ningbo University，Ningbo 315211，China）

關鍵詞：烏鱧； 產(chǎn)吲哚金黃桿菌； 生理生化鑒定； 16S rRNA； 胞外產(chǎn)物； 抗菌藥物

Key words:Channa argus； Chryseobacterium indologenes； Physiological and biochemical identification；16S rRNA； Extracellular products； Antimicrobial agents

doi:10.7541/2016.86

收稿日期：2015-09-15；

修訂日期：2015-12-16

基金項目：海洋公益性行業(yè)專項經(jīng)費資助項目（201105007）； 寧波大學水產(chǎn)浙江省重中之重一級學科開放基金（xkzsc1503）資助［Supported by the Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean（No.201105007）； Ningbo University Aquaculture in Zhejiang Province Priority Level 1 Subject Open Fund（No.xkzsc1503）］

作者簡介：王鑫毅（1995—），男，浙江嘉興人； 本科； 研究方向為水產(chǎn)動物病害防控。E-mail:578405056@qq.com

通信作者：金珊（1964—），教授； E-mail:jinshan@nbu.edu.cn

中圖分類號：S941.42

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3207（2016）03-0641-06