● 太原市標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量質(zhì)檢院 王勇

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黃曲霉毒素M1單克隆抗體的制備及其免疫學(xué)特性研究

● 太原市標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量質(zhì)檢院 王勇

摘 要:本研究通過琥珀酰亞胺法利用經(jīng)典雜交瘤技術(shù)建立抗AFM1單克隆抗體（mAb）雜交瘤細(xì)胞株。高特異性的黃曲霉毒素M1mAb的制備，為利用其建立敏感、快速和標(biāo)準(zhǔn)化的ELISA檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素M1單克隆抗體 制備免疫學(xué)

黃曲霉毒素是由黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉A.parasiticus產(chǎn)生的一種具有很強(qiáng)致癌性、致畸性和致突變的次級代謝產(chǎn)物，屬于小分子化合物。黃曲霉毒素在發(fā)霉的糧油制品中廣泛存在，嚴(yán)重影響人類食品安全。1993年世界衛(wèi)生組織（WHO）就將黃曲霉毒素列為I類致癌物。黃曲霉毒素種類主要有B1，B2，G1，G2及M1和M2。不同類型的黃曲霉素在結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性。而黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是機(jī)體攝入黃曲霉毒素B1后的羥基化代謝產(chǎn)物，多存在于蛋、乳、肝中。其中乳和乳制品中最為常見，且乳制品制備過程中的常規(guī)操作如巴氏消毒都難以破壞AFM1。因此，建立敏感、快速、精確和簡單的AFM1檢測方法，是目前監(jiān)控牛奶和乳制品中AFM1污染水平的迫切要求。本研究就是在合成AFM1完全抗原AFM1-KLH和包被抗原AFM1-OVA的基礎(chǔ)上，利用雜交瘤技術(shù)制備了高特異性的AFM1mAb，為建立快速、敏感的國產(chǎn)化AFM1ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1.材料

黃曲霉毒素M1、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）、黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2）、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1）和黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2）標(biāo)準(zhǔn)品，均購自美國Sigma公司；牛血清白蛋白（KLH）和卵清蛋白（OVA）、山羊抗小鼠IgG-HRP購自GeneTex公司、AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自生工生物工程(上海)股份有限公司；健康雌性BALB/c小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；福氏免疫佐劑、抗體亞類鑒定試劑盒購自Sigma公司；PEG1500購自Roche公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；鄰苯二胺（OPD）和NBT/BCIP 顯色劑購自Amresco公司。其他常規(guī)試劑全部為國產(chǎn)分析純。

2. 方法

（1）黃曲霉毒素半抗原、完全抗原合成

將 AFM1和氨氧基乙酸半鹽酸鹽( CMO) 按照質(zhì)量比1∶2溶于 吡啶甲醇水的混合液中 ( 吡啶∶甲醇∶雙蒸水=1∶4∶1)，溫度控制在120℃回流。利用薄層色譜掃描法監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。待反應(yīng)完全后，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶劑，加入 2mL ddw溶解，用H2SO4調(diào)節(jié)pH至4，乙酸乙酯萃取多次后合并有機(jī)相，再次旋干即為黃曲霉毒素M1肟。

黃曲霉毒素M1肟利用EDC法分別與KLH和OVA反應(yīng)，得到完全抗原AFM1-KLH和篩選抗原AFM1-OVA。

（2）動物免疫

選擇6周齡雌性BALB/c小鼠，取AFM1-KLH免疫小鼠。初次免疫用AFM1-KLH與等體積福氏完全免疫佐劑乳化后，于小鼠腹腔注射免疫，每只小鼠注射500μL，免疫劑量為30 μg。免疫前尾部靜脈取血作為陰性對照。2周后利用福氏不完全免疫佐劑腹腔注射二次免疫一針。2周后，按照二次免疫方式再次腹腔注射免疫。2周后，采微量尾血進(jìn)行間接非競爭ELISA檢測。當(dāng)血清滴度達(dá)到要求后，融合前3 d加倍劑量腹腔注射沖擊免疫。融合前，小鼠摘除眼球取血，并分離血清作為陽性對照。

（3）細(xì)胞融合

解剖取免疫小鼠脾細(xì)胞懸液和生長狀態(tài)良好的Sp2/0 細(xì)胞（HGPRT缺陷型小鼠骨髓瘤細(xì)胞株Sp2/0購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心）在PEG1500作用下進(jìn)行融合。利用HT篩選培養(yǎng)基，將融合后細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，100μL/孔，37 ℃、80 mL/L CO2培養(yǎng)1 d。10 d后改用含HT篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，14 d后換用DMEM普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。

（4）雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆

采用間接ELISA法篩選分泌抗AFM1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。用包被液碳酸鹽緩沖液（0.5 M Na2CO3/ NaHCO3， pH 9.6）包被AFM1-OVA（1 μg/mL，100 μL/孔）于96孔酶標(biāo)板中，以1∶3000的免疫小鼠血清為陽性對照，1∶3000的正常BALB/c小鼠為陰性對照，1∶5000稀釋的山羊抗小鼠IgG-HRP為二抗，以鄰苯二胺（OPD）溶液為反應(yīng)底物，490 nm處酶標(biāo)儀測定各孔A值，以P/N≥2.1時(shí)判定為陽性。采用有限稀釋法對連續(xù)3次檢測為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆。

（5）抗體亞型鑒定

篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)T75型瓶擴(kuò)大培養(yǎng)后，利用未添加胎牛血清的DMEM/F12在培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3 d后收集細(xì)胞上清，按照抗體亞類鑒定試劑盒操作說明進(jìn)行亞類鑒定。

（6）mAb腹水制備及純化

利用動物體內(nèi)腹水誘生方法制備單克隆抗體。選取15周齡經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠，液體石蠟致敏1周，將篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后，以1～5×106個(gè)/mL的接種密度接種雜交瘤細(xì)胞株至小鼠腹腔；12 d左右收集腹水，4℃下3 000 rpm離心15 min，收獲上清。間接非競爭ELISA法測定腹水效價(jià)。收獲的腹水上清，采用Protein A 親和層析方法純化腹水，純化的樣品利用SDS-PAGE分析純度。

（7）抗體親和力和交叉反應(yīng)性檢測

按照文獻(xiàn)報(bào)道的間接非競爭抑制性ELISA檢測親和力?？贵w的交叉反應(yīng)性采用間接競爭抑制性ELISA法進(jìn)行測定，參試樣品分別為黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素M2。

結(jié)果

1. 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

選擇免疫后小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，融合率達(dá)98%。融合后10 d左右，取細(xì)胞上清采用間接ELISA法進(jìn)行篩選。經(jīng)初篩、復(fù)測，3次亞克隆培養(yǎng)后，最終篩選獲得1株能穩(wěn)定分泌抗AFM1mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為mAb-AFM1，凍存、保種。

2. IgG亞類鑒定

按照試劑盒說明操作，經(jīng)夾心ELISA方法亞類鑒定為IgG1亞型。

3. 腹水制備及效價(jià)測定

利用體內(nèi)誘生法制備腹水。將雜交瘤細(xì)胞接種于經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔，12 d左右收集腹水。間接ELISA法測定腹水效價(jià)為1∶5×105。腹水經(jīng)Protein A親和層析純化后，得到純度較高的mAb-AFM1（見圖1）。

圖1　SDS-PAGE分析mAb- AFM1腹水純化樣

4.抗體親和力和交叉反應(yīng)性檢測

抗體的親和力常數(shù)是抗體親和常數(shù)為1.6×10-10 mol/L mol/L?？贵w與黃曲霉毒素B1的交叉反應(yīng)率是9.7%，與黃曲霉毒素G1的交叉反應(yīng)率是1.4%，與黃曲霉毒素B2的交叉反應(yīng)率是2.0%，與黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2和牛血清白蛋白的交叉反應(yīng)率均＜1%。

討論

黃曲霉毒素M1是目前奶和奶制品的重要檢測項(xiàng)目，關(guān)系著奶和奶制品的質(zhì)量安全。如何快速、簡便地檢測黃曲霉毒素M1是控制和監(jiān)測黃曲霉毒素M1的前提。當(dāng)前的文獻(xiàn)調(diào)研顯示，利用抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體或多克隆抗體，建立酶聯(lián)免疫吸附檢測方法是其主要研究方法。ELISA方法由于靈敏性高，檢測快捷，操作簡便，非常適合實(shí)際在食品檢測中的快速鑒定。而制備高質(zhì)量、高特異性的抗體是建立ELISA方法的關(guān)鍵。較多克隆抗體而言，單克隆抗體特異性更強(qiáng)，均一性更好，而且可以穩(wěn)定生產(chǎn)質(zhì)量一致的抗體。目前我國黃曲霉毒素免疫測定試劑盒還主要依賴于進(jìn)口，國內(nèi)雖有較多的關(guān)于黃曲霉毒素的抗體制備及ELISA方法建立的研究，但還僅僅存在于實(shí)驗(yàn)階段，而且存在特異性不強(qiáng)的問題。在實(shí)際應(yīng)用中，常常會和其他蛋白和黃曲霉毒素種類產(chǎn)生交叉反應(yīng)，出現(xiàn)假陽性。

在本研究中，我們首先制備了具有良好免疫原性的完全抗原AFM1-KLH，同時(shí)在篩選過程中采用AFM1-OVA作為包被抗原，大大降低了假陽性率，提高了篩選效率。經(jīng)經(jīng)典雜交瘤技術(shù)制備抗體后，所獲抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體對黃曲霉毒素M1具有很高的靈敏度和特異性。下一步我們將以此抗體為基礎(chǔ)，建立可用于檢測乳與乳制品中AFM1污染水平的免疫學(xué)檢測方法。以期替代國外進(jìn)口試劑，成為研制奶和奶制品中黃曲霉毒素M1的主流檢測試劑基礎(chǔ)。