黃海潮，巫瑋，張小紅，聶陽，劉經(jīng)亮，周捷

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布南色林對(duì)H2O2引起的PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用研究

黃海潮1，巫瑋1，張小紅1，聶陽1，劉經(jīng)亮1，周捷2

摘要：目的探討布南色林對(duì)H2O2引起的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加入終濃度為分別為0、5、10、20、40、80及160μmol·L-1的布南色林，觀察不同濃度布南色林對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響。另取細(xì)胞，分為空白細(xì)胞對(duì)照（C）組，H2O2處理（H）組，布南色林- H2O2處理（B）組,陽性對(duì)照（維生素E- H2O2處理，E）組）。MTT法檢測各組細(xì)胞的活性變化。用TUNEL法檢測各組細(xì)胞凋亡情況；倒置顯微鏡直接觀察法以及Hoechst33258染色法觀察氧化損傷細(xì)胞的形態(tài)變化；生化法測定各組細(xì)胞的超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量的改變。結(jié)果合適濃度的布南色林（0～20μmol·L-1）能促進(jìn)PC12細(xì)胞的生長。與C組比較，H組的細(xì)胞活性下降，凋亡指數(shù)增加（P＜0.05）；細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞損傷明顯；細(xì)胞內(nèi)的SOD活性減低，MDA水平增高（P＜0.05）。與H組比較，B組的細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡指數(shù)下降（P＜0.05）；細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)；細(xì)胞內(nèi)的SOD活性增強(qiáng)，MDA含量降低（P＜0.05）。結(jié)論布南色林對(duì)H2O2引起的神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：創(chuàng)傷,神經(jīng)系統(tǒng)；細(xì)胞凋亡；PC12細(xì)胞；神經(jīng)保護(hù)；布南色林；超氧化物歧化酶；丙二醛

作者單位：1廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院（郵編510520）；2中山大學(xué)腫瘤防治中心藥學(xué)部

抗精神分裂癥新藥布南色林（Blonanserin）為高度選擇性的5-羥色胺Ⅱ（5-HT2）受體和多巴胺Ⅱ（D2）受體拮抗藥，能有效治療精神分裂癥陰性和陽性癥狀，還能有效改善患者的認(rèn)知功能，不良反應(yīng)較少[1-2]。研究顯示，精神分裂癥早期常伴有大量灰質(zhì)的丟失[3]。神經(jīng)解剖和影像學(xué)表明精神分裂癥伴有腦室的擴(kuò)大[4]、大腦顳葉體積的縮小[5]以及神經(jīng)元數(shù)量的明顯減少[6]。有研究證實(shí)，細(xì)胞凋亡可能參與了精神分裂癥的病理過程[7-8]。利培酮、奧氮平等非典型抗精神病藥對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞的氧化損傷有保護(hù)作用[9-10]。本研究旨在探討布南色林對(duì)H2O2引起的PC12細(xì)胞損傷是否有保護(hù)作用，以期為臨床用藥提供參考。

1　資料與方法

1.1一般資料PC12細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞研究所；布南色林購自上海瀚香生物科技有限公司（純度＞98%）。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、96孔板（corning公司）；DMEM培養(yǎng)基、馬血清（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；Triton-X-100、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司）；pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（PBS，杭州吉諾公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將PC12細(xì)胞接種于含有5%FBS和5%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、飽和濕度、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液1次，取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3不同濃度布南色林對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響取實(shí)驗(yàn)待用細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以4 000個(gè)/孔接種于96孔板，每孔加入終濃度分別為0、5、10、20、40、80及160μmol·L-1的布南色林。并設(shè)空白調(diào)零孔（只加DMEM培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L MTT 10 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的光密度（OD）值。

1.4 PC12細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡情況分析（1）細(xì)胞活性檢測。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分空白細(xì)胞對(duì)照（C）組；200μmol·L-1H2O2處理（H）組；實(shí)驗(yàn)（B）組，預(yù)先加入合適濃度布南色林處理12 h，再加入200μmol·L-1H2O2處理12 h；陽性對(duì)照維生素E-H2O2處理（E）組，預(yù)先加入濃度為200μmol·L-1維生素E處理12 h，再加入200μmol·L-1H2O2處理12 h。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加入5 g/L MTT 10μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 100μL，用酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm波長下的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞活性，細(xì)胞活性（%）=OD藥物組/OD空白細(xì)胞組×100%。（2）細(xì)胞凋亡情況分析。實(shí)驗(yàn)分組如（1）。按4×104個(gè)/mL密度接種于6孔板，經(jīng)TUNEL處理后，在熒光顯微鏡下呈綠色熒光的為陽性。在200倍下，任選3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)為凋亡指數(shù)。

1.5布南色林對(duì)H2O2引起PC12細(xì)胞損傷的形態(tài)觀察按1.4進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，藥物作用后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；再加入4%的多聚甲醛固定，用10 mg·L-1的Hoechst 33258對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色10 min后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6布南色林對(duì)PC12細(xì)胞中SOD、MDA含量的影響細(xì)胞接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)分組如1.4。藥物處理后，小心吸去原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，每孔加入0.1 mol·L-1的PBS和0.05 mol·L-1的EDTA（pH 8.0）2 mL，再加入100μL 1%的Triton-X-100，將培養(yǎng)板置振蕩器振蕩1 min使之溶解，加入25%的H3PO4溶液200μL，12 000 r/min于4℃離心1 h，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD活性和MDA含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以x ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1布南色林對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響濃度分別為0、5、10、20、40、80、160μmol·L-1的布南色林作用PC12細(xì)胞后，細(xì)胞OD值分別為0.426±0.019、0.428±0.012、0.432±0.005、0.446±0.013、0.378± 0.012、0.182±0.010及0.090±0.011（F=527.215，P＜0.05），其中0、5及10μmol·L-1組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。濃度 40 μmol·L-1后呈逐漸降低趨勢（P＜0.05）。

2.2各組細(xì)胞活性和凋亡指數(shù)比較與C組比較，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的活性下降，凋亡指數(shù)增加；與H組比較，B組和E組的細(xì)胞活性增強(qiáng)，凋亡指數(shù)下降（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of cell viability, apoptotic rate of PC12 cells, MDA and SOD between four groups表1各組細(xì)胞活性、凋亡指數(shù)、MDA和SOD水平比較（n=3，x ±s）

2.3 PC12細(xì)胞損傷的形態(tài)觀察C組細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，Hoechst染色顯示正常PC12細(xì)胞核呈暗藍(lán)色的橢圓形，細(xì)胞碎片呈亮藍(lán)色，細(xì)胞損傷明顯；與C組比較，H組中細(xì)胞輪廓變得模糊，細(xì)胞呈不完整狀態(tài)，細(xì)胞碎片明顯增多，細(xì)胞損傷更明顯；與H組比較，E組和B組細(xì)胞貼壁生長明顯增多，細(xì)胞形態(tài)部分恢復(fù)，在B組和E組中部分細(xì)胞出現(xiàn)暗藍(lán)色的正常細(xì)胞核，見圖1。

2.4各組SOD活性以及MDA水平比較與C組比較，H組MDA水平增加、SOD活性減少；與H組比較，B組和E組MDA水平降低、SOD活性增加（均P＜0.05），見表1。

3　討論

3.1布南色林對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響目前，在精神分裂癥病因中，神經(jīng)發(fā)育障礙假說獲得較多支持，認(rèn)為在神經(jīng)發(fā)育的過程中，某些腦區(qū)神經(jīng)元的凋亡損傷、神經(jīng)細(xì)胞的萎縮和數(shù)量減少，從而導(dǎo)致的神經(jīng)元的排列、連接出現(xiàn)異常是精神分裂癥的病理基礎(chǔ)[7]。本研究結(jié)果顯示，0、5及10μmol·L-1組間細(xì)胞增殖情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 40μmol·L-1后呈逐漸降低趨勢，表明布南色林＜20μmol·L-1，其對(duì)細(xì)胞的增殖影響不明顯，當(dāng)藥物濃度達(dá)到20μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖增強(qiáng)；布南色林在較高濃度（ 40μmol·L-1）對(duì)PC12細(xì)胞生長有抑制作用，提示過量抗精神分裂藥物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有損傷作用。

3.2布南色林對(duì)氧化損傷PC12細(xì)胞活性的影響在精神分裂癥患者中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡損傷往往與細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。研究認(rèn)為，患有精神分裂癥的患者血中的各種抗氧化物質(zhì)及脂質(zhì)過氧化物的水平存在異常，可能機(jī)制為患者腦內(nèi)的自由基生成過多，或者是生理性清除機(jī)制有所減弱，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增多，神經(jīng)毒性增強(qiáng)，引起神經(jīng)元的凋亡損傷[11-12]。在布南色林對(duì)PC12細(xì)胞氧化損傷的結(jié)果中提示，合適濃度（20μmol·L-1）的布南色林能減輕H2O2引起PC12細(xì)胞的凋亡情況，并減少細(xì)胞氧化損傷程度。為了進(jìn)一步證實(shí)其抗氧化的效果，通過測定損傷PC12細(xì)胞內(nèi)的SOD以及MDA水平變化來明確布南色林抗氧化損傷效果。SOD是神經(jīng)元內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的生物酶，在一定程度上可保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損害，其含量的高低通常反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱。MDA是神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化程度以及自由基水平。本研究顯示，與C組比較，H組MDA水平增加、SOD活性減少；與H組比較，B組和E組MDA水平降低、SOD活性增加，表明濃度為20 μmol·L-1布南色林能降低H2O2引起PC12細(xì)胞損傷中MDA水平以及提高SOD的活性，其作用效果較陽性對(duì)照藥（維生素E）弱，而維生素E是被證實(shí)能夠阻斷細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，使細(xì)胞、組織、器官免受自由基攻擊，是研究氧化損傷中常用的陽性對(duì)照藥，提示布南色林對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用可能與改變細(xì)胞內(nèi)的自由基水平有關(guān)，這與相關(guān)研究相似[11-13]。綜上所述，布南色林作為第二代抗精神分裂癥藥，能減輕氧化應(yīng)激引起的損傷，有神經(jīng)保護(hù)作用。

對(duì)于其如何改變細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)離子水平變化的影響尚待進(jìn)一步深入研究。

（圖1見插頁）

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（2015-09-14收稿2015-11-06修回）

（本文編輯陸榮展）

實(shí)驗(yàn)研究

Neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells

HUANG Haichao1, WU Wei1, ZHANG Xiaohong1, NIE Yang1, LIU Jingliang1, ZHOU Jie2
1 Guangdong Food and Drug Vocational College, Guangzhou 510520, China;
2 Department of pharmacy, SUN YAT-SEN University Cancer Center Corresponding Author E-mail：Wuweide2009@163.com

Abstract：Objective To explore neuroprotective effects of blonanserin on H2O2-induced injury in PC12 cells. Meth?ods PC12 cells were divided into four groups: control group (C group), H2O2-treated group (H group), blonanserin pretreat?ed group (B group) and positive control group (vitamin E- pretreated, E group). The effects of different concentrations of blonanserin (0, 5, 10, 20, 40, 80 and 160μmol·L-1) on cell proliferation in PC 12 cells were observed. MTT assay was used to detect the cell activity of different groups. The apoptotic rates of different groups were measured by TUNEL assay. The mor?phological changes were observed usinginverted microscope and Hoechst 33258 staining. The superoxide dismutase (SOD)vi?ability and malondialdehyde (MDA) levels were detecded by biochemical methods in four groups. Results The appropriate concentration of blonanserin (0-20μmol·L-1)can promote the growth of PC12 cells. Comparingwith the C group, the apoptot?ic rate and MDA level were increased in group H, while the cell viability and the SOD viability were decreased obviously (P＜0.05). Compared with H group, the cell viability, SOD viability were significantly increased, while the MDA level and apoptotic rate were decreased (P＜0.05). Conclusion Blonanserin shows neuroprotective effect on H2O2-induced injury in PC12 cells.

Key words:trauma, nervous system；apoptosis; PC12 cell; neuroprotective; Blonanserin; SOD; MDA

中圖分類號(hào)：R749.3，R749.05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.11958/20150159

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（B2013071）

作者簡介：黃海潮（1982），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，主要從事神經(jīng)藥理研究

通訊作者E-mail：Wuweide2009@163.com