付穎，董慶文，王稚英

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富血小板纖維蛋白對牽引成骨區(qū)BMP-6表達(dá)的影響

付穎，董慶文，王稚英

摘要：目的探討應(yīng)用富血小板纖維蛋白（PRF）對牽引成骨區(qū)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6（BMP-6）表達(dá)的影響。方法25只大耳白兔隨機(jī)分5組，分別行雙側(cè)下頜骨皮質(zhì)骨切開術(shù)，一側(cè)下頜骨牽引間隙放置PRF膜，作為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)作為對照組，分別于穩(wěn)定期第1、3、7、14、28天處死1組動(dòng)物，切取牽引間隙處骨痂行HE染色和BMP-6免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞圖像分析儀測量牽引間隙處骨痂BMP-6表達(dá)情況。結(jié)果下頜牽引延長后牽引間隙均有新骨形成，免疫組化染色顯示BMP-6主要定位于成骨細(xì)胞的胞漿中。實(shí)驗(yàn)組在穩(wěn)定期第1、3、7天BMP-6表達(dá)的陽性細(xì)胞率和陽性面積百分比均高于對照組（P＜0.05），穩(wěn)定期第14、28天BMP-6表達(dá)的陽性細(xì)胞率和陽性面積百分比均與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論P(yáng)RF能促進(jìn)兔下頜骨牽引成骨區(qū)新骨的生成，BMP-6可能在牽引成骨過程的早期調(diào)控組織細(xì)胞應(yīng)力信號(hào)傳遞，發(fā)揮成骨作用。

關(guān)鍵詞：骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)類；骨生成,牽張；兔；富血小板纖維蛋白；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6

作者單位：遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔內(nèi)科（郵編121000）

骨組織的修復(fù)與周圍力學(xué)環(huán)境關(guān)系密切，牽張成骨技術(shù)（distraction osteogenesis,DO）正是利用骨的這一特性，給予一定牽引力，通過復(fù)雜的機(jī)械-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制激發(fā)細(xì)胞增殖，促進(jìn)新骨生成。在骨修復(fù)過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6（bone morphogenetic protein-6,BMP-6）作為一種信使，參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)。在DO較長的療程中存在許多并發(fā)癥如傷口感染，骨不連、松脫等，因此，縮短療程、減少并發(fā)癥的相關(guān)研究越來越受到重視，其中，局部應(yīng)用富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin,PRF）促進(jìn)牽引區(qū)新骨生成的研究已成為熱點(diǎn)。PRF是一種自體靜脈血經(jīng)離心后的血小板纖維蛋白凝塊，富含多種生長因子，這些因子可以有效地調(diào)控與骨組織修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[1]。因此推測PRF可能促進(jìn)DO牽引區(qū)新骨的生成，有利于縮短療程、減少并發(fā)癥。本研究擬通過對兔下頜骨牽引過程中局部給予PRF膜后，檢測牽引區(qū)的關(guān)鍵骨生長因子BMP-6表達(dá)的變化規(guī)律，探討PRF膜對下頜骨DO牽引區(qū)新骨生成的影響機(jī)制，從而為縮短下頜骨DO療程、減少并發(fā)癥的臨床治療提供線索與依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料日本大耳白兔25只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，普通級(jí)[（生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（遼）2014-0004）]，購自遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。北京大學(xué)王興教授設(shè)計(jì)的外置式下頜骨純鈦牽引器由西安中邦公司制作。牽引桿每旋轉(zhuǎn)1周，牽引器兩固定臂間增大0.4 mm間隙。離心機(jī)、齒科低速手機(jī)、操作臺(tái)、器械及麻醉藥均由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。BMP-6的SABC免疫組化試劑盒（北京中杉金橋）。

1.2方法

1.2.1 PRF膜的制備在無菌條件下，每只大耳白兔抽取靜脈血5 mL，經(jīng)2次離心，2 400 r/min，10 min，3 600 r/min，15 min，從離心后的采血管中取出纖維蛋白凝膠，用紗布將PRF凝膠中的液體擠出，使其形成PRF膜[2]，放入-70℃冰箱標(biāo)號(hào)備用。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和分組大耳白兔在安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中適應(yīng)性圈養(yǎng)1周，每天均給予相同進(jìn)食量（200 g）和足量飲用水，并保持環(huán)境清潔與衛(wèi)生。采用抽簽法將動(dòng)物隨機(jī)均分為5組，每組各5只。建立雙側(cè)下頜骨牽引成骨動(dòng)物模型，一側(cè)牽引間隙處放置PRF膜，作為實(shí)驗(yàn)組，對側(cè)為對照組，分別于牽引穩(wěn)定期第1、3、7、14、28天處死1組動(dòng)物取材。本研究對動(dòng)物的處理方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2.3下頜骨牽引成骨動(dòng)物模型的建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按2.5 mg/kg經(jīng)耳緣靜脈注射10%平衡液全身麻醉后，在每只動(dòng)物一側(cè)下頜骨磨牙前部行骨切開術(shù)，安放牽引器，并于間隙處放置PRF膜，另一側(cè)下頜骨磨牙前部行骨切開術(shù)并安放牽引器作為對照組，骨膜復(fù)位縫合，分層縫合肌肉、皮膚，牽引器加力桿端暴露于口外，間歇期5 d后，用牽引器按0.8 mm/d，2次/d，0.4 mm/次，每次間隔12 h的速率緩慢延長下頜骨。連續(xù)牽引5 d，共延長下頜骨4 mm后進(jìn)入牽引穩(wěn)定期[3]。

1.2.4光鏡標(biāo)本的制備與染色分別于穩(wěn)定期第1、3、7、14、28天處死1組動(dòng)物，將下頜骨修剪成以牽引區(qū)為中心的12 mm長組織塊，放入4%中性甲醛溶液中固定，4℃，24 h。0.5 mol/L EDTA脫鈣，乙醇梯度脫水，透明，包埋，切5 μm厚的切片，做蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

1.2.5免疫組織化學(xué)法檢測與分析取上述石蠟標(biāo)本制備5 μm防脫切片，采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟至水后，采用pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液微波修復(fù)抗原活性，滴加1∶100稀釋的一抗BMP-6抗體，4℃孵育過夜；滴加生物素化二抗，37℃水浴30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陰性對照采用PBS替代一抗。光鏡下觀察，

BMP-6陽性表達(dá)部位定位于細(xì)胞胞漿。選擇牽引成骨穩(wěn)定期第1、3、7、14、28天不同時(shí)期切片，采用CIAS-1000細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)400倍視野觀察下頜牽引成骨區(qū)不同時(shí)期BMP-6的表達(dá)。在免疫組織染色切片的牽引區(qū)的中心處隨機(jī)讀取5個(gè)視野，測每野細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)；在同批未復(fù)染的免疫組織染色切片的牽引區(qū)的中心處隨機(jī)讀取5個(gè)視野，測陽性面積百分比。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用Excel軟件及SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以x ±s表示，采用配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活到預(yù)定時(shí)間，傷口無感染，術(shù)后7 d內(nèi)咀嚼功能稍有障礙，不影響健康和基本活動(dòng)。牽引器固定穩(wěn)定，周圍無嚴(yán)重并發(fā)感染。取材時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中切牙明顯偏斜。

2.1 HE染色結(jié)果穩(wěn)定期第1天，對照組和實(shí)驗(yàn)組牽引區(qū)均見無序排列的纖維結(jié)締組織。穩(wěn)定期第3天，對照組與實(shí)驗(yàn)組牽引區(qū)見纖維結(jié)締組織沿牽引方向呈條束樣，實(shí)驗(yàn)組更密集、粗大，見圖1。穩(wěn)定期第7天，對照組牽引區(qū)見沿牽引力方向的密集膠原纖維束；實(shí)驗(yàn)組在密集的膠原纖維內(nèi)可見部分骨基質(zhì)形成和礦化，近截骨線處見少量不規(guī)則的骨小梁。穩(wěn)定期第14天，對照組牽引區(qū)有少量幼稚的骨小梁；實(shí)驗(yàn)組骨小梁數(shù)量增多。穩(wěn)定期第28天，對照組牽引區(qū)骨小梁比較纖細(xì)、幼稚，近斷端處較成熟，與牽引方向平行排列；實(shí)驗(yàn)組牽引區(qū)可見大量沿牽張力方向的骨小梁，表面規(guī)則地排列大量增生活躍的成骨細(xì)胞，見圖2。

Fig.1 The arrangementof fibrous connective tissue onthe thirddayafter the end of distraction（HE，×100）圖1穩(wěn)定期第3天纖維結(jié)締組織排列情況（HE，×100）

Fig.2 The formation of bone trabeculae on the twenty-eighth day after the end of distraction（HE，×100）圖2穩(wěn)定期第28天骨小梁的形成情況（HE，×100）

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果穩(wěn)定期第1天，牽引區(qū)新骨BMP-6陽性表達(dá)，主要集中在間充質(zhì)細(xì)胞的胞漿中，見圖3。穩(wěn)定期第3天，牽引區(qū)新骨BMP-6在大量增殖的間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞中呈強(qiáng)陽性染色，見圖4。穩(wěn)定期第7天，牽引骨痂處的骨髓襯里細(xì)胞BMP-6表達(dá)仍呈強(qiáng)陽性。穩(wěn)定期第14天，牽引區(qū)新骨BMP-6在新生骨小梁表面的成骨細(xì)胞胞漿內(nèi)呈陽性染色。穩(wěn)定期第28天，牽引骨痂處的骨髓襯里細(xì)胞BMP-6表達(dá)呈弱陽性，見圖5。

Fig.3 BMP-6 was localized in cytoplasm of large proliferation of osteoblast-like cells of the control group and experiment group on the 1st day after the end of distraction（DAB，×400）圖3穩(wěn)定期第1天對照組與實(shí)驗(yàn)組BMP-6在間充質(zhì)細(xì)胞的胞漿中呈陽性染色（DAB，×400）

Fig.4 BMP-6 was localized in cytoplasm of large proliferation of osteoblast-like cells of the control group and experiment group on the third day after the end of distraction（DAB，×400）圖4穩(wěn)定期第3天對照組與實(shí)驗(yàn)組BMP-6在增殖的成骨細(xì)胞的胞漿中呈強(qiáng)陽性染色（DAB，×400）

Fig.5 BMP-6 was localized in cytoplasm of osteoblast cells of naive trabecular bone of the control group and experiment group on the twentyeighth day after the end of distraction（DAB，×400）圖5穩(wěn)定期第28天對照組和實(shí)驗(yàn)組BMP-6在骨小梁表面的成骨細(xì)胞可見陽性著色（DAB，×400）

穩(wěn)定期第1、3、7天實(shí)驗(yàn)組BMP-6表達(dá)的陽性細(xì)胞率和陽性面積百分比均高于對照組（P＜0.05 或P＜0.01)；穩(wěn)定期第14、28天2組BMP-6表達(dá)的陽性細(xì)胞率和陽性面積百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、2。

Tab. 1 Comparation of BMP-6-positive cell rates in distracted calluses between two groups表1穩(wěn)定期2組BMP-6表達(dá)的陽性細(xì)胞率比較（n=5,%, x ±s）

Tab. 2 Comparation of BMP-6-positive area percentage in distracted calluses between two groups表2穩(wěn)定期2組BMP-6表達(dá)的陽性面積百分比比較（n=5,%, x ±s）

3　討論

DO通過緩慢且穩(wěn)定地牽引骨組織，促進(jìn)骨愈合，無需植骨，手術(shù)簡單。但治療周期較長，有時(shí)出現(xiàn)骨不連、纖維性骨愈合并發(fā)癥。因此，尋找一種既安全又有良好成骨能力的材料，對于促進(jìn)骨的愈合至關(guān)重要，PRF因富含各種生長因子和纖維支架能加速成骨而備受關(guān)注。由于其取于自體血，制備過程簡單，不需要添加抗凝劑及凝血酶，避免了交叉感染。Pripatnanont等[4]通過新西蘭白兔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對比應(yīng)用PRF膜的骨形成效果，發(fā)現(xiàn)放置PRF膜組成功地促進(jìn)了骨缺損的修復(fù)，效果明顯。Gassling等[5]首次將PRF作為支架材料和膠原膜比較，發(fā)現(xiàn)人來源的成骨細(xì)胞在PRF的作用下可以更好地增殖、遷移和分化。Hauser等[6]在臨床拔除后牙的牙槽窩中應(yīng)用PRF膜對比研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PRF膜后能明顯改善拔牙牙槽窩內(nèi)的微體系結(jié)構(gòu)，提高骨形成的質(zhì)量，加快拔牙窩骨的愈合速度。

以上許多研究結(jié)果都表明PRF能明顯提高骨的愈合和修復(fù)，但PRF如何通過影響細(xì)胞因子來加速骨痂的愈合，它與在成骨過程中起著重要作用的骨形成蛋白（BMPs）有何關(guān)系仍不清楚。具有成骨作用的細(xì)胞因子很多，比較重要而且研究較多的是BMP-2、BMP-4和BMP-6，而BMP-6是一種具有巨大潛力的成骨促進(jìn)因子，骨組織的修復(fù)需要成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共同作用，BMP-6主要促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。在裸鼠的實(shí)驗(yàn)中BMP-6誘導(dǎo)骨形成能力大于BMP-2和BMP-4，大量實(shí)驗(yàn)研究表明BMP-6能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞等[7]。Mizrahi等[8]用BMP-2、BMP-6誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分化成骨，比較兩者的成骨速度和數(shù)量，發(fā)現(xiàn)BMP-6明顯優(yōu)于BMP-2。Li等[9]和Fischerauer等[10]研究骨折的成骨過程中發(fā)現(xiàn)BMP-6在骨折的骨痂愈合中有重要作用。Lammens 等[11]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)BMP-6能明顯促進(jìn)牽引成骨區(qū)骨痂斷端愈合，且在早期的牽引成骨過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中，穩(wěn)定期第1、3、7天，兔下頜牽引成骨區(qū)覆蓋PRF膜后，形成了合適的三維纖維蛋白網(wǎng)狀支架，并提供大量自體細(xì)胞因子，牽引成骨區(qū)局部較高濃度BMP-6的釋放與表達(dá)，成骨細(xì)胞增殖分化，從而加快牽引區(qū)新生骨痂的愈合，通過對牽引成骨區(qū)免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PRF組在穩(wěn)定期第1、3、7天BMP-6在增殖活躍的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞呈陽性表達(dá)也證實(shí)了這一點(diǎn)，而穩(wěn)定期第14、28天，牽引成骨區(qū)組織細(xì)胞不再以增殖為主，主要表現(xiàn)為骨的改建，而在這一時(shí)期，HE染色發(fā)現(xiàn)骨小梁周圍出現(xiàn)細(xì)胞核較大、胞漿少的大量成骨細(xì)胞，成行或復(fù)層排列，與李紹蘭[12]的研究一致。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)BMP-6僅有微弱表達(dá)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在DO早期，PRF能通過促進(jìn)牽引區(qū)局部成骨細(xì)胞表達(dá)BMP-6，成骨作用明顯，在骨改建的后期作用逐漸減弱。

本實(shí)驗(yàn)通過兔下頜DO動(dòng)物模型研究，結(jié)果顯示局部應(yīng)用PRF膜能促進(jìn)牽引間隙局部生長因子BMP-6的高表達(dá)，在局部發(fā)揮作用，刺激牽引區(qū)骨基質(zhì)合成和誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞的增殖分化等活性功能，從而更有效地促進(jìn)牽引區(qū)新骨的生成和修復(fù)，加快鈣化，為PRF膜能加快牽引區(qū)骨痂的愈合、縮短DO的治療時(shí)間奠定了理論基礎(chǔ)，為骨科疾病提供新的、比較簡單、安全和廉價(jià)的治療方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Zheng YL, Zhang GZ. The application of plateletirich fibin in oral medicine[J]. Chin J Stomatol Res(Electronic Edition), 2013, 7(2): 161-163.[鄭友麗,張國志.富血小板蛋白在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志·電子版, 2013, 7(2):161-163].

[2] Hatakeyama I, Marukawa E, Takahashi Y, et al. Effects of platelet-poor plasma, platelet-rich plasma, and platelet-rich fibrin on healing of extraction sockets with buccal dehiscence in dogs [J]. Tissue Eng Part A,2014,20(3-4):874-882. doi: 10.1089/ten.TEA.2013.0058.

[3] Fu Y, Wang ZY, Li X. The changes of expressions of OPG and OP?GL in mandibular distraction osteogenesis in rabbit[J]. Jiangsu Med?ical Journal, 2013, 39(8):882-884. [付穎,王稚英,李新.骨保護(hù)素及其配體在兔下頜骨牽引成骨過程中表達(dá)水平的變化[J].江蘇醫(yī)藥, 2013, 39(8):882-884].

[4] Pripatnanont P, Balabid F, Pongpanich S, et al. Effect of osteogenic periosteal distraction by a modified Hyrax device with and with?out platelet-rich fibrin on bone formation in a rabbit model:a pilot study [J]. Lnt J Oral Maxillofac Surg, 2015, 44(5):656- 663. doi: 10.1016/j.ijom.2014.12.004.

[5] Gassling V, Hedderich J, Acil Y, et al. Comparison of platelet rich fibrin and collagen as osteoblast-seeded scaffolds for bone tissue engineering application[J]. Clin Oral Implants Res, 2013, 24(3): 320-328. doi: 10.1111/j.1600-0501.2011.02333.x.

[6] Hauser F, Gaydarov N, Badoud I, et al. Clinical and histological evaluation of postextraction platelet-rich fibrin socket filling: a pro?spective randomized controlled study[J]. Implant Dent, 2013, 22(3): 295-303. doi: 10.1097/ID.0b013e3182906eb3.

[7] Xu G, Zhang CC, Zhou JS, et al.Advances in osteogenic mecha?nism and osteogenic effects of bone morphogenetic protein 6[J]. Chinese Jounal of Reparative and Reconstructive Surgery, 2013, 27(9):1144-1147. [許剛,張長春,周建生,等.BMP-6成骨機(jī)制和成骨效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].中國修復(fù)重建外科雜志, 2013, 27(9):1144-1147].

[8] Mizrahi O, Sheyn D, Tawackoli W, et al. BMP-6 is more efficient in bone formation than BMP-2 when overexpressed in mesenchymal stem cells[J].Gene Ther, 2013, 20(4):370-377. doi: 10.1038/gt.2012.45.

[9] Li CJ, Madhu V, Balian G, et al. Cross- talk between VEGF and BMP-6 pathways accelerates osteogenic differentiation of hu?man adipose-derived stem cells[J]. J Cell Physiol, 2015, 230(11): 2671-2682. doi: 10.1002/jcp.24983.

[10] Fischerauer EE, Manninger M, Seles M, et al.BMP-6 and BMPR-1a are up-regulateded in the growth plate of the fractured tibia[J]. J Orthop Res, 2013, 31(3):357-363. doi: 10.1002/jor.22238.

[11] Lammens J, Liu Z, Luyten F.Bone morphogenetic protein signaling in the murine distraction osteogenesis model[J].Acta Orthop Belg, 2009, 75(1):94-102.

[12] Li SL. Effects of gege transfection on the expression of celluer growth factor in mandible distraction area(Master′s Degree Disserta?tion)[D]. Sichuan: Luzhou Medical College, 2011.[李紹蘭.基因轉(zhuǎn)染對下頜骨牽引區(qū)細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響（碩士學(xué)位論文）[D].四川:瀘州醫(yī)學(xué)院, 2011].

（2015-07-09收稿2015-09-18修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of platelet-rich fibrin on expression of BMP-6 during mandibular distraction osteogenesis

FU Ying, DONG Qingwen, WANG Zhiying
Department of Oral Medicine, Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China

Abstract:Objective To investigate the effects of platelet-rich fibrin (PRF) on BMP-6 expression during mandibular distraction osteogenesis. Methods Twenty-five mature rabbits were randomly divided into five groups. Mandibular osteoto?mies were performed corticectomy in bilateral mandibles of rabbits. PRF was implanted in the one side of mandibles, which was used as experimental group. Another side of madibular was used as control group. Rabbits were sacrificed and the dis?tracted calluses were harvested and processed for HE and BMP-6 immunohistochemistry staining at 1, 3, 7, 14 and 28 days after the end of distraction, respectively. The expressions of BMP-6 in the distracted calluses were analyzed by cell digital imaging software. Results The regenerated bone was found in the distraction gap after mandibular lengthening. Expres?sions of BMP-6 were co-localized in cytoplasm of osteoblasts and newly embedded osteocytes. Compared with control group, the positive cell rate and positive area percentage of BMP-6 were significantly higher on the 1st, 3th and 7th day after the distraction in experimental group (P＜0.05). There were no significant differences in positive cell rate and positive area per?centage of BMP-6 at 14-day and 28-day after the distraction between experimental group and control group. Conclusion PRF can accelerate bone formation of mandibular distraction osteogenesis in rabbits. BMP-6 may play important role at the early stage of mandibular distraction.

Key words:bone morphogenetic proteins; osteogenesis, distraction; rabbits; platelet-rich fibrin; bone morphogenetic protein 6

中圖分類號(hào)：R782.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20150028

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015020352）；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013322）

作者簡介：付穎（1977），女，副教授，碩士，主要從事口腔醫(yī)學(xué)研究