胡星星　倪海濱　劉克琴　俞辰斌（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇　南京　210028）

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大承氣湯對(duì)膿毒癥小鼠肺血管通透性影響

胡星星倪海濱△劉克琴俞辰斌
（江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京210028）

【摘要】目的觀察大承氣湯對(duì)膿毒癥小鼠肺血管通透性的影響，初步判斷其作用機(jī)理。方法60只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和大承氣湯組。采用腹腔注射脂多糖（LPS）建立膿毒癥模型，并給予大承氣湯灌胃治療。分組處理后12 h，監(jiān)測(cè)各組血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及血漿總蛋白，每組10只稱(chēng)右肺濕干質(zhì)量，左肺行切片病理觀察；每組另10只行肺泡灌洗，測(cè)灌洗液總蛋白，計(jì)算肺通透指數(shù)。結(jié)果模型組與大承氣湯組，肺濕干質(zhì)量比、肺通透指數(shù)均較對(duì)照組升高（P＜0.05或P＜0.01），而大承氣湯組濕干質(zhì)量比、肺通透指數(shù)較模型組水平低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與大承氣湯組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較對(duì)照組升高，但較大承氣湯組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論大承氣湯通過(guò)降低膿毒癥小鼠炎癥介質(zhì)水平，改善肺血管通透性，對(duì)膿毒癥中肺臟起保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】大承氣湯膿毒癥血管通透性全身炎癥反應(yīng)綜合征腫瘤壞死因子-α白細(xì)胞介素-6

膿毒癥在創(chuàng)傷和感染等應(yīng)激狀態(tài)下，腸道的屏障功能受損，使腸道內(nèi)大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)門(mén)靜脈及淋巴系統(tǒng)侵入血液循環(huán)，造成腸源性感染和內(nèi)毒素血癥及其所激活的細(xì)胞因子毒性網(wǎng)絡(luò)，引起全身多器官功能衰竭，而肺臟的損傷發(fā)生早、病情嚴(yán)重，常是患者死亡的直接原因［1］。早期肺損傷是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴(yán)重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ARDS早期的特征性表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞屏障的通透性增高，肺泡與肺間質(zhì)內(nèi)積聚大量的水腫液［2］。因此，如何減少膿毒癥患者肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞屏障的通透性，減輕炎癥反應(yīng)，是保護(hù)并治療肺損傷的關(guān)鍵［3］。

肺與大腸相表里是臟腑表里相合的重要內(nèi)容。大腸的實(shí)熱積滯等病態(tài)可致腸腔內(nèi)的細(xì)菌與毒素大量繁殖增加并吸收入血，通過(guò)腸源性?xún)?nèi)毒素導(dǎo)致?lián)p害。大承氣湯是著名方劑之一，由大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝組成，功能峻瀉熱結(jié)，主治陽(yáng)明腑實(shí)喘滿(mǎn)證，對(duì)內(nèi)毒素性急性肺損傷的炎癥細(xì)胞及其分泌的多種細(xì)胞因子具有免疫調(diào)節(jié)作用［4］。筆者通過(guò)研究大承氣湯對(duì)膿毒癥小鼠肺血管通透性影響，探討大承氣湯對(duì)急性肺損傷（ALI）/ARDS的治療作用以及作用機(jī)制，以期為大承氣湯用于臨床膿毒癥患者的救治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只SPF級(jí)雄性BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，10～12周齡，由江蘇省中醫(yī)藥研究研動(dòng)物中心提供。

1.2試藥大承氣湯組成大黃12 g，厚樸15 g，枳實(shí)15 g，芒硝9 g，藥材均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥庫(kù)房，水煎濃縮至102 mL（含生藥0.5 g/mL），經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌。脂多糖（LPS，Escherichia coli 055:B5，L2880），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。生理鹽水溶解稀釋成1 mg/mL，即配即用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的ELISA測(cè)定試劑購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.3分組與造模60只小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組和大承氣湯組，每組20只。所有實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)前12 h禁食不禁水。模型組和大承氣湯組采用腹腔注射LPS 1 mL/10 g的方法制備小鼠膿毒癥模型，對(duì)照組予生理鹽水1 mL/10 g腹腔注射，0.5 h后予生理鹽水或大承氣湯灌胃。12 h后行相關(guān)標(biāo)本采集。采用生理鹽水稀釋氯胺酮至20 mg/mL，按0.1 mg/g分別于造模給藥前及標(biāo)本采集時(shí)小鼠后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射進(jìn)行麻醉。

1.4標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.4.1血清中TNF-α、IL-1β、白介素-6（IL-6）小鼠麻醉后，開(kāi)胸心臟采血約0.5 mL，3000 r/min離心10 min，取上層血清分裝于EP管置于-80℃冰箱，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀（BIO-RAD680）讀取吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.2肺組織濕/干質(zhì)量比每組隨機(jī)取10只小鼠，開(kāi)胸留取左肺，濾紙拭去表面血跡并以電子天平稱(chēng)重記錄。稱(chēng)肺組織濕質(zhì)量后，置烤箱80℃烘烤72 h，稱(chēng)干質(zhì)量，計(jì)算濕/干質(zhì)量比值。取右肺邊緣組織約100 mg，磷酸鹽緩沖液（PBS）快速?zèng)_洗后濾紙吸干表面水分，浸泡于10%甲醛溶液24 h備用。余右肺組織立即置液氮凍存，-80℃冰箱備用。

1.4.3肺血管通透指數(shù)（LPI）的測(cè)定每組另取10只小鼠，開(kāi)胸后暴露主氣管，將2 mL空針帶1 mL生理鹽水連接22號(hào)穿刺針，自頭側(cè)向尾側(cè)刺入氣管，回抽見(jiàn)氣泡確定針頭置入氣道內(nèi)，結(jié)扎固定。更換1 mL注射器緩慢向氣道內(nèi)注入生理鹽水1 mL，停留5 s后緩慢回抽，重復(fù)灌洗3次。回收灌洗液行1000 r/min離心10 min，取上清液應(yīng)用全自動(dòng)生化儀測(cè)定總蛋白濃度，肺泡灌洗液總蛋白濃度，計(jì)算LPI（肺泡灌洗液總蛋白濃度/血漿總蛋白濃度）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有測(cè)定計(jì)量資料用（）表示，各組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不同指標(biāo)比較采用線性回歸，并采用單因素方差分析及多樣本均數(shù)的配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；大承氣湯組TNF-α、IL-1β、IL-6水平，較模型組降低（P＜0.05）。

表1　各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

表1　各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n　IL-6大承氣湯組　20　236.81±13.96*△對(duì)照組　20　98.25±12.37模型組　20　311.28±15.72**TNF-α　IL-1β 93.47±9.87*△　23.54±3.77**△40.31±3.15　15.34±2.18 128.57±15.39**47.15±4.89**

2.2各組小鼠LPI比較見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠LPI水平明顯升高（P＜0.01），大承氣湯組較模型組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　各組小鼠LPI比較

表2　各組小鼠LPI比較

組別n　LPI大承氣湯組10　2.73±0.43△△△對(duì)照組　10　1.20±0.19模型組　10　4.04±0.98**肺泡灌洗液總蛋白血漿總蛋白117.50±31.48　43.02±6.34 57.82±9.21　48.35±8.89 169.32±38.79　41.89±4.09

2.3各組小鼠肺濕干質(zhì)量比比較見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠肺濕干質(zhì)量比升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。大承氣湯組較模型組肺濕干質(zhì)量比降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4各組小鼠肺組織病理切片見(jiàn)圖1。光鏡觀察可見(jiàn)大承氣組可減輕LPS導(dǎo)致肺血管通透性增加，改善肺損傷。

表3　各組小鼠肺濕質(zhì)量、肺干質(zhì)量、肺濕干質(zhì)量比較

表3　各組小鼠肺濕質(zhì)量、肺干質(zhì)量、肺濕干質(zhì)量比較

組別　n　肺濕干質(zhì)量比大承氣湯組　10　4.89±0.52**△對(duì)照組　10　4.10±0.36模型組　10　5.53±0.97**肺濕質(zhì)量（g）肺干質(zhì)量（g）68.39±9.03　13.98±1.48 55.34±3.24　13.49±1.16 79.03±11.51　14.29±1.69

圖1　各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，400倍）

3　討論

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)抗感染、創(chuàng)傷、缺血、燒傷、有毒物質(zhì)、外來(lái)抗原和自身免疫過(guò)程中的保護(hù)機(jī)制。但在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、應(yīng)激狀態(tài)下，過(guò)度的炎癥反應(yīng)造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和微血管損傷。而這種損傷導(dǎo)致腸道屏障功能降低，腸源性?xún)?nèi)毒素甚至細(xì)菌移位入血，激活單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，促使炎癥細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6）過(guò)度釋放，形成瀑布式的炎癥反應(yīng)放大效應(yīng)，造成全身各臟器損傷［5］。而肺部由于毛細(xì)血管網(wǎng)極其豐富，肺循環(huán)收集濾過(guò)全身血液，因此成為最易受損的靶器官［6］。其功能、形態(tài)學(xué)改變往往最先發(fā)生，表現(xiàn)為呼吸急促，氧合功能下降，肺部血管通透性增加，肺泡內(nèi)滲出增多，如全身炎癥反應(yīng)不能得到即使控制，則進(jìn)展為ARDS。

因此，在嚴(yán)重誘發(fā)因素作用下導(dǎo)致的腸源性?xún)?nèi)毒素移位入血，是加重SIRS，導(dǎo)致ARSD，進(jìn)展為MODS的重要病理基礎(chǔ)［7］。這一理論與中醫(yī)“肺與大腸相表里”的機(jī)制相吻合。當(dāng)機(jī)體遭受?chē)?yán)重打擊后，外邪入侵，正氣受損，腸道屏障功能受損，腸道內(nèi)細(xì)菌入血并釋放大量?jī)?nèi)毒素，邪毒亢盛，火熱循經(jīng)上炎，熱滯于肺，阻遏三焦氣機(jī)，灼傷氣陰，血瘀氣滯，肺失宣降，為陽(yáng)明腑實(shí)喘滿(mǎn)證，直至內(nèi)閉外脫，甚至死亡［8］。

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，與受體作用幾小時(shí)內(nèi)觸發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達(dá)，再通過(guò)旁分泌或體循環(huán)作用于其他組織細(xì)胞，引發(fā)內(nèi)毒素血癥，因此小鼠腹腔注射LPS可復(fù)制內(nèi)毒素血癥的經(jīng)典模型。

本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在腹腔注射LPS 12 h后血漿、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6均較對(duì)照組出現(xiàn)明顯增高，肺濕干質(zhì)量比增加，肺血管通透指數(shù)升高，提示膿毒癥可導(dǎo)致肺血管通透性增加，而炎癥介質(zhì)的釋放是導(dǎo)致肺損傷的主要原因。在大承氣湯組，本研究觀察到肺濕干質(zhì)量比、LPI均較膿毒癥組輕微，同時(shí)血漿、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6升高水平均較模型組偏低，可見(jiàn)大承氣湯具有改善膿毒癥小鼠肺血管通透性的作用，其作用機(jī)制可能與其對(duì)全身炎癥反應(yīng)的抑制作用有關(guān)［9-10］。

本研究觀察到大承氣湯可降低膿毒癥小鼠肺血管通透性，降低炎癥介質(zhì)水平，減輕全身炎癥反應(yīng)。但具體作用機(jī)制、作用途徑尚未明確。另本研究為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床使用過(guò)程中是否具有相似效果，有待后續(xù)研究進(jìn)一步補(bǔ)充。

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中圖分類(lèi)號(hào):R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1004-745X（2016）01-0089-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.029

通信作者△（電子郵箱：13951014020@163.com）

收稿日期（2015-09-12）