金若晨　黃琦（.浙江中醫(yī)藥大學，浙江　杭州　30053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江　杭州　30000）

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人參皂苷對波動性高糖大鼠氧化應激及血管病變的影響*

金若晨1黃琦2△
（1.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053；2.浙江省中醫(yī)院，浙江杭州310000）

【摘要】目的觀察人參皂苷對波動性高糖大鼠氧化應激及血管病變的影響。方法將48只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組8例和糖尿病模型組40例。高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型組大鼠2周后用小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘導建立糖尿病大鼠模型，之后隨機分為穩(wěn)定高糖組（n=8）和波動性高糖組（n=32），波動性高糖組錯時注射葡萄糖、胰島素制備血糖波動大鼠模型。2周后，將波動性高糖組隨機分為中藥低劑量組［人參皂苷14 mg/（kg·d）］，中藥中劑量組［人參皂苷28 mg/（kg·d）］，中藥高劑量組［人參皂苷56 mg/（kg·d）］及波動性高糖模型組。實驗結束后測定大鼠血清一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）濃度并取腎臟及主動脈組織并做常規(guī)病理。結果1）與正常對照組相比，穩(wěn)定高糖組及波動性高糖模型組血清NO、NOS、GSH-Px濃度均明顯增加（P＜0.05）；與穩(wěn)定高糖組比較，波動性高糖模型組NO、NOS、GSH-Px濃度明顯增加（P＜0.05）；與波動性高糖模型相比，中藥各劑量組NO、NOS濃度均有明顯下降，GSH-Px濃度均有明顯上升（P＜0.05）；與中藥低劑量組相比，中藥中、高劑量組有降低NO、NOS濃度，升高GSH-Px濃度的趨勢（P＜0.05）；與中藥中劑量組相比，中藥高劑量組有降低NO、NOS濃度，升高GSH-Px濃度的趨勢（P＜0.05）。2）與正常對照組相比，穩(wěn)定高糖組及波動性高糖模型組主動脈內皮細胞出現(xiàn)一定程度的紊亂與損傷，腎小球體積不同程度的增大變形。結論人參皂苷可降低波動性高血糖大鼠NO、NOS水平，升高GSH-Px水平，減輕血管病變情況，因此，人參皂苷可能降低波動性高血糖大鼠機體的氧化應激水平，提高抗氧化的能力，對波動性高血糖所導致的血管病變有一定的保護作用。

【關鍵詞】人參皂苷波動性高糖大鼠氧化應激血管病變

糖尿病血管病變的發(fā)生發(fā)展一直是糖尿病患者致殘致死的首要原因［1］，嚴重威脅到人類的健康，大量研究表明糖尿病血管病變與內皮細胞氧化應激密切相關。近年研究顯示，血糖水平不穩(wěn)定對血管內皮功能的損害較持續(xù)性高糖更嚴重［2-5］。目前，波動性高血糖致內皮細胞凋亡的機制尚未清楚，其中氧化應激被認為發(fā)揮了重要作用。因此，運用抗氧化應激來防治糖尿病血管病變已成為當今一大研究熱點。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在抗氧化治療糖尿病及其血管病變中有著獨特的優(yōu)勢?，F(xiàn)代藥理學證實，人參的提取物人參皂苷具有較強的抗氧化和自由基清除能力［6-7］，本研究從氧化應激角度入手，觀察人參皂苷對波動性高血糖大鼠氧化應激水平及血管病變的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物6～8周齡雄性SPF級SD大鼠48只，體質量160～180 g，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供［SCXK（滬）2008-0016］。溫度（20±2）℃，相對濕度50%～60%，光照12 h明暗交替，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心，動物合格證號:SYXK（浙）2008-0115。

1.2儀器與試劑超短效胰島素諾和銳（丹麥諾和銳）；鏈脲佐菌素；血糖試紙及血糖儀（德國羅氏）。自制高脂飼料:蔗糖10%、蛋黃10%、豬油10%、膽固醇0.5%、基礎飼料69.5%。人參皂苷粉末（由浙江中醫(yī)藥大學中藥研究室提供）；一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3模型制備1）將48只雄性SD大鼠隨機分成正常對照組8只和糖尿病模型組40只。普通飼料喂養(yǎng)正常對照組，高脂飼料喂養(yǎng)糖尿病模型組大鼠組。2周后所有大鼠禁食不禁水16 h，糖尿病模型組予小劑量鏈脲佐菌素（STZ）35 mg/kg腹腔注射誘導建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，禁食不禁水16 h，測空腹血糖為15～20 mmol/L為模型制作成功。2）正常對照組給予腹腔注射生理鹽水0.375 g/（kg·d）作為對照。將成模大鼠進行2次造模，隨機分為穩(wěn)定高糖組8只和波動性高糖組32只。穩(wěn)定高糖組定時給予腹腔注射250 g/L葡萄糖溶液0.375 g/（kg·d）。波動性高糖組定時給予腹腔注射250 g/L葡萄糖溶液0.375 s/（kg·d），錯時30 min后給予腹腔注射超短效胰島素類似物諾和銳，造成1 d中血糖值大幅度波動模型，使其血糖值在高血糖和低血糖間反復漂移，注射后30 min測血糖，波動幅度（AGE）＞1SD為有效波動，連續(xù)6周。

1.4給藥方法制做波動模型2周后，將波動性高糖組隨機分為4組，分別是中藥高劑量組予人參皂苷56 mg/（kg·d），中藥中劑量組予人參皂苷28 mg/（kg·d），中藥低劑量組予人參皂苷14 mg/（kg·d），波動性高糖模型組予等量生理鹽水。

1.5標本采集與檢測實驗結束后所有大鼠禁食不禁水12 h，予10%水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心取上清液保存；處死大鼠后取部分腎臟及主動脈組織，以10%中性甲醛液固定，行HE染色。測定所有大鼠血清NO、NOS、GSH-Px濃度；并做常規(guī)病理。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以表示，組間比較用單因素方差分析，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠一般情況比較見表1。造模后穩(wěn)定高糖組大鼠精神萎靡，行動遲緩，對外界反應遲鈍，毛色無光澤，易臟，進食減少，飲水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，多數(shù)大鼠體質量明顯降低，波動性高糖模型組較穩(wěn)定高糖組癥狀更明顯。中藥各劑量組大鼠精神明顯好轉，活動力較強，反應較靈敏，毛色較光澤，尿液腥臊味減輕，體質量較穩(wěn)定高糖組和波動性高糖模型組兩模型組亦明顯增加。

表1　各組大鼠體質量比較

表1　各組大鼠體質量比較

與正常對照組比較，*P＜0.05；與穩(wěn)定高糖組比較，#P＜0.05；與波動性高糖模型組比較，▲P＜0.05。下同。

組別　n　造模8周后正常對照組　8　405.88±26.21穩(wěn)定高糖組　8　312.50±21.75*波動性高糖模型組　8　296.04±20.26*#實驗前　STZ注射時192.75±7.46　327.41±11.35 193.08±11.31 323.25±17.99*193.88±7.95　328.88±12.65*中藥低劑量組　8　336.13±29.55▲193.36±10.05 320.15±17.29*中藥中劑量組　8　194.13±6.47 317.63±17.95*358.53±22.57▲中藥高劑量組　8　195.63±8.99 312.50±9.21*371.13±29.11▲

2.2各組大鼠血清NO、NOS、GSH-Px水平比較見表2。與正常對照組相比，穩(wěn)定高糖組及波動性高糖模型組血清NO、NOS、GSH-Px濃度均明顯增加（P＜0.05）；與穩(wěn)定高糖組比較，波動性高糖模型組NO、NOS、GSH-Px濃度明顯增加（P＜0.05）；與波動性高糖模型組相比，中藥各劑量組NO、NOS濃度有明顯下降，GSH-Px濃度有明顯上升（P＜0.05）；與中藥低劑量組相比，中藥中劑量組和中藥高劑量組有減少NO、NOS濃度，升高GSH-Px濃度的趨勢（P＜0.05）；與中藥中劑量組相比，中藥高劑量組有減少NO、NOS濃度，升高GSH-PX濃度的趨勢（P＜0.05）。

表2　各組大鼠血清NO、NOS、GSH-Px指標的變化

表2　各組大鼠血清NO、NOS、GSH-Px指標的變化

與中藥低劑量組比較，△P＜0.05；與中藥中劑量組比較，●P＜0.05。

組別　n　GSH-Px（μmol/L）正常對照組　8　1045.28±29.27穩(wěn)定高糖組　8　1164.35±22.59*波動性高糖模型組　8　1182.85±9.65*#NO（μmol/L）　NOS（U/L）32.60±6.04　22.91±1.52 40.08±7.12*　25.15±1.82*42.29±5.60*#　26.04±1.67*#中藥低劑量組　8　1203.18±25.32▲37.89±6.40▲　22.90±1.52▲中藥中劑量組　8　37.62±6.27▲△22.14±1.48▲△1216.65±12.36▲△中藥高劑量組　8　35.58±4.89▲△●21.46±0.86▲△●1251.66±15.90▲△●

2.3光鏡下各組大鼠腎臟及主動脈組織結構比較正常對照組腎小球及腎小管結構未見明顯病變，穩(wěn)定高糖組腎小球細胞輕度增多，體積增大；波動性高糖模型組腎小球毛細血管球萎縮，球囊增大，分葉明顯，腎小管結構紊亂；中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組腎小球細胞增多，球囊增大，病變程度較輕，且濃度越高，病變程度越輕（圖1）。光鏡下所見，正常對照組主動脈結構未見明顯病變，穩(wěn)定高糖組及波動性高糖模型組主動脈內皮細胞較正常對照組出現(xiàn)一定程度的紊亂與損傷，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組病變程度較輕，3組間無明顯差異（圖2）。

3　討論

糖尿病血管病變是一緩慢進展的過程，內皮細胞損傷是其早期的病理生理過程和始動因素，其與高血糖狀態(tài)下內皮細胞氧化應激密切相關。糖尿病患者血糖波動性的增加進一步加劇了血管內皮細胞的損傷和糖尿病慢性血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。如何在控制糖尿病患者血糖的同時，控制糖尿病患者的血糖波動已經成為糖尿病血管并發(fā)癥防治領域的研究熱點。目前對于波動性高濃度葡萄糖的損傷較持續(xù)性高血糖更為嚴重的機制尚不清楚。有體外實驗研究表明氧化應激增強在其中發(fā)揮有重要的作用［8］。本實驗通過人參皂苷對波動性高血糖大鼠模型的干預，進行進一步的研究，得到與了體外實驗相似的結果。

圖1　光鏡下各組大鼠腎臟組織結構比較（HE染色，200倍）

圖2　光鏡下各組大鼠主動脈組織結構比較（HE染色，200倍）

氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，導致活性氧（ROS）家族在機體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷。NO與活性氧關系密切，氧化應激的狀態(tài)下，細胞內合成過多的NO與氧自由基生成羥自由基和過氧硝基陰離子，是強大的有毒氧化劑，對線粒體功能和DNA合成有嚴重的毒性作用，可引起細胞損傷［9］。同時，機體內抗氧化防御體系被激活，其中廣泛存在著有一種重要的抗氧酶——GSH-Px。它能消除ROS，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時促進HO的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害，為機體中清除過氧化氫和其他有機過氧化物的脫毒酶［10］。GSH-Px因其活性反映了機體清除自由基的能力，因此常被用作反映機體氧化應激水平的指標［11］。本實驗中，高血糖大鼠組血清NO、NOS、GSH-Px濃度均較正常組有所增加，主動脈及腎臟組織較正常組有明顯的病理改變，波動性高血糖大鼠組上述指標濃度的增加及病理改變更為明顯，說明波動性高血糖大鼠機體內氧化應激水平增高，誘導血管內皮細胞凋亡，最終導致主動脈及腎臟組織的病變。

糖尿病屬于中醫(yī)學“消渴”范疇，認為其病機陰津虧虛，燥熱偏勝，故以清熱潤燥、養(yǎng)陰生津為主要治療方法。研究表明，中藥有治療糖尿病及其并發(fā)癥的作用［12］，人參作為補虛中藥的第一要藥，治療“消渴”早有記載。中醫(yī)學認為人參具有大補元氣、生津止渴、扶正固本等功效，現(xiàn)代藥理學證實人參皂苷具有較強的抗氧化和自由基清除能力［6-7］，臨床研究亦證實其在防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有確切的臨床療效［13-17］。本實驗表明不同濃度人參皂苷治療組均可不同程度地減少NO、NOS，升高GSH-Px水平，且濃度越高，上述指標變化越大。大鼠主動脈及腎臟組織病理結果顯示人參皂苷各組在形態(tài)學上均有所改善，濃度越高，效果越顯著。

綜上所述，人參皂苷可降低波動性高血糖大鼠NO、NOS水平，升高GSH-Px水平，抑制氧化應激，提高機體抗氧化的能力，對波動性高血糖導致的大血管及微血管病變有一定的保護作用。

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·研究報告·

Effects of Ginsenoside on Oxidative Stress Level and Vascular Disease in High Blood-glucose Fluctuation State of Diabetic Rats

JIN Ruochen，HUANG Qi.Zhejiang College of Traditional Chinese Medicine，Zhe-jiang，Hangzhou 310053，China；Zhejiang Provincial Hospital of TCM，zhengjiang，Hangzhou 310000，China.

【Abstract】Objective: To observe the effects of ginsenoside on oxidative stress level and vascular disease in high blood glucose fluctuation state of diabetic rats.Methods: Forty eight male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into the normal group（group N，n=8）and diabetic model group（n=40）.The diabetic rat model was established with injection of a small dose of streptozotoein（STZ）after feeding them with high fat diet for 2 weeks，and then were randomly divided into the sustained high glucose diabetic rat model group（group S，n = 8）and the high blood glucose fluctuation rat model group（group F，n=32）.The model of high blood glucose fluctuation rat were developed with alternative intraperitoneal injection of insulin and glucose.Successfully-established model rats were randomly divided into four groups: low［14 mg/（kg·d），group FL］，middle［28 mg/（kg·d），group FM］，high［56 mg/（kg·d），group FH］dosage of ginseng treatment group and control group（group FO）.After 8 weeks，NO，NOS and GSH-Px were measured and vascular disease of aorta and kidney were observed.Results: 1）Compared with group N，levels of NO，NOS and GSH-Px in S and FO groups increased significantly（P＜0.05）；compared with group S，levels of NO，NOS and GSH-Px in group FO increased significantly（P＜0.05）；compared with group FO，levels of NO and NOS in ginseng treatment groups decreased significantly（P＜0.05）；level of GSH-Px increased significantly（P＜0.05）；compared with group FL，levels of NO and NOS in FM and FH groups decreased significantly（P＜0.05）；levels of GSH-Px increased significantly（P＜0.05）；compared with group FM，levels of NO，NOS in FH group were decreased significantly（P＜0.05）；level of GSH-PX was increased significantly（P＜0.05）.2）Compared with group N，aortic endothelia cells were disordered and glomenrulus were enlarged and deformed，compared with group FO，morphology changes were improved in ginseng treatment groups.Conclusion: Certain anti-oxidative capability is shown to restrain oxidative stress in ginsenoside，which can play a critical role in treating vascular disease caused by high blood-glucose fluctuation.

【Key words】Ginsenoside，High blood；Glucose fluctuation rat，Oxidative stress，Vascular disease

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0064-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.022

*基金項目：浙江省中醫(yī)藥管理局項目（2014ZA045）

通信作者△（電子郵箱：695308609@qq.com）

收稿日期（2015-07-28）