白建民　時偉峰　時偉紅　郭萬周　高菲　蘇方靜（.南陽醫(yī)學高等專科學校，河南　南陽　473000；.南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院，河南　南陽　473000）

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術砂豆仁湯對UC模型大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響*

白建民1△時偉峰2時偉紅1郭萬周1高菲1蘇方靜1
（1.南陽醫(yī)學高等?？茖W校，河南南陽473000；2.南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院，河南南陽473000）

【摘要】目的觀察術砂豆仁湯對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎大鼠的血清白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10 （IL-10）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。方法健康SD雄性大鼠40只，隨機分為4組，即正常組、模型組、SASP組、術砂豆仁湯組。采用5%的2、4、6-三硝基苯磺酸（TNBS）125 mg/kg乙醇灌腸法建立潰瘍性結腸炎大鼠模型，光鏡觀察大鼠結腸組織病理形態(tài)并評分，用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平。結果模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量均高于正常組（均P＜0.01），而IL-10含量低于正常組（P＜0.01）；術砂豆仁湯組血清IL-6、TNF-α水平均較模型組降低（P＜0.01），IL-6含量則顯著升高（P＜0.01）。結論術砂豆仁湯可降低血清IL-6、TNF-α含量，提高IL-10含量，這可能是其治療UC作用機理之一。

【關鍵詞】潰瘍性結腸炎術砂豆仁湯TNF-α IL-10 IL-6

潰瘍性結腸炎（UC）是一種腸道非特異性炎癥性疾病，其病因及發(fā)病機制尚不明確，該病纏綿愈，易復發(fā)，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為現(xiàn)代難治病之一。中醫(yī)學認為本病以脾腎陽虛為本，濕邪阻滯為標?！捌⑻摑駝?、腎陽虛損”為本病的根本病機，而術砂豆仁湯具有健脾化濕、溫陽止瀉之功。本研究通過觀察術砂豆仁湯對三硝基苯磺酸乙醇溶液誘導的UC模型大鼠結腸組織形態(tài)學及血清白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的影響，從而評價術砂豆仁湯治療UC的療效及作用機制，為其臨床應用及開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性SD大鼠，鼠齡3～4個月，體質(zhì)量（200±20）g，共60只，由南陽實驗動物中心提供。

1.2試藥與儀器術砂豆仁湯:白術20 g，蒼術20 g，蠶砂10 g，益智仁15 g，薏苡仁15 g，炒扁豆15 g，甘草4 g組成（以上藥材購自南陽醫(yī)專附屬中醫(yī)院中藥房，經(jīng)南陽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系中藥鑒定教研室姚學文副教授鑒定，符合2010版《中國藥典》相關規(guī)定）。水煮法（按上處方稱取藥，水煎煮2次，第1次加10倍量水煎煮60 min，第2次加8倍量水煎煮40 min，合并2次濾液，制成濃縮液），濃縮至生藥含量為2 g/L的溶液。KDC-220HR高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；AEL-160電子分析天平（日本島津公司）；U-2900型可見-紫外分光光度計（日本日立公司）；XK96-A/B型快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）；酶標儀控制及管理系統(tǒng)（鄭州安圖生物工程有限公司）。5%2，4，6-三硝基苯磺酸（Simga-Aldrich Chemical Co.）；柳氮磺胺吡啶（SASP，上海三維制藥有限公司）；大鼠白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3分組與造模60只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取10只作為正常組。其余大鼠禁食24 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，將長12 cm，直徑2 mm的乳膠灌腸管由肛門緩緩插入結腸約8 cm，將0.5 mL灌腸液（含20 mg TNBS的30%乙醇）緩緩注入結腸后，提起大鼠尾部，倒置30 s，捏緊肛門，平躺5 min，自然清醒，常規(guī)飼養(yǎng)。造模1周后（大鼠出現(xiàn)腹瀉、黏液膿血便后，隨機抽取實驗大鼠3只剖腹截取直腸和結腸，肉眼觀察結腸黏膜充血水腫情況，確定造模成功）將模型動物隨機分為3組，即模型組、SASP組（0.3 mg/kg）、術砂豆仁湯組，每組10只。持續(xù)灌胃給藥5周，術砂豆仁湯組給予術砂豆仁湯（含生藥量20 mg/kg）；SASP組給予SASP（0.3 mg/kg），正常組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4觀察指標每天定時觀察各組大鼠精神狀況、進食、活動、大便等變化，并記錄。末次給藥24 h內(nèi)，禁食不禁水，脫頸椎法處死大鼠，取全血標本4～5 mL于干燥試管中，離心機以4000 r/min離心10 min，取血清，置于-20℃冰箱內(nèi)凍存，即為待測標本。立即剖腹，分離結腸，自肛門2 cm處向上取結腸6～8 cm，沿腸系膜緣剪開腸腔，用4℃0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，將腸黏膜層向上平鋪并固定于觀察臺，立即進行肉眼結腸大體形態(tài)損傷評分［1］。取結腸中病變最嚴重處，取一部分用4%多聚甲醛固定樣本，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ水平檢測:待測標本，放于4℃冰箱內(nèi)自然解凍，嚴格按照ELISA試劑盒說明測定大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-ɑ含量。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以表示，組間差異的顯著性檢驗運用軟件提供的非參數(shù)檢驗和單因素方差分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠一般情況比較見表1。正常組大鼠神態(tài)安逸，背毛光亮，活動敏捷，飲食量大，大便呈顆粒狀，肛周清潔。造模成功后，模型大鼠均出現(xiàn)精神萎靡，嗜臥扎堆，背毛豎起無光澤，食量減少，體質(zhì)量下降，稀便、血便或隱血試驗陽性等表現(xiàn)。治療后，術砂豆仁湯組和SPAS組癥狀均逐漸好轉，大體評分明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.0），與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　各組一般情況及DAI評分比較

表1　各組一般情況及DAI評分比較

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　DAI評分　大體評分術砂豆仁湯組　10　0.42±0.31**　4.82±1.13**正常組　10　0±0　0±0模型組　10　7.23±0.61△△　8.32±1.10△△SASP組　10　1.33±0.21**　5.34±1.02*

2.2各組大鼠大體形態(tài)觀察和損傷評分見表1。正常組大鼠結腸壁薄而光滑，黏膜色澤淡紅，皺襞清晰完整，腸壁與周圍組織無黏連。模型組大鼠結腸部分黏膜充血水腫、糜爛，嚴重者見潰瘍形成，潰瘍呈白線條狀或灶狀，腸壁與周圍組織黏連，腸腔變窄；術砂豆仁湯組、SASP組結腸大體形態(tài)均逐漸恢復正常，潰瘍基本愈合，腸壁增厚或形成瘢痕，無黏連，其DAI評分明顯低于模型組（P＜0.01）。

2.3各組大鼠光鏡下病理改變見圖1。造模后，模型大鼠結腸黏膜上皮水腫、壞死、脫落，固有層模糊，黏膜下層甚至肌層有大量炎性細胞浸潤，潰瘍形成，間質(zhì)層有嗜中性和嗜酸性粒細胞，黏膜下層有大量結締組織增生、其間有大量中性粒細胞等炎癥細胞浸潤。SASP

圖1　各組結腸組織病理切片圖（HE染色，200倍）

組大鼠結腸黏膜層部分恢復，潰瘍灶可見大量炎性細胞，腺體間可見少量纖維結締組織，但腺體開口大小不一致，排列不整齊，有散在的杯狀細胞；上皮細胞內(nèi)胞漿仍有水腫、溶酶體稍多。術砂豆仁湯組潰瘍基本愈合，杯狀細胞減少，結締組織增生并纖維化。

2.4各組大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較見表2。與正常組相比，模型組IL-6、TNF-α含量顯著升高（均P＜0.01），IL-10含量顯著降低（P＜0.01）。術砂豆仁湯組能顯著降低IL-6、TNF-α含量（P＜0.01），提高IL-10含量（P＜0.01），與SASP組相比，無明顯差異（P＞0.05）。

表2　各組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

表2　各組大鼠IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

組別　n　IL-6術砂豆仁湯組　10 123.1±14.4**正常組　10　93.4±9.1模型組　10 171.5±16.4△△SASP組　10 121.0±12.1**IL-10　TNF-α 71.3±4.8**　32.64±9.32 87.6±8.5　31.39±9.27 39.5±4.6△△　78.87±8.89 69.1±5.0**　35.36±8.29

3　討論

UC屬中醫(yī)學泄瀉之范疇，“脾虛濕勝，腎陽虛損”是本病病機之根本。腎為五臟之本，脾陽根于腎陽，腎為胃關，開竅于二陰，腎虛無以溫煦脾陽，則脾失健運，水濕內(nèi)停；反之，脾陽久虛，損及腎陽，致脾腎陽虛和而為病。據(jù)此，在《醫(yī)宗必讀》治瀉九法的基礎上，定“燥脾溫腎”之法，立術砂豆仁湯為方。方中白術益氣健脾，溫燥寒濕；蒼術為燥濕健脾之要藥。蒼術苦溫辛烈，燥濕力勝，散多于補，偏于平胃燥濕；白術甘溫性緩，健脾力強，補多于散，善于補脾益氣。二藥合用，則脾胃納運如常。蠶砂具有和胃化濁，祛風除濕之功；炒扁豆健脾化濕，和中益氣；薏苡仁健脾利濕而不留邪；益智仁溫脾、暖腎、固氣；甘草補中益氣，調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏溫腎健脾、和中益氣、化濕止瀉之功效。

現(xiàn)已證實，促炎細胞因子如IL-6、TNF-α是公認的能介導UC發(fā)病的細胞因子，而IL-10在維護腸道正常免疫功能中起重要作用［1-3］。IL-6主要生物作用是趨化并激活中性粒細胞，促進中性粒細胞的溶酶體活性和吞噬作用，故IL-6在炎癥反應中起著直接的介導作用［4-5］。TNF-α是介導和調(diào)節(jié)免疫炎癥反應的多肽分子，是目前已知的與UC發(fā)病關系最為密切的細胞因子。TNF-α可誘導NO合成酶異構體，使NO生成增多，加重細胞黏膜損傷，亦可協(xié)同干擾素γ改變腸道上皮的屏障功能，誘導腸上皮細胞的凋亡［6-8］。還可誘導凝血酶形成，減少血栓調(diào)節(jié)素釋放，導致黏膜微循環(huán)障礙，加重黏膜損傷。IL-10又名細胞因子合成抑制因子，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，是一種強有力的抗炎和免疫抑制性細胞因子。它既可抑制激活單核細胞、巨噬細胞、粒細胞，限制中性粒細胞產(chǎn)生；又可抑制單核/巨噬細胞產(chǎn)生趨化因子，抑制中性粒細胞及巨噬細胞的趨化性，減少其向炎癥部位聚集。研究表明［9-10］，人IL-10能在mRNA上有效抑制活化的單核細胞產(chǎn)生IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子。可見，IL-10可緩解腸黏膜炎癥反應，減輕損傷組織，利于組織的重建和修復。

本研究表明，術砂豆仁湯治療結腸炎具有潛在實用價值，但其作用機制還有待進一步研究。

參考文獻

［1］馬文軍.馬齒莧水煎劑對潰瘍性結腸炎小鼠TNF-α影響的實驗研究［D］.咸陽:陜西中醫(yī)學院，2011.

［2］李琪佳，徐敏，宮思聰.細胞因子與潰瘍性結腸炎［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志，2010，4（2）:411-412.

［3］鐘振東，熊永愛，楊玲.苦參堿對潰瘍性結腸炎大鼠腸粘膜細胞因子和自由基的影響［J］.中國醫(yī)藥生物技術，2011，6 （4）:251-254.

［4］原皓，吳克香，史有奎，等.甘草酸二銨對潰瘍性結腸炎大鼠促炎細胞因子IL-6、IL-8、TNF-α的影響［J］.山東醫(yī)藥，2006，46（31）:5-6.

［5］熊永愛.愈腸寧分釋膠囊治療潰瘍性結腸炎的藥效學及其機理研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學.2012.

［6］葛賀，孫丕東.TNF-α和SOD在潰瘍性結腸炎發(fā)病中活性變化的實驗探究［J］.臨床醫(yī)學，2007，20（1）:160-162.

［7］馬建華.腸必清栓對UC模型大鼠的治療作用及機制的實驗研究［D］.太原:山西醫(yī)科大學，2010.

［8］吳玉泓.久瀉靈顆粒劑治療潰瘍性結腸炎的實驗及臨床研究［D］.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學，2012.

［9］Grottrup Wolfers E，Moeller J，Karbach U，et al.Elevated cell-associated levels of interleukin1 β and interleukin-6 in inflamed mucosa of inflammatory bowel disease［J］.Eur J Cli Invest，2006，26:115.

［10］Campicri M，Gionchetti P.Bactcria as the cause of ulcerative colitis［J］.Gut，2001，48:132-135.

·研究報告·

·研究報告·

Effects of Zhusha Douren Tang on Serum Levels of IL-6，IL-10，TNF-α in UC Rat Model

BAI Jianmin，SHI Weifeng，SHI Weihong，et al.Nursing Department，Nanyang Medical College，Henan，Nanyang 473000，China.

【Abstract】Objective: To observe the effects of Zhusha Douren Tang on serum levels of IL-6，IL-10，TNF-α in ulcerative colitis rat model.Methods: Forty healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups，namely the normal control group，the model group，SASP group and Zhusha Douren Tang group.5%2，4，6-trinitro-benzene-sulfonic acid（TNBS）125mg and ethanol enema method was used to set up ulcerative colitis rat model，the rat colon tissue pathological morphology was observed and assessed with light microscopy.Serum levels of IL-6，TNF，and IL-10 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results: The serum levels of IL-6 and TNF-α of the model group were higher than those of the normal control group（P＜0.01 or P＜0.01），but the serum level of IL-10 in the model group was lower than that in normal control group（P＜0.01）；the serum levels of IL-6 and TNF-α in the Zhusha Douren Tang group were lower than those of the model group（P＜0.05，P＜0.01）and the level of IL-6I/IL-10 increased significantly（P＜0.01）.Conclusion:Zhusha Douren Tang can reduce the serum level of IL-6，TNF-α and improve the level of IL-10，which may be one of the mechanisms in the treatment of UC.

【Key words】UC（ulcerative colitis）；Zhusha Douren Tang；TNF-α；IL-10；IL-6

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0058-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.020

*基金項目：河南省南陽市科技攻關計劃項目（2014GG048）

通信作者△（電子郵箱：nyyzbjm@126.com）

收稿日期（2015-10-11）