吳中華

(安徽省生物研究所，安徽 合肥　230088)

Triton X-114用于去除內(nèi)毒素的研究

吳中華

(安徽省生物研究所，安徽 合肥230088)

摘要：目的探討規(guī)?；a(chǎn)原核表達重組蛋白的Triton X-114去除細菌內(nèi)毒素的方法與效果。方法以大腸桿菌表達的重組人干擾素α2b、重組人生長激素、重組葡激酶蛋白粗提液為原料，采用反復(fù)抽提相分離法，研究Triton X-114去除細菌內(nèi)毒素的效果。結(jié)果經(jīng)一次Triton X-114抽提，能夠去除蛋白粗提液中95%的細菌內(nèi)毒素，蛋白收率保持85%以上，蛋白性質(zhì)不受影響。結(jié)論Triton X-114反復(fù)抽提相分離法能夠有效地去除細菌內(nèi)毒素，適合于規(guī)?；酥亟M蛋白的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：洗滌劑；內(nèi)毒素類；重組蛋白質(zhì)類/分離和提純

大腸桿菌因其遺傳背景清晰、操作簡便、表達量高，是大量制備結(jié)構(gòu)簡單、不需要糖基化的重組蛋白的首選表達系統(tǒng)[1]。在利用大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)治療性重組蛋白時，在破碎細菌獲得蛋白的同時細胞壁內(nèi)的內(nèi)毒素及生產(chǎn)操作產(chǎn)生的內(nèi)毒素大量釋放到蛋白溶液中[2-3]，內(nèi)毒素的去除是建立純化工藝時必須考慮的關(guān)鍵問題。細菌內(nèi)毒素的主要成分是脂多糖(LPS)，呈弱酸性，其等電點在6.0左右，與很多種蛋白的等電點接近；而且脂多糖能夠與某些堿性蛋白形成復(fù)合體，常規(guī)除去內(nèi)毒素的方法有超濾、柱層析、離子交換分離技術(shù)[4-6]，但由于內(nèi)毒素固有的生物特性，使得這些方法具有一定的局限性。

1990 年，Aida 等[7]首次報道了用Triton X-114 液相分離法去除重組蛋白溶液中內(nèi)毒素的方法，此后陸續(xù)有研究采用此方法來去除生物制品中的內(nèi)毒素， Triton X-114在生物制品生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用前景[8-10]。

Triton X-114是一種非離子型表面活性劑，具有較低的臨界膠束濃度，在4 ℃能和水溶液互溶，并與脂多糖分子結(jié)合，25 ℃以上能攜帶脂多糖分子從水相中析出。利用Triton X-114的這一性質(zhì)，我們研究了適合于規(guī)?；亟M蛋白生產(chǎn)的Triton X-114相分離去除細菌內(nèi)毒素的方法和效果。

1材料與方法

1.1材料重組人干擾素α2b(rhIFNα2b)、重組人生長激素(rhGH)、重組葡激酶(rSak)的基因工程菌均由安徽安科生物工程(集團)公司研發(fā)中心保存。Triton X-114(純度≥99%)購自SIGMA公司。發(fā)酵用蛋白胨和酵母提取物為OXOID產(chǎn)品。鱟試劑和內(nèi)毒素檢查用水均為湛江博康海洋生物有限公司產(chǎn)品(批號分別為1311260、1312050)，鱟試劑靈敏度由安徽省食品藥品檢驗所再標定，0.25 EU·mL-1；細菌內(nèi)毒素標準品購自中國藥品生物制品檢定院(批號1306151)。其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純級。各種層析填料購自Pharmacia公司，α干擾素單克隆抗體親和層析膠安徽安科公司研制制備。

1.2蛋白粗提液的制備菌體破碎前用生理鹽水洗滌2次。rhIFNα2b為可溶性表達，200 g菌體用1 000 mL 20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮后經(jīng)高壓勻漿法破碎，15 000 g離心15 min后，上清即為蛋白粗提液。

rhGH為胞周質(zhì)分泌型表達，200 g菌體用500 mL 含10%蔗糖的20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮30 min，6 000 g離心10 min菌體再用4 000 mL去離子水懸浮30 min，1 000 g連續(xù)流離心收集流出液，超濾濃縮至1 000 mL。

rSak為包含體方式表達，400 g菌體用600 mL 20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液懸浮后經(jīng)高壓勻漿法破碎，15 000 g離心10 min，棄上清。沉淀分成兩份,分別用600 mL含0.5% Triton X-110和0.5%Triton X-114的磷酸鹽緩沖液充分懸浮洗滌，重復(fù)3次，得rSak包含體，比較兩種洗滌方式對蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響。包含體用8 000 mL 6 mol·L-1鹽酸胍溶解后對20 mmol·L-1pH7.0 磷酸鹽緩沖液充分透析，15 000 g離心15 min后，上清用pH7.0 磷酸鹽緩沖液定容至1 000 mL，即為蛋白粗提液。

1.3Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素的操作步驟為：在蛋白粗提液中加入1% Triton X-114，4 ℃磁力攪拌60 min，充分混溶；30 ℃水浴中放置40 min，不時攪拌；25 ℃ 15 000 g離心15 min，小心移出上層水相。Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素試驗，進行兩個循環(huán)；提取過程中所用的玻璃器皿250 ℃烘烤45 min以上，塑料離心管用0.5 mol·L-1的NaOH浸泡1 h然后用注射用水洗涮干凈。

Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素工藝過程中，Triton X-114的加入量(1%)、4 ℃磁力攪拌時間(60 min)和30 ℃水浴時間(40 min)這一參數(shù)組合值，是以小量rhIFNα2b蛋白粗提液為樣品，采用正交試驗法測定這三種因子不同水平的組合對內(nèi)毒素去除率(E%)、蛋白回收率(P%)的綜合影響，而最終確定的。

1.4內(nèi)毒素含量測定和蛋白定量及性質(zhì)鑒定內(nèi)毒素含量的測定按《中國藥品檢驗標準操作規(guī)程》(2010版) 凝膠半定量法檢測；蛋白定量采用Lowry法[11]。

抽提以后的蛋白粗提液進行純化，注意觀察目標蛋白在層析過程中的柱行為。最終的純化樣品，除測定內(nèi)毒素含量以外，SDS-PAGE鑒定純度，rhIFNα2b用細胞病變抑制法測定其抗病毒活性，rSak用平板溶圈法測定其纖維蛋白溶解活性，rhGH用高效液相色譜法測定保留時間[12]。

1.5Triton X-114對鱟試劑靈敏度的影響采用內(nèi)毒素標準品，分別用內(nèi)毒素檢查用水配制成0.01%、0.1%的Triton X-114溶液，將內(nèi)毒素標準品配制成1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 EU·mL-1梯度溶液，內(nèi)毒素標準品溶解后，在旋渦混合器上混合15 min，以后每一步稀釋前最少混合30 s[13]，各取0.1 mL加入含0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管，混勻后37 ℃保溫(60±2)min，倒置反應(yīng)管觀察凝固情況。

2結(jié)果

2.1Triton X-114和Triton X-110洗滌包含體對蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響提取rSak包含體，分別采用含0.5% Triton X-110或0.5% Triton X-114的磷酸鹽緩沖液洗滌包含體，復(fù)性以后蛋白粗提液中的內(nèi)毒素含量分別為12 500～25 000 EU·mg-1和7 500～15 000 EU·mg-1， Triton X-114洗滌較Triton X-110洗滌內(nèi)毒素下降明顯，蛋白濃度分別為5.64和5.89 g·L-1，差異無統(tǒng)計學意義。

2.2Triton X-114的加入量、4℃磁力攪拌時間和30℃水浴時間對內(nèi)毒素去除率、蛋白回收率的影響參考已有文獻的數(shù)據(jù)，正交試驗設(shè)計為：Triton X-114的加入量(V/V,%)設(shè)0.5%、1%和2%三個水平，4 ℃磁力攪拌時間設(shè)30、60和90 min，30℃水浴時間設(shè)20、40和60 min，對內(nèi)毒素去除率(E)和蛋白回收率(P)的影響結(jié)果見表1。

表1　Triton X-114加入量、4 ℃磁力攪拌時間和30 ℃水浴時間對內(nèi)毒素去除率、蛋白回收率的影響

綜合考慮內(nèi)毒素去除率和蛋白回收率，確定Triton X-114加入量、4 ℃磁力攪拌時間和30 ℃水浴時間最佳水平組合為1%、60 min和40 min。

2.3Triton X-114相分離法去除細菌內(nèi)毒素的效果蛋白粗提液經(jīng) Triton X-114反復(fù)抽提2次，rhIFNα2b、rhGH、rSak第一次抽提內(nèi)毒素下降95%以上，第二次抽提內(nèi)毒素下降98%以上，測定結(jié)果見表2。

2.4Triton X-114抽提對蛋白含量和性質(zhì)的影響Triton X-114抽提前后，用Lowry法測定蛋白濃度，根據(jù)溶液體積及濃度的變化計算重組蛋白的回收率，rhIFNα2b、rhGH、rSak第一次抽提蛋白回收率85.5%以上，第二次抽提蛋白回收率85.6%以上，結(jié)果見表3。

注：泳道1：分子量標記 ( 99.7ku,66.2 ku,45.0 ku,31.0 ku,20.5 ku,14.4 ku )；泳道2：rhIFNα2b 粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道3：rhIFNα2b 粗提液經(jīng)未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品； 泳道4：rhGH粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道5：rhGH粗提液未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道6：rSak粗提液經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品；泳道7：rSak粗提液未經(jīng)Triton X-114抽提后的純化樣品。

圖1純化后重組蛋白電泳圖

2.5蛋白性質(zhì)鑒定Triton X-114抽提后，蛋白粗提液進行純化，發(fā)現(xiàn)在層析過程中三種蛋白的柱行為沒有任何變化，純化后目標蛋白純度(圖1)、純化過程中蛋白收率都與原工藝相當。純化以后，三種重組蛋白的內(nèi)毒素含量均低于0.125 EU·mg-1，與文獻報道一致[14]；rhIFNα2b抗病毒活性為1.2×108IU·mg-1， rSak的纖維蛋白溶解活性4.0×104RU·mg-1，與未經(jīng)Triton X-114抽提的純化樣品相比較沒有下降；rhGH RP-HPLC保留時間不變。

2.6Triton X-114對鱟試劑靈敏度的影響0.01% 和0.1% 的Triton X-114，使得鱟試劑的靈敏度從0.2～0.3 EU·mL-1分別下降至0.6～0.7 EU·mL-1和0.7～0.8 EU·mL-1。試驗結(jié)果見表3。

3討論

3.1Triton X-114洗滌包含體對蛋白粗提液中內(nèi)毒素含量的影響包含體是大腸桿菌高效表達外源蛋白一種常見的形式。除重組蛋白外，包含體中還有核糖體蛋白和RNA、其它來源的雜蛋白以及內(nèi)毒素組分脂多糖等。包含體提取過程中的洗滌步驟，是用含有非離子表面活性劑(最常用的則是Triton X-110)的溶液，盡可能地去除細胞碎片和附著在包含體顆粒表層的一些雜質(zhì)。分別用含0.5%Triton X-110和0.5%Triton X-114洗滌液洗滌包含體，復(fù)性以后蛋白粗提液中的細菌內(nèi)毒素含量雖然存在一定的差異(12 500～25 000 EU·mg-1vs7 500～15 000 EU·mg-1)，但效果并不十分顯著。這是因為包含體的結(jié)構(gòu)十分致密，包裹于其內(nèi)部的內(nèi)毒素分子在洗滌過程中無法去除。

3.2Triton X-114相分離法去除細菌內(nèi)毒素的效果本研究結(jié)果顯示，采用Triton X-114相分離法，一次抽提就可以去除95%以上的細菌內(nèi)毒素，顯著降低重組蛋白溶液中的內(nèi)毒素含量。仔細分析數(shù)據(jù)還可以發(fā)現(xiàn)，在rhIFNα2b和rhGH的第二輪抽提、rSak的兩輪抽提過程中，內(nèi)毒素含量降低的幅度都在98%以上。這一結(jié)果，與文獻報道的基本一致[15]。Triton X-114相分離法去除內(nèi)毒素的效果，顯然與蛋白溶液中內(nèi)毒素的含量、Triton X-114的加入量都有關(guān)系。實際上，在本研究進行的過程中，我們也實驗證實了在一定的濃度范圍內(nèi)，Triton X-114 的加入量與內(nèi)毒素的去除效果呈正相關(guān)(結(jié)果未顯示)。我們選擇1%的Triton X-114加入量，是基于內(nèi)毒素去除效果和蛋白回收率兩方面的綜合考慮。因為在抽提過程中，蛋白溶液的濃度基本不會變化，但蛋白溶液的體積會減少，而且減少的幅度與Triton X-114的加入量成正比。本研究所采用的Triton X-114相分離抽提方法，蛋白收率在85%以上。抽提溶液離心以后，雖然下層有機相和上層水相之間界面清晰，但在移出上清溶液時為了確保下層Triton X-114不流出而導(dǎo)致污染，這一步驟樣品損失明顯。如果能在該步驟上做技術(shù)性改進，則整個抽提過程的蛋白回收率會大幅度提高。而蛋白收率的提高，才能使得反復(fù)抽提成為可能。

表2　Triton X-114抽提去除內(nèi)毒素的效果

表3　Triton X-114抽提對蛋白含量的影響

表3　Triton X-114對鱟試劑靈敏度的影響

注：+:凝固(陽性)-:未凝固(陰性)。

Triton X-114本身為一種非離子性表面活性劑，不會對蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生影響，重組蛋白只要能耐受Triton X-114抽提過程中的溫度條件，則都能適用于Triton X-114相分離技術(shù)以去除內(nèi)毒素。

3.3Triton X-114對鱟試劑靈敏度的影響采用相分離法去除內(nèi)毒素，上層水相蛋白溶液中總會殘留有極少量或者微量的Triton X-114。這些Triton X-114殘留，是否會嚴重地干擾鱟試劑法測定內(nèi)毒素的試驗結(jié)果？本研究設(shè)計了一項試驗，驗證Triton X-114對鱟試劑靈敏度的影響，結(jié)果表明，0.01% 和0.1% 的Triton X-114，使得鱟試劑的靈敏度降低，從0.2～0.3 EU·mL-1分別下降至0.6～0.7 EU·mL-1和0.7～0.8 EU·mL-1。

0.01% 和0.1%的 Triton X-114使鱟試劑的靈敏度降低了2～4倍， 而Triton X-114抽提前后內(nèi)毒素水平則相差20～50倍(95%～98%)；將內(nèi)毒素的去除與重組蛋白的純化工藝結(jié)合，初始濃度為1% Triton X-114，經(jīng)提取、透析、層析或離子交換等處理，殘留量可降至1 mg·L-1以下[14]，其最終測定液中的Triton X-114濃度遠遠地低于0.01%。由此可以得出結(jié)論，最終純化樣品中 Triton X-114殘留對鱟試劑的靈敏度基本無影響，但Triton X-114抽提去除細菌內(nèi)毒素的效果是不容置疑的。

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Removal of endotoxin by Triton X-114 phase separation

WU Zhong-hua

(BiologicalResearchInstitute,Hefei,Anhui230088,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate an effective method to remove endotoxin with Triton X-114 phase separation for E.coli recombinant protein purifications.MethodsTriton X-114 phase separation was used to remove endotoxin from crude preparations of recombinant human interferon α2b,human growth hormone,and staphylokinase.ResultsThe reduction in endotoxin levels was greater than 95% with Triton X-114 phase separation,and recovery of the proteins after endotoxin removal was greater than 85%,meanwhile the characteristics of recombinant proteins did not change.ConclusionsTriton X-114 phase separation is a kind of effective method to remove endotoxin for large-scale E.coli recombinant protein purifications.

Key words:Detergents；Endotoxins；Recombinant Proteins/isolation & purification

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.009

(收稿日期：2015-12-15，修回日期：2016-03-08)