卜　偉，臧恒昌

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南　250012；2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽 合肥　230088)

肝豆片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改進(jìn)研究

卜偉1,2，臧恒昌1

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南250012；2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽 合肥230088)

摘要：昌目的增加對(duì)肝豆片處方中藥材質(zhì)量控制方法，全面提高肝豆片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，更有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。方法建立高效液相色譜法對(duì)處方中君藥大黃進(jìn)行含量測(cè)定，并對(duì)處方中臣藥黃連、金錢草建立薄層色譜鑒別方法。結(jié)果黃連鑒別以甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶1.5∶3∶1.5∶0.5)為展開劑，以濃氨水作為飽和溶液，置紫外燈365 nm下檢視；金錢草鑒別以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑，以3%三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，置紫外燈365 nm下檢視；大黃含量測(cè)定大黃素在8.48～25.44 mg·L-1的濃度范圍，峰面積A與濃度C呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，回收率為95.8%，RSD=0.8%(n=6)。結(jié)論方法準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到改進(jìn)。

關(guān)鍵詞：大黃素;色譜法,高壓液相;色譜法,薄層;黃連堿;金錢草;質(zhì)量控制

肝豆片主要由大黃、黃連、金錢草等六味中藥組成。具有清熱解毒，通腑利濕功效。臨床上主要用于治療肝豆?fàn)詈俗冃?。肝豆片?duì)改善患者構(gòu)音障礙、肌強(qiáng)直、震顫等癥狀具有一定作用，避免了金屬絡(luò)合劑驅(qū)銅治療易產(chǎn)生的過敏反應(yīng)、骨髓抑制、腎臟損害及類紅斑狼瘡等副作用[1]。

目前,肝豆片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(安徽省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為皖Q/WS-ZJ(Z-005)-2012)僅對(duì)處方中的大黃、三七進(jìn)行鑒別，缺少定量分析方法，且處方中其他藥材缺乏質(zhì)量控制手段，因此，有必要對(duì)該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)，以更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。本文通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)該處方中君藥大黃建立含量測(cè)定方法，結(jié)果表明此方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠；同時(shí)對(duì)處方中臣藥黃連、金錢草建立薄層色譜鑒別方法，結(jié)果表明該方法可行、有效、專屬性好。通過這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)，有效地提升了肝豆片質(zhì)量控制水平。

1儀器和試劑

1.1儀器Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀(島津)、LCsolutions(島津)、電子分析天平(梅特勒-托利多)、超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯有限公司)、硅膠G薄層板。

1.2試劑含量測(cè)定項(xiàng)中甲醇為色譜純；鹽酸小檗堿、槲皮素、山奈素、大黃素為對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院)；供試品為肝豆片(合肥立方制藥股份有限公司自制)；其余試劑均為分析純；水為二次蒸餾(自制)。

2肝豆片中黃連的鑒別

2.1方法的建立查閱相關(guān)資料[2-4]，并參照《中國(guó)藥典》2010版一部“黃連上清片”及“黃連”項(xiàng)下黃連鑒別方法[5]初步選定本品中黃連的鑒別方法，并對(duì)其中的展開劑進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果見表1。

結(jié)合以上展開劑優(yōu)選的結(jié)果，初步確定本品中黃連的鑒別方法如下：(1)供試品溶液制備：取本品粉末1.2 g,加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。(2)對(duì)照品溶液制備：稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品2.0 mg，加甲醇4 mL溶解作為對(duì)照品溶液。

檢測(cè)方法：照薄層色譜(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)法測(cè)定，吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-異丙醇-乙酸乙酯-甲醇-水(6∶1.5∶3∶1.5∶0.5)為展開劑,另一槽加入等體積的濃氨水,預(yù)飽和10 min后,展開，取出，晾干，置紫外燈365 nm下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2方法的驗(yàn)證

2.2.1專屬性(1)陰性對(duì)照溶液：取陰性對(duì)照樣品(按處方比例和處方工藝制備不加黃連)1.2 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為陰性對(duì)照溶液。(2)供試品溶液：取本品1.2 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。(3)對(duì)照品溶液制備：稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品2.3 mg，加甲醇4 mL溶解作為對(duì)照品溶液。

分別吸取上述溶液各1 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按“2.1”項(xiàng)中建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，陰性對(duì)照色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無任何斑點(diǎn)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，其他位置斑點(diǎn)與主斑點(diǎn)分離完全。表明制劑中其他組分對(duì)黃連的鑒別無干擾，所建立的鑒別檢驗(yàn)方法專屬性較好。薄層圖譜見圖1。

2.2.2耐用性分別選用青島海洋化工廠分廠、煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司三家薄層板的廠家進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，所獲得的薄層圖譜分離度均較好、主斑點(diǎn)斑型集中。同時(shí)對(duì)點(diǎn)樣方式分別采用圓點(diǎn)狀和窄細(xì)條帶狀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明點(diǎn)樣方式對(duì)薄層圖譜的分離度影響較小。

3肝豆片中金錢草的鑒別

3.1方法的建立查閱相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，并參照《中國(guó)藥典》2010版一部“金錢草”項(xiàng)下鑒別方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取本品進(jìn)行薄層色譜鑒別，薄層色譜中斑點(diǎn)清晰、分離度較好、斑型集中，故按照此方法建立本品中金錢草的鑒別方法，方法如下。

3.1.1供試品溶液的制備取本品粉末4.5 g，加80%甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，棄去乙醚液，水液加稀鹽酸10 mL，置水浴中加熱回流1 h，取出，冰浴10 min后，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水30 mL洗滌，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

3.1.2對(duì)照品溶液的制備另取槲皮素對(duì)照品、山奈素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg的混合溶液，作對(duì)照品溶液。

3.1.3檢測(cè)方法照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)測(cè)定，吸取供試品溶液3 μL，對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，在105℃加熱數(shù)min，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

表1　黃連鑒別方法展開劑優(yōu)選結(jié)果

3.2方法的驗(yàn)證

3.2.1專屬性(1)陰性對(duì)照溶液制備：取陰性對(duì)照樣品(按處方比例和處方工藝制備不加金錢草)4.5 g，按照上述供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。(2)供試品溶液制備：取本品4.5 g，按照變上述供試品溶液制備方法制備供試品溶液。(3)對(duì)照品溶液制備：稱取槲皮素對(duì)照品2.51 mg、山奈素對(duì)照品2.55 mg，置5 mL容量瓶中。加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

分別吸取上述三種溶液，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按“3.1”項(xiàng)中建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，對(duì)照品色譜中，兩個(gè)主斑點(diǎn)清晰可辨，分離完全。陰性對(duì)照色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，無任何斑點(diǎn)。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，其他位置斑點(diǎn)與主斑點(diǎn)分離完全。制劑中其他組分對(duì)金錢草的鑒別無干擾，所建立的鑒別檢驗(yàn)方法專屬性較好。薄層圖譜見圖2。

注：1.缺味陰性樣品；注：1.缺味陰性樣品；

2.鹽酸小檗堿對(duì)照品; 2.槲皮素和山奈素混合對(duì)照品;

3.肝豆片供試品。3.肝豆片供試品。

圖1黃連TLC圖圖2金錢草TLC圖

3.2.2耐用性分別選用青島海洋化工廠分廠、煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司三家薄層板的廠家進(jìn)行鑒別實(shí)驗(yàn)，所獲得的薄層圖譜分離度均較好、主斑點(diǎn)斑型集中。同時(shí)對(duì)點(diǎn)樣方式分別采用圓點(diǎn)狀和窄細(xì)條帶狀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明點(diǎn)樣方式對(duì)薄層圖譜的分離度影響較小。

4含量測(cè)定

4.1標(biāo)準(zhǔn)限度的確定統(tǒng)計(jì)分析歷年來采購(gòu)的大黃素在大黃藥材與肝豆片制劑中含量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，結(jié)果見表2,并結(jié)合大黃藥材中大黃素的內(nèi)控指標(biāo)，藥典中其他類似品種的含量限度及自身測(cè)定的結(jié)果，制定本品的含量限度。

表2　大黃藥材與肝豆片藥材含量對(duì)應(yīng)關(guān)系

大黃素含量比例(制劑/藥材)平均值為0.25，大黃藥材中大黃素內(nèi)控指標(biāo)為0.11%，折算制劑中大黃素限度為0.0275%，折合每片含大黃素0.124 mg，并參考藥典中其他類似品種限度，將本品限度定為：本品每片含大黃以大黃素(C15H10O5)計(jì)，不得少于0.13 mg。

4.2方法的建立查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9-11]，并進(jìn)行相關(guān)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，最終建立本品的含量測(cè)定方法如下：

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2010版一部附錄ⅥD)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)性適用性試驗(yàn)：以十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)為流動(dòng)相；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 mm；柱溫：30℃；理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取大黃素對(duì)照品16 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取本品適量研細(xì)，取約2.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，置具塞錐形瓶中，水浴揮干溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次(10、10、15 mL)，合并三氯甲烷液置60℃水浴鍋上揮干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

測(cè)定法：分別精密吸取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。本品每片含大黃以大黃素(C15H10O5)計(jì)，不得少于0.13 mg。

4.3方法的驗(yàn)證

4.3.1專屬性(1) 空白溶劑：取溶劑甲醇，采用0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。(2) 陰性對(duì)照溶液：取陰性對(duì)照樣品(按處方比例和處方工藝制備不加大黃)2.7 g，按照上述供試品溶液的制備方法，制備陰性對(duì)照溶液。(3) 對(duì)照品溶液：精密稱取大黃素對(duì)照品16 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，取上述溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得。(4) 供試品溶液：取本品2.7 g，按照上述供試品溶液的制備方法，制備供試品溶液。

分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照“4.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，檢驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3肝豆片大黃素含量測(cè)定HPLC色譜圖

對(duì)照品溶液中大黃素色譜峰保留時(shí)間為11 min，空白溶劑色譜圖中在保留時(shí)間3.9 min有色譜峰，陰性對(duì)照色譜圖中在2.0、3.8、3.9 min有色譜峰，在與對(duì)照品主峰位置11 min無色譜峰；供試品溶液色譜圖中在相應(yīng)位置出現(xiàn)色譜峰，大黃素峰的理論板數(shù)為11 189，與相鄰位置色譜峰的分離度分別為8.63、6.63。

結(jié)果表明：溶劑及制劑中其他組分對(duì)大黃的含量測(cè)定無干擾，所建立的含量測(cè)定方法專屬性良好。

4.3.2線性與范圍精密稱取大黃素對(duì)照品16.96 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，分別精密量取上述溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL分別至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密量取上述5種溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(mg·L-1)對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，結(jié)果大黃素在8.48～25.44 mg·L-1的濃度范圍，峰面積A與濃度C呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 4。

4.3.3準(zhǔn)確度對(duì)照品溶液制備：精密稱取大黃素對(duì)照品16.96 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，取上述溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱取大黃素對(duì)照品(含量：98.7%)10.05 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密稱取已知大黃素含量(批號(hào)：141102，含量：0.50 mg·g-1)的供試品粉末0.8 g，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，其中三個(gè)錐形瓶中分別精密加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，另外三個(gè)錐形瓶中分別精密加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液4 mL，最后三個(gè)錐形瓶中分別精密加入上述對(duì)照品儲(chǔ)備液6 mL，再按照擬定的含量測(cè)定方法項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備即得。

精密吸取上述溶液各10 μL，注入液相色譜，按擬定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。結(jié)果表明：大黃素的平均回收率為97.2%>95%，說明本方法的準(zhǔn)確度良好。

4.3.4重復(fù)性精密稱取本品粉末2.7 g，共6份，按“4.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制備成6份供試品溶液。精密稱取大黃素對(duì)照品16 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，取上述溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。分別精密量取對(duì)照品溶液和供試溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試溶液的濃度，計(jì)算大黃素的測(cè)定濃度RSD(%)為1.9%，小于2.0%，說明本方法測(cè)定大黃素重復(fù)性較好。

表3　大黃素回收率檢查結(jié)果

4.3.5中間精密度照“重復(fù)性”項(xiàng)下操作，由不同人配制相同濃度的供試溶液，并由該操作者進(jìn)樣分析。按照變更后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法，測(cè)定供試溶液中大黃素的含量，計(jì)算RSD為0.8%，小于5.0%，說明此方法的中間精密度良好。

4.3.6穩(wěn)定性按照變更后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液和供試品溶液。按擬定的色譜條件在0、2、4、6、8、10、12、14、16和24 h進(jìn)樣，記錄其峰面積，對(duì)照品溶液和供試品溶液中大黃素峰面積的RSD分別為0.14%和0.64%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4.3.7耐用性條件參數(shù)變化對(duì)分析方法的影響將通過改變檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、柱溫、流動(dòng)相比例、更換不同廠家相同規(guī)格色譜柱評(píng)估?？疾熳儎?dòng)參數(shù)：檢測(cè)波長(zhǎng)分別為252、256 nm；流速分別為0.8、1.2 mL·min-1；柱溫分別設(shè)置為25℃、35℃；不同色譜柱型號(hào)：Welth XB C18250 mm×4.6 mm，5 μm;流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液(80∶20)，甲醇-0.1%磷酸溶液(90∶10)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，改變流速、更改色譜柱、改變流動(dòng)相比例、改變柱溫、改變波長(zhǎng)等條件，對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響較小，說明該方法的耐用性較好。

5討論

本方中君藥為大黃，主要利用其瀉下作用。以大黃素為本品的含量控制指標(biāo)，可以反映該制劑的質(zhì)量。本文中選取高效液相色譜法進(jìn)行大黃素的含量測(cè)定替代原有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中大黃的薄層鑒別，能更有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

本文參照了相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合藥典中類似品種的鑒別方法，并進(jìn)行相應(yīng)的改進(jìn)，建立了本品的黃連和金錢草的鑒別方法。斑型較好，分離完全，斑點(diǎn)清晰，專屬性較好，能夠排除其他成分的干擾。

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Study on the improvement of the quality standard of Gandou Tablets

BU Wei1,2,ZANG Heng-chang1

(1.SchoolofPharmaceuticalSciencesShandongUniversity,Ji′nan,Shandong250012,China；2.HefeiLifeonPharmaceuticalCo.,Ltd.,Hefei230088,China)

Abstract:ObjectiveIncrease in hepatic bean prescription medicines quality control methods,quality standards,improving liver beans more effectively control the quality of the products.MethodEstablish a high performance liquid chromatography determination of liver beans tablets in the content of rhubarb；Using thin-layer chromatography on identification of rhizoma coptidis,lysimachia christinae；Using high-performance liquid chromatographic method for the determination of emodin.ResultsThe identification of the identification of the root of the (6∶1.5∶3∶1.5∶0.5) was used as the solvent,and the concentration of the solution was in the light of the concentration of 365 nm;Hristina loosestrife herb with toluene ethyl formate and formic acid 10∶8∶1 as expansion agent,with 3% solution of aluminium chloride in ethanol as chromogenic agent,placed under ultraviolet light at 365 nm view;Emodin 8.48～25.44 mg·L-1concentration range,the peak concentration of area a and c presents a good linear relationships,the correlation coefficient is 0.999 4,the returns-ratio is 95.8%,RSD=0.8%(n=6).ConclusionThe method is accurate,rapid and with good reproducibility,the quality standards are improved.

Key words:Emodin;Chromatography,High Pressure Liquid;Chromatography,Thin Layer;Coptisine;Lysimachia Christinae;Quality Control

作者簡(jiǎn)介:卜偉，男，碩士研究生 通信作者:臧恒昌，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：多糖類藥物研究、藥品生產(chǎn)工藝優(yōu)化及在線過程分析與過程控制， E-mail:zanghcw@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.007

(收稿日期：2016-02-12，修回日期：2016-04-07)