解　巖，張婷婷

(哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)生理學教研室，黑龍江 大慶　163319)

抗心律失常藥物對2-APB誘發(fā)大鼠心房異位活動的影響

解巖，張婷婷

(哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)生理學教研室，黑龍江 大慶163319)

摘要：目的研究抗心律失常藥物對2-APB誘發(fā)的大鼠心房異位活動的抑制作用。方法通過連接多通道分析和獲取數(shù)據(jù)的等長張力傳感器測量2-APB誘發(fā)的異位活動。結果2-APB劑量依賴性增加左心房的異位活動，濃度分別為 1、5、10、20、50 μmol·L-1?？剐穆墒СＫ幬?，奎尼丁(10 μmol·L-1)，利多卡因(10 μmol·L-1)，維拉帕米(5 μmol·L-1)抑制2-APB誘發(fā)的異位活動。2-APB誘發(fā)的異位活動能被無鈣液和Na+/Ca2+交換抑制劑所阻斷，如3′，4′-dichlorobenzamil hydrochloride (DHC)和Ni2+，而不能被非選擇性陽離子通道阻斷劑 Gd3+所阻斷。結論2-APB誘發(fā)的心房異位活動能被經典抗心律失常藥物所抑制，如奎尼丁，利多卡因，維拉帕米和鈉鈣交換抑制劑。2-APB可用于篩選那些能夠非選擇性抑制鈉通道，鈣通道和鈉鈣交換體的抗心律失常藥物。

關鍵詞：鈉鈣交換體抑制劑DHC;抗心律失常藥;利多卡因;奎尼丁;維拉帕米;大鼠,Wistar;2-APB

心血管疾病有著很高的致死率，其中心律失常占心血管疾病發(fā)病率的25%[1-2]。心肌細胞離子通道的結構和功能的改變所引起的離子流變化是心律失常發(fā)生機制中研究的焦點[3]。心肌細胞膜上存在多種離子通道，如鈉通道、鉀通道、鈣通道等。這些通道表達和功能的彼此平衡是正常電生理的基礎，一旦這種平衡被打破，就會出現(xiàn)心律失常[4-5]。

心律失常嚴重危害人類健康，篩選新的抗心律失常藥物具有重要的意義。目前篩選抗心律失常候選藥物的方法包括：膜片鉗、電刺激模型、神經刺激模型、缺血性心律失常模型和利用一些化學藥物誘發(fā)的心律失常模型如洋地黃、烏頭堿等[6]。采用不同的方法和模型聯(lián)合評價抗心律失常候選藥的作用是目前研究的關注點。

2-APB(2-AminoethoxydiphenylBorate)是一種細胞膜通透性分子，能作用于多種細胞，產生廣泛的作用。2-APB通常用于抑制IP3受體誘發(fā)的鈣釋放和抑制鈣庫操縱性鈣通道。然而最近有報道證明2-APB在某些情況下，能加強鈣離子的信號轉導。Wolkowicz等證實了2-APB能夠誘發(fā)離體大鼠左心房的異位活動，If電流，氯通道，鈉鈣交換體等可能加強了2-APB的作用[7-8]。本實驗的目的在于闡明2-APB誘發(fā)心律失常的機制，驗證候選的抗心律失常藥物對2-APB的作用，為篩選抗心律失常藥物提供新的方法。

1材料和方法

1.1材料Wistar大鼠，雄性，哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號醫(yī)動字：0-9-2-1。2-APB、DHC、硫酸鎳、氯化釓和奎尼丁購自Sigma-Aldrich，利多卡因、維拉帕米購自哈爾濱醫(yī)科大學藥學部，其余試劑均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1實驗準備首先將Krebs-Henseleit(KH)液置于HW-400恒溫平滑肌槽中加熱，設定溫度為37℃，打開超級恒溫器，設定溫度37℃，預熱20～30 min。再將小浴槽用KH液沖洗3遍以上確保清潔，確保無藥品殘留。并用37 ℃的KH液13 mL注入小浴槽中，用95%O2+5%CO2混合氣體進行氧飽和。用雙蒸水(ddH2O)清洗實驗中使用的器械。

1.2.2分離大鼠心房Wistar大鼠(200～240 g)用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，從劍突處打開胸腔，暴露心臟，用手輕輕抓住心臟，迅速剪開主動脈，將心臟放在裝有37℃的KH液的平皿中 ，用小剪刀和彎鑷輕輕剪取心房，要注意保持心房的完整性，否則會影響心房的功能。

1.2.3懸掛心房用兩個膜片夾將心房兩端夾起固定在小浴槽中，分別掛在小浴槽下端的彎鉤和等長張力傳感器上，調節(jié)高度，使張力適中。整個實驗過程中，小浴槽中的液體用95%O2+5%CO2混合氣體進行氧飽和。

1.2.4輸入信號將BL-420生物機能試驗系統(tǒng)打開，選擇心房所對應的通道，輸入張力信號，調節(jié)指標為G=2000，T=0.1，F(xiàn)=30，開始記錄實驗數(shù)據(jù)。

2結果

2.1大鼠左心房和右心房的自發(fā)性機械活動大鼠的右心房在實驗條件下，能夠產生自發(fā)的機械活動，頻率為每分鐘(253±32)次(n=6)，左心房并不產生自發(fā)的機械活動(n=6)，如圖1。因此，為了排除右心房自發(fā)性機械活動對實驗中2-APB誘發(fā)的心房異位活動的影響，在實驗中我們使用的是大鼠左心房。

圖1　大鼠左右心房的自發(fā)性機械活動(n=6)

2.2不同劑量的2-APB對大鼠左心房異位活動的作用本實驗記錄了1、5、10、20、50 μmol·L-1的2-APB對大鼠左心房異位活動的作用。1、5 μmol·L-1的2-APB對大鼠左心房的作用比較微弱。20 μmol·L-1的2-APB能夠明顯誘發(fā)大鼠左心房的異位活動，50 μmol·L-1的2-APB能夠誘發(fā)大鼠左心房急劇快速的收縮活動，頻率為每分鐘(219±9)次(n=8)，比20 μmol·L-1的2-APB的作用強烈。但是20 μmol·L-1的2-APB能夠誘發(fā)大鼠左心房穩(wěn)定的異位活動，而50 μmol·L-1的2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的機械活動在觀察時間內已經逐漸耗竭。結果提示：20 μmol·L-1為最適濃度。在以下的實驗中2-APB的使用濃度為20 μmol·L-1。見圖2。

注：ABC為不同劑量的2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動的代表圖；D為2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動的統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

圖22-APB劑量依賴性增加大鼠左心房的異位活動

2.3鈉通道和鈣通道阻斷劑預處理對2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動的作用本實驗運用了兩類抗心律失常藥，鈉通道阻斷劑，利多卡因(10 μmol·L-1)和奎尼丁(10 μmol·L-1)，電壓依賴性L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米(5 μmol·L-1)。用這三種藥物預先孵育大鼠左心房10 min之后，給予20 μmol·L-1的2-APB。結果(圖3)：這三種藥物都能明顯抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動的頻率，且實驗中這三種藥物的使用濃度與臨床用藥濃度基本相同。結果提示:2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動可能有鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道的參與。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖3奎尼丁，利多卡因和維拉帕米預處理抑制2-APB誘發(fā)的異位活動(n=10)

2.4鈉通道和鈣通道阻斷劑后處理對2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動的作用2-APB作用于大鼠左心房5 min后，分別給予離子通道阻斷劑利多卡因(10 μmol·L-1)，奎尼丁(10 μmol·L-1)和維拉帕米(5 μmol·L-1)。觀察發(fā)現(xiàn)：2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動頻率逐漸降低，高度也逐漸降低，最后直至完全消失，統(tǒng)計結果如圖4所示。結果再次提示：2-APB誘發(fā)的大鼠心房的異位活動可能有鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道的參與。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖4奎尼丁，利多卡因和維拉帕米預處理抑制2-APB誘發(fā)的異位活動(n=10)

2.5鈉鈣交換抑制劑，非選擇性陽離子通道抑制劑和無鈣液對2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動的作用鈉鈣交換體抑制劑 DHC(20 μmol·L-1) 和Ni2+(5 μmol·L-1)均能抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動，非選擇性陽離子通道劑Gd3+(100 μmol·L-1)不能抑制2-APB的作用，無鈣的Krebs-Henseleit灌流液幾乎能夠完全阻斷2-APB的作用(圖5)。結果提示，2-APB誘發(fā)大鼠心肌細胞的鈣超載是通過刺激內鈣釋放和外鈣內流實現(xiàn)的，而且外鈣的內流是通過電壓依賴性L-型鈣通道，而不是通過非選擇性陽離子通道。2-APB作用的可能機制為：2-APB首先激活內鈣的釋放，內鈣的增加驅動鈉鈣交換體，產生了凈的內向電流，細胞膜去極化，鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道開放，內流的鈣離子增加，產生了心房的異位活動。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖52-APB誘發(fā)的異位活動能夠被 DHC，Ni2+和無鈣液所阻斷，不能被Gd3+阻斷(n=10)

3討論

我們的實驗證實2-APB能劑量依賴性的誘發(fā)大鼠心房的異位活動，并且該異位活動能夠被鈉通道阻滯劑，鈣通道阻滯劑所阻斷。我們假設2-APB為我們提供了另外一種方法用于篩選非選擇性阻斷鈉通道，鈣通道的抗心律失常藥物。眾所周知，細胞內鈣離子的升高能夠激活鈉鈣交換體，產生了瞬時內向的電流，細胞膜去極化，爆發(fā)動作電位。由此，結合我們目前的實驗結果，2-APB誘發(fā)的心房異位活動的簡略過程：2-APB引起細胞內鈣的增加，鈉鈣交換體被激活，每將一個鈣離子轉移出細胞外就將三個鈉離子轉運進細胞內，從而產生了凈的內向電流，細胞膜去極化，電壓門控鈉通道被激活，鈉離子內流，細胞膜進一步去極化，電壓依賴性L-型鈣通道被激活，鈣離子內流，細胞中鈣離子的進一步增加誘發(fā)了大鼠左心房的異位活動。鈉/鈣交換，鈉通道和鈣通道是2-APB誘發(fā)心房異位活動中的三個關鍵步驟，阻止其中的任何一個都將抑制2-APB誘發(fā)的心房異位活動。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鈉通道阻斷劑，鈣通道阻斷劑或鈉鈣交換抑制劑能夠完全抑制2-APB誘發(fā)的心房異位活動，并且實驗中這些抗心律失常藥物的使用濃度幾乎與臨床用藥的濃度相同。

2-APB在體外能夠明顯誘發(fā)大鼠左心房的異位活動，但是體內注射卻不能引起明顯的心律失常。當致死劑量的2-APB被注射至大鼠體內，會產生竇性心動過緩和竇性停搏(數(shù)據(jù)沒有顯示)。2-APB能夠作用于多種細胞產生廣泛的作用，例如，抑制或激活鈣離子信號轉導[9]，抑制TRPC通道[10]，激活TRPV渠道[11]，抑制電壓門控的K+通道[12]。因為2-APB涉及不同的生理功能，因此我們不能簡單地從2-APB的體外數(shù)據(jù)去推斷出2-APB的體內作用。

經典的抗心律失常藥物奎尼丁、利多卡因、維拉帕米能抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動。2-APB可用于篩選那些能非選擇性抑制鈉通道、鈣通道和鈉鈣交換體的抗心律失常藥物。

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Inhibition of 2-aminoethoxydiphenyl-borate-induced rat atrial ectopic activity by antiarrhythmic drugs

XIE Yan,ZHANG Ting-ting

(DepartmentofPhysiology,DaqingCampusofHarbinMedicalUniversity,Daqing，Heilongjiang163319,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the inhibition of 2-APB-induced rat atrial ectopic activity by antiarrhythmic drugs.Methods2-APB-induced ectopic activity was measured through an isometric force transducer connected to amultichannel acquisition and analysis system.Results2-APB dose-dependence increased the ectopic activity of left atria at 1,5,10,20,50 μmol·L-1.Anti-arrhythmic drugs,quinidine(10 μmol·L-1),lidocaine (10 μmol·L-1),verapamil (5 μmol·L-1) inhibited 2-APB-induced ectopic activity.2-APB-induced ectopic activity was inhibited by Ca2+-free bath,Na+/Ca2+exchanger blockers,3’,4’-dichlorobenzamil hydrochloride (DHC) and Ni2+,not by non-selective cation channel blocker Gd3+. Conclusions2-APB-induced atrial ectopic activity was inhibited by classic anti-arrhythmic drugs quinidine,lidocaine,verapamil,and Na+/Ca2+exchanger blockers.It can be used for testing agents able to affect any of Na+,Ca2+channel,Na+/Ca2+exchanger without selectivity.

Key words:Anti-Arrhythmia Agents;Lidocaine;Quinidine;Verapamil;Rats,Wistar;2-Aminoethoxydi pheny borate

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.005

(收稿日期：2016-01-11，修回日期：2016-03-11)