孟書燕，郭 杰，高庚渠，劉改霞，馬 威

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山 467000)

小鼠Klf4基因的原核表達(dá)研究

孟書燕，郭 杰，高庚渠，劉改霞，馬 威*

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山 467000)

摘要[目的]對(duì)小鼠Klf4基因重組蛋白進(jìn)行原核表達(dá)分析。[方法]利用雙酶切從重組質(zhì)粒pMXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段，克隆入pET-41a(+)載體后轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，探討誘導(dǎo)表達(dá)最佳濃度和時(shí)間，最后采用SDS-PAGE對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定及分析。[結(jié)果]重組質(zhì)粒Klf4-pET-41a(+)在IPTG誘導(dǎo)下可表達(dá)與預(yù)期相符的約為51 ku的KLF4蛋白；經(jīng)IPTG刺激后重組蛋白表達(dá)增多，以0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h為佳；重組蛋白以包涵體形式存在于大腸桿菌BL21中。[結(jié)論]小鼠Klf4基因可在原核細(xì)胞中表達(dá)。

關(guān)鍵詞小鼠；Klf4基因；原核表達(dá)；大腸桿菌

Krüppel樣因子4(Krüppel-likefactor4，Klf4)為1996年發(fā)現(xiàn)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其在細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，采用體外導(dǎo)入Klf4、Oct4/POU5F1、Sox2和c-Myc 4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可將小鼠體細(xì)胞直接重構(gòu)為胚胎干細(xì)胞(ES，embryonicstemcells)樣的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞[2]，因此Klf4作為分化體細(xì)胞重編程的重要誘導(dǎo)因子之一，一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。但目前關(guān)于Klf4基因原核表達(dá)的研究較少。筆者以小鼠Klf4基因?yàn)槟康幕?，?gòu)建原核表達(dá)載體，對(duì)其原核表達(dá)進(jìn)行分析，為今后Klf4融合蛋白多克隆抗體制備及其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑、載體及菌株大腸桿菌工程菌DH5α、BL21(DE3)、pMXs重組質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET-41a(+)均為西北農(nóng)林科技大學(xué)干細(xì)胞研究中心保存；DNA純化回收試劑盒(Tiangen)，蛋白Marker、SalⅠ、NcoⅠ、PstⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、DNAMarker、Amp、Kan(TaKaRa)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2小鼠Klf4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定用SalⅠ和NcoⅠ分別對(duì)含有小鼠Klf4基因片段的pMXS-Klf4重組質(zhì)粒和pET-41a(+)進(jìn)行37 ℃雙酶切，前者回收Klf4基因片段，后者回收大片段，并將兩者在16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，先經(jīng)SalⅠ和NcoⅠ雙酶切鑒定，再經(jīng)PstⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后，獲得重組原核表達(dá)載體Klf4-pET-41a(+)。

1.3重組質(zhì)粒Klf4-pET-41a(+)的誘導(dǎo)表達(dá)將陽(yáng)性重組質(zhì)粒接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，將菌液按1%劑量接種于50mL相同LB培養(yǎng)基中，200r/min振蕩培養(yǎng)至OD為0.6左右，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)不同時(shí)間(4、6h)分別取樣1.5mL。同時(shí)以誘導(dǎo)的pET-41a(+)載體作為陰性對(duì)照。

1.4小鼠Klf4基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析將1.5mL誘導(dǎo)菌液4 ℃離心收集菌體，室溫12 000r/min離心1min，棄上清，加入100μL1×SDS凝膠加樣緩沖液重懸，100 ℃煮沸10min后冰浴10min，室溫12 000r/min離心1min，取上清進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R250染色觀察。

1.5重組質(zhì)粒Klf4-pET-41a(+)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化①將含Klf4-pET-41a(+)的BL21以1%劑量接種于含Kan的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)3～4h，分別加入IPTG至終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果。②將含Klf4-pET-41a(+)的BL21以1%劑量接種于含Kan的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)3～4h，在添加0.8mmol/LIPTG后繼續(xù)誘導(dǎo)0、4、5、6、7h分別取樣處理，SDS-PAGE電泳分析。

1.6融合蛋白表達(dá)形式的鑒定收集100mL菌液，12 000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，12 000r/min離心5min后棄去上清。5mLPBS懸浮沉淀，冰浴條件下對(duì)菌體進(jìn)行超聲波破碎(工作條件為：400W，5s，5s，30min)，待菌體懸浮液由黏稠變透亮?xí)r即可。12 000r/min離心40min，取上清100μL，加入1×SDS上樣緩沖液混合完全，后加入PBS重懸沉淀，再加入1×SDS上樣緩沖液混合制樣，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2結(jié)果與分析

2.1pMXs-Klf4重組質(zhì)粒的酶切鑒定重組質(zhì)粒pMXs-Klf4經(jīng)雙酶切后獲得一條約為1 925bp的基因片段，根據(jù)載體的酶切位點(diǎn)分析，并與NCBI上公布的小鼠Klf4基因長(zhǎng)度相比，可以確定該特異性條帶即為Klf4片段(圖1)。

注：M.DL2 000 DNA Marker；1.酶切結(jié)果(SalI和NcoI)。Note：M.DL2 000 DNA Marker；1.Product of plasmid digested by SalI and NcoI.圖1　pMXs-Klf4的雙酶切結(jié)果Fig.1　Identification of plasmid pMXs-Klf4 by double restriction endonuclease digestion

2.2Klf4-pET-41a(+)重組質(zhì)粒的酶切鑒定提取陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒Klf4-pET-41a(+)進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示經(jīng)SalⅠ和NcoⅠ雙酶切獲得一條約1 925bp條帶，與預(yù)期片段大小相符；經(jīng)PstⅠ和HindⅢ雙酶切獲得一條約1 460bp條帶，與預(yù)期片段大小相符。

2.3Klf4-pET-41a(+)重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定將含有Klf4-pET-41a(+)的BL21 37 ℃培養(yǎng)后，加入1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，于不同時(shí)間取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果在約77ku處有明顯的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白大小一致，而未誘導(dǎo)的重組菌對(duì)照組未見(jiàn)該條帶(圖2)。

注：1.未誘導(dǎo)的Klf4-pET-41a(+)；2.加入IPTG誘導(dǎo)4 h后的Klf4-pET-41a(+)；3.pET-41a(+)空載體誘導(dǎo)4 h；4.加入IPTG誘導(dǎo)6 h后的Klf4-pET-41a(+)；5.pET-41a(+)空載體誘導(dǎo)6 h；M.蛋白Marker。Note：1.Non-induced Klf4-pET-41a(+)；2.Klf4-pET-41a(+)after IPTG induction for 4 h；3.pET-41a(+)empty carrier induction for 4 h；4.Klf4-pET-41a(+)after IPTG induction for 6 h；5.pET-41a(+)empty carrier induction for 6 h；M.Protein Marker.圖2　表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGEFig.2　SDS-PAGE analysis of expressed protein

2.4Klf4-pET-41a(+)重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化在誘導(dǎo)時(shí)間相同的條件下，通過(guò)改變誘導(dǎo)物IPTG濃度來(lái)觀察IPTG濃度對(duì)KLF4蛋白表達(dá)的影響。在IPTG濃度為0.8mmol/L時(shí)KLF4蛋白的表達(dá)量最多，因此，最適IPTG濃度為0.8mmol/L(圖3)。當(dāng)加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG后，觀察不同時(shí)間對(duì)KLF4蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明誘導(dǎo)6h后KLF4蛋白的表達(dá)量較多，因此，最適誘導(dǎo)時(shí)間為6h(圖4)。

注：M.蛋白Marker，1～7分別為IPTG濃度為1.0、0.8、0.6、0.6、0.4、0.2、0 mmol/L。Note：M.Protein Marker；1-7.IPTG concentration 1.0,0.9,0.6,0.6,0.4,0.2,0 mmol/L,respectively.圖3　不同IPTG濃度對(duì)KLF4蛋白表達(dá)的影響Fig.3　Effects of different concentration of IPTG on the expression of KLF4 protein

注：M.蛋白Marker，1.誘導(dǎo)3 h，2.誘導(dǎo)4 h，3.誘導(dǎo)5 h，4.誘導(dǎo)6 h。Note：M.Protein Marker；1.Induction for 3 h；2.Induction for 4 h；3.Induction for 5 h；4.Induction for 6 h.圖4　不同時(shí)間對(duì)KLF4蛋白表達(dá)的影響Fig.4　Effects of different time on the expression of Klf4 protein

2.5目的蛋白表達(dá)形式的鑒定含重組質(zhì)粒Klf4-pET-41a(+)的菌體誘導(dǎo)后超聲破碎，離心獲得上清和沉淀，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，上清中幾乎無(wú)目的蛋白存在，而在沉淀中含有大量目的蛋白，說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的KLF4蛋白是以包涵體的形式存在于細(xì)菌胞液中(圖5)。

注：1.未誘導(dǎo)含pET-41a(+)的BL21蛋白，2.誘導(dǎo)6 h含pET-41a的BL21蛋白，3.未誘導(dǎo)的含Klf4-pET-41a+的BL21蛋白，4.0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h的含Klf4- pET-41a+的BL21蛋白，5.破碎含重組載體的細(xì)胞后的上清，6.破碎含重組載體的細(xì)胞后的沉淀，M.蛋白Marker。Note：1.The protein in BL21 with non-induced pET-41a(+)；2.The protein in BL21 with IPTG induced pET-41a(+)；3.The protein in BL21 with non-induced Klf4 -pET-41a(+)；4.The protein in BL21 with 0.8 mmol/L IPTG induced Klf4 -pET-41a(+)for 6h；5.The supernatant of induced BL21 with Klf4-pET-41a(+)；6.The precipitation of induced BL21 with Klf4 -pET-41a(+)；M.Protein Marker.圖5　目的蛋白表達(dá)形式的鑒定Fig.5　The identification of the expressed KLF4 protein

3討論

KLF4蛋白結(jié)構(gòu)的高度保守性決定了Klf4是一個(gè)雙向調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，其參與維持干細(xì)胞的全能性、調(diào)控細(xì)胞增殖、促進(jìn)正常組織的生長(zhǎng)，并與腫瘤的形成與發(fā)展有關(guān)[4-6]。研究表明，Oct4/POU5F1、Sox2、Klf4和c-Myc可將小鼠成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為多能性干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)，說(shuō)明這4因子在細(xì)胞重編程中發(fā)揮重要作用[2]。關(guān)于Klf4的研究主要集中于對(duì)4因子共同調(diào)控作用的分析，而對(duì)于單轉(zhuǎn)錄因子的作用研究較少[7]。該研究利用酶切技術(shù)構(gòu)建Klf4 -PET-41a(+)重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)與預(yù)期相符的約為51ku的KLF4蛋白，且經(jīng)IPTG刺激后重組融合蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，其中以IPTG為0.8mmol/L誘導(dǎo)6h效果最佳。

稀有密碼子的存在影響目的基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)[8]，在大腸桿菌的8個(gè)稀有密碼子中，小鼠Klf4基因中有AGA、AGC、CCG、CCC4種，且均位于近氨基端，這是小鼠KLF4蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)存在潛在低量表達(dá)的原因之一。解決該問(wèn)題最好用點(diǎn)突變的方法將稀有密碼子進(jìn)行改造，以提高表達(dá)效率[9]。

體外誘導(dǎo)表達(dá)小鼠KLF4蛋白，有助于研究KLF4蛋白對(duì)細(xì)胞重編程的作用，以及與其他多能性相關(guān)因子的相互作用，為進(jìn)一步研究該基因的體外功能提供理論依據(jù)。

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TheResearchofProkaryoticExpressionofKrüppel-likeFactor4inMouse

MENGShu-yan,GUOJie,GAOGeng-qu,MAWei*etal

(HenanQualityPolytechnic,Pingdingshan,Henan467000)

Abstract[Objective] Prokaryotic expression analysis of recombinant protein of Klf4 gene in mice was conducted. [Method] Klf4 gene segments were recovered from recombinant plasmid pMXs-Klf4 by double enzyme digestion, then they were cloned into pET-41a (+) vector and transformed into E.coli BL21. The expression was induced by IPTG, the optimal concentration and time was explored, finally, SDS-PAGE was adopted to identify and analyze recombinant plasmid. [Result] Induced by IPTG, recombinant plasmid Klf4-pET-41a(+) can be expressed in accordance with the expected protein about 51 ku; after IPTG stimulation, the expression of recombinant protein was increased, and 0.8 mmol/L IPTG induction for 6 h was optimal; the recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies in E. coli BL21.[Conclusion] The mouse Klf4 gene can express in prokaryotic cells.

Key wordsMouse; Klf4 gene; Prokaryotic expression; E. coli

作者簡(jiǎn)介孟書燕(1986- )，女，河南漯河人，助教，碩士，從事食品微生物研究。*通訊作者，副教授，從事食品化工研究。

收稿日期2016-04-06

中圖分類號(hào)Q 78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)12-133-03