楊運(yùn)康　劉延友　后望　王正榮

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院· 衛(wèi)生部時(shí)間生物學(xué)研究室， 四川 成都 610041)

·論著·

低頻電磁輻射對(duì)小鼠近日節(jié)律的影響*

楊運(yùn)康劉延友后望王正榮△

(四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院· 衛(wèi)生部時(shí)間生物學(xué)研究室， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探究2000μW/cm2電磁輻射對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)節(jié)律和Clock基因表達(dá)水平的影響。方法將4周齡的雄性昆明鼠30只隨機(jī)分為三組：空白組，1h/d輻射組，2h/d輻射組。固定小鼠，使其接受2000μW/cm2電磁輻射，連續(xù)10天，之后監(jiān)測(cè)其轉(zhuǎn)輪活動(dòng)的近日節(jié)律變化，并且提取小鼠腦組織中的總RNA和蛋白， RT-PCR和western-blot檢測(cè)三組之間Clock基因和蛋白的表達(dá)是否存在顯著性差異。結(jié)果與空白組相比，兩個(gè)輻射組小鼠近日節(jié)律均有縮短的現(xiàn)象(P<0.05)，且Clock基因和蛋白的表達(dá)水平顯著性的升高(P<0.05)。結(jié)論2000μW/cm2電磁輻射會(huì)縮短小鼠的近日節(jié)律周期，其機(jī)制可能與Clock基因表達(dá)升高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】電磁輻射；近日節(jié)律；生物鐘基因；Clock基因

近日節(jié)律是機(jī)體適應(yīng)環(huán)境周期性變化的一種內(nèi)在機(jī)制，具有重要的生理功能[1]。分子水平上，近日節(jié)律是由一系列的核心近日鐘基因的轉(zhuǎn)錄負(fù)反饋環(huán)路所產(chǎn)生，近日鐘基因參與調(diào)控細(xì)胞的生理生化活動(dòng)，如細(xì)胞增值、細(xì)胞凋亡等[2，3]。隨著科技的進(jìn)步，電磁波的應(yīng)用也得以普及，它在給人類的日常生活帶來便利的同時(shí)，也帶來了許多的弊端，各個(gè)種類的電子產(chǎn)品所發(fā)射出的電磁波不僅對(duì)地球和大氣帶來破壞，更嚴(yán)重的是影響到了人體的健康[4，5]。有研究報(bào)道，2000μW/cm2電磁輻射可導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，其機(jī)制可能與海馬體組織蛋白及其mRNA的表達(dá)下降有關(guān)[6]。低強(qiáng)度微波輻射(150μW/cm2)能通過影響雄性小鼠血清總膽固醇含量、 睪丸組織P450scc mRNA的表達(dá)，影響血清睪酮的合成和分泌，進(jìn)而影響雄性小鼠生殖系統(tǒng)的其他相關(guān)指標(biāo)[7]。低強(qiáng)度電磁輻射影響大鼠松果體中第二信使cAMP, cGMP，從而干擾松果體細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，進(jìn)一步影響動(dòng)物的晝夜節(jié)律[8]。生物節(jié)律系統(tǒng)在維持生物體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保證生物體日常生理活動(dòng)正常進(jìn)行方面具有重要作用，而相關(guān)的節(jié)律基因則處于該系統(tǒng)的核心位置。Clock是節(jié)律調(diào)控通路中最核心的元件[9-11]，電磁輻射對(duì)生物節(jié)律的影響還少有報(bào)道，本文主要探討電磁輻射對(duì)生物的近日節(jié)律和生物鐘基因的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物昆明小鼠30只，4周雄性，購于四川大學(xué)華西校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑Trizol 試劑(美國，Inxitrogen)， DEPC(美國，Sigma)，PCR Mix(中國，novoprotein)，DNA Leader2000(中國，novoprotein)，HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(北京，康為世紀(jì))，RIPA蛋白裂解液(中國，碧云天)，預(yù)染蛋白Marker(美國，F(xiàn)ermentas)，ECL檢測(cè)試劑盒(中國，全式金)，CLOCK抗體(美國，Epitomics)，抗GAPDH抗體(中國，康為)，辣根酶過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(中國，中杉金橋)辣根酶過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(中國，中杉金橋)其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器普通PCR儀(德國，Eppendorf)，低溫離心機(jī)(德國，Eppendorf)，微量移液器(德國，Eppendorf)，瓊脂糖凝膠電泳槽裝置(中國，俊逸)，轉(zhuǎn)輪裝置節(jié)律監(jiān)測(cè)儀，電磁波發(fā)生器等。

1.1.4引物序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及飼養(yǎng)將30只4周齡的雄性昆明鼠，飼養(yǎng)于24小時(shí)全黑環(huán)境，自由飲水進(jìn)食，溫度為22～24℃，濕度50～65%，控制環(huán)境噪音。飼養(yǎng)兩周時(shí)間，使小鼠適應(yīng)周圍環(huán)境，利用小鼠節(jié)律檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)每只小鼠的轉(zhuǎn)輪活動(dòng)，待其跑出有規(guī)律且穩(wěn)定的近日活動(dòng)圖后，將小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，1h/d輻射組，2h/d輻射組。

1.2.2輻射處理對(duì)其中兩組分別采用2000μW/cm2強(qiáng)度的電磁波進(jìn)行每天1小時(shí)和2小時(shí)輻射，用鼠板固定小鼠，輻射探頭置于小鼠頭部正上方，范圍為以探頭為圓心，半徑15cm的圓形區(qū)域，小鼠全身接收照射。1h/d輻射組輻射時(shí)間為上午8:00～9:00，2h/d輻射組為上午8:00～10:00，連續(xù)輻射10天；對(duì)照組小鼠每天8:00～10:00固定2小時(shí)，不做輻射處理。

1.2.3活動(dòng)節(jié)律監(jiān)測(cè)采用轉(zhuǎn)輪裝置自輻射前5日起至輻射結(jié)束后連續(xù)監(jiān)測(cè)小鼠自發(fā)主動(dòng)活動(dòng)變化，搜集數(shù)據(jù)與對(duì)照組進(jìn)行比較分析。

1.2.4RT- PCR用液氮將腦組織充分研磨后，加入Trizol試劑，按照說明書提取組織的RNA，檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書，將上述RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)PCR mix提供的說明書，配置反應(yīng)體系進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶。

1.2.5Western blot用液氮將腦組織充分研磨后，加入RIPA(強(qiáng))裂解液，按照說明書的操作流程，提取組織的總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并且將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF，western-blot檢測(cè)三組CLOCK和GAPDH蛋白的表達(dá)水平。

1.2.6數(shù)據(jù)分析Quantity one軟件半定量分析條帶的相對(duì)光密度值；利用SPSS軟件對(duì)三組樣品的相對(duì)單位光密度值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12000μW/cm2電磁輻射對(duì)小鼠近日節(jié)律的影響實(shí)驗(yàn)組小鼠接受輻射前后的自發(fā)主動(dòng)活動(dòng)節(jié)律圖如圖1所示，其中箭頭所示為輻射開始時(shí)間，A為每天接受2000μW/cm2低強(qiáng)度電磁波輻射1小時(shí)，輻射時(shí)間為上午8：00-9：00，連續(xù)輻射10天，B為每天接受2000μW/cm2低強(qiáng)度電磁波輻射2小時(shí)，輻射時(shí)間為上午8：00～10：00，連續(xù)輻射10天，C為對(duì)照組沒有進(jìn)行輻射處理。從圖中可以看出，輻射前兩組實(shí)驗(yàn)組節(jié)律周期與對(duì)照組相比沒有顯著差異(P>0.05);而輻射后，兩組輻射組小鼠的近日節(jié)律周期均比對(duì)照組短(P<0.05)，1h/d輻射組和2h/d輻射組小鼠近日節(jié)律無顯著差異(P>0.05)。

2.22000μW/cm2電磁輻射對(duì)小鼠Clock基因表達(dá)量的影響圖2是對(duì)1h/d輻射組和2h/d輻射組進(jìn)行輻射處理后，利用RT-PCR檢測(cè)輻射組和對(duì)照組小鼠clock mRNA表達(dá)的結(jié)果，其中圖2A中1、2、3條帶是1h/d輻射組，4、5、6是2h/d輻射組，7、8、9是對(duì)照組，圖2B為三組相對(duì)光密度，對(duì)照組為1.2±0.2，1h/d輻射組為2.8±0.2，2h/d輻射組為3.1±0.2。由圖可知，兩組實(shí)驗(yàn)組小鼠clock表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，存在顯著差異(P<0.05)，而1h/d輻射組和2h/d輻射組兩組無顯著差異(P>0.05)。

2.3Western Blot檢測(cè)輻射后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠CLOCK表達(dá)圖3是對(duì)1h/d輻射組和2h/d輻射組進(jìn)行輻射處理后，利用western blot檢測(cè)輻射組和對(duì)照組小鼠CLOCK表達(dá)的結(jié)果，其中圖3A中分別為對(duì)照組、1h/d輻射組和2h/d輻射組的結(jié)果，圖3B為三組相對(duì)光密度，對(duì)照組為1.6±0.2，1h/d輻射組為3.2±0.2，2h/d輻射組為3.6±0.2。由圖可知，兩組實(shí)驗(yàn)組小鼠CLOCK表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，存在顯著差異(P<0.05)，而1h/d輻射組和2h/d輻射組兩組無顯著差異(P>0.05)。

圖1三組小鼠自發(fā)主動(dòng)活動(dòng)節(jié)律圖

Figure 1The self-sustained locomotor circadian rhythm of mice

圖2RT-PCR檢測(cè)輻射后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠Clock表達(dá)

Figure 2The relative mRNA level of Clock

3討論

本次試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，研究2000μW/cm2強(qiáng)度低頻電磁波輻射對(duì)近日節(jié)律的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每天接受1小時(shí)和2小時(shí)2000μW/cm2強(qiáng)度低頻電磁波持續(xù)輻射10天，會(huì)顯著性的縮短小鼠的自發(fā)主動(dòng)活動(dòng)節(jié)律周期，同時(shí)會(huì)顯著性的增加clock 基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

Clock是生物體的核心近日鐘基因，與Bmal1一起構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路的正性元件[12]。給予小鼠2000μW/cm2強(qiáng)度低頻電磁波輻射，會(huì)增加Clock的表達(dá)水平，同時(shí)會(huì)縮短小鼠的運(yùn)動(dòng)近日節(jié)律的周期，說明小鼠近日節(jié)律的縮短可能與Clock的表達(dá)水平增加有關(guān)。

圖3western blot檢測(cè)輻射后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠CLOCK表達(dá)

Figure 3The relative protein level of CLOCK

目前，已有大量研究證明哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在由核心近日鐘基因所構(gòu)成的核心通路和輔助通路[13]，參與調(diào)控機(jī)體的各項(xiàng)生理活動(dòng)[14]。研究報(bào)道，動(dòng)物體內(nèi)Clock基因表達(dá)出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)多種細(xì)胞的活力顯著下降，而且體內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)目也會(huì)降低[15]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)的近日鐘具有核心的負(fù)反饋環(huán)路， CLOCK和BMAL1兩種蛋白質(zhì)所構(gòu)成的異二聚體可以結(jié)合在mPer1/2/3、Cry1/2基因上游的E-box區(qū)域，促進(jìn)了mPer、Cry基因的轉(zhuǎn)錄[16,17]，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PER、CRY蛋白的濃度增加到一定的程度，又會(huì)反過來抑制CLOCK:BMAL1二聚體的活性，從而抑制的mPer、Cry的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)路，形成周期約為24小時(shí)的節(jié)律振蕩[18]。本實(shí)驗(yàn)中，輻射組的近日節(jié)律周期比對(duì)照組顯著縮短，同時(shí)Clock基因表達(dá)顯著上升，故推測(cè)低頻電磁波輻射導(dǎo)致小鼠腦組織中Clock基因表達(dá)的上升，影響了核心的負(fù)反饋環(huán)路，從而改變了近日振蕩周期。

近日節(jié)律系統(tǒng)是機(jī)體適應(yīng)環(huán)境周期性變化的一種內(nèi)在機(jī)制，改變節(jié)律基因的表達(dá)水平是近日節(jié)律參與調(diào)控機(jī)體生理活動(dòng)的重要的手段之一[19,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過10天持續(xù)的2000μW/cm2強(qiáng)度低頻電磁波輻射后，小鼠的近日節(jié)律周期縮短，而Clock的表達(dá)有明顯的上升，證明了低頻電磁波會(huì)影響生物體的近日節(jié)律系統(tǒng)，而其中涉及到的分子機(jī)制值還需要更加深入的研究探討。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 2000μW/cm2強(qiáng)度低頻電磁波輻射影響小鼠的近日節(jié)律，表現(xiàn)為小鼠的運(yùn)動(dòng)節(jié)律周期縮短，小鼠腦組織中clock 基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高，推測(cè)低頻電磁波輻射，可能通過改變clock 基因的表達(dá)水平影響小鼠的自發(fā)主動(dòng)運(yùn)動(dòng)節(jié)律的周期。揭示了低頻電磁輻射對(duì)生物體近日節(jié)律的影響機(jī)制，證明日常生活中存在的各種電磁輻射會(huì)影響人體的健康。

【參考文獻(xiàn)】

[1]楊瑞，彭端云，高壓兵，等. 高功率微波輻射對(duì)大鼠海馬的損傷效應(yīng)[J], 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志. 2004, 22(3): 211-214.

[2]Jin S X, Feig L A. long-term potentiaion in the CA1 hippocampus induced by NR2A subumit-containing NMDA glutamat receptors is mediated by Ras-GRF2/Erk map kinase signaling[J]. Plos One, 2010, 5(7): el1732.

[3]Ammari M, Jeljeli M, Maaroufi K,etal. Static magnetic fild exposure affects behavior and learning in rats[J]. Electromagn Biol Med, 2008, 27(2): 185-196.

[4]Aleem MA. Health hazards of mobile in children [J]. J Assoc Physicians India, 2009,57:604-605.

[5]Habash RW, Elwood JM, Krewski D,etal. Recent advances in research on radiofrequency fields and health: 2004-2007[J]. J Toxicol Environ Health B Crit Rev, 2009, 12(4): 250-288.

[6]李紅玉，路國兵，史長(zhǎng)華,等.2000μW/cm2電磁輻射對(duì)大鼠海馬NR2A蛋白及其mRNA表達(dá)的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27:1007-8738.

[7]Xu M,etal. Increased Expression of Angiogenic Factors in Cultured Human Brain Arteriovenous Malformation Endothelial Cells[J]. Cell Biochemistry and Biophysics, 2014,39(1):5-8.

[8]Franchitto A,etal. Expression of vascular endothelial growth factors and their receptors by hepatic progenitor cells in human liver diseases[J]. Hepatobiliary Surgery and Nutrition, 2012. 2(2):76-87.

[9]Monk M, Boubelik M, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Dev Camb Engl. 1987;99(3):365-378.

[10] Zeng ZL, Wu MW, Sun J,etal. Effects of the biological clock gene Bmal1 on tumour growth and anti-cancer drug activity[J]. J Biochem, 2010, 148(3):319-326.

[11] Martignetti JA, Aqeel AA, Sewairi WA,etal. Mutation of the matrix metalloproteinase 2 gene(MMP2) causes a multicentric osteolysis and arthritis aydrome[J]. Nat Genet, 2001, 28(3):261-265.

[12] Dooley JL, Abdel-Latif D, St Laurent CD,etal. Regulation of inflammation by Rac2 in immune complex-mediated acute lung injury[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2009, 297(6):L1091-1102.

[13] Vu TH, Werb Z. Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology[J]. Genes Dev, 2000, 14(17):2123-2133.

[14] Devarajan P，Johnston JJ，Ginsberg SS，etal．Structure and expression of neutrophil gelatinase cDNA．Identity with type IV collagenase from HTl080 cells[J]．J Biol Chem, 1992, 267(35):25228-25232．.

[15] Garzetti GG, Ciavattini A，Lucarini G,etal．Expression of vascular endothelial growth factor related to 72-kilodalton metalloproteinase immunostaining in patients eith serous ovarian tumors[J]．Cancer, 1999，85(10):2219-2225.

[16] Brun JL, Galant C, Delvaux D,etal．Menstrual activity of matrix metalloproteinases is decreased in endometrium regenerating after thermal ablation[J]．Hum Reprod, 2009, 24(2):333-340.

[17] Pittendrigh CS．Temporal Organization:Refieetions of a Darwinian Clock Watcher[J]. Allan Rev Physiol, 1993, 55(1):17-54.

[18] Doghramji K．Assessment of excessive sleepiness and insomnia as they relate to circadian rhythm sleep disorders[J]．J Clin Psychiatry,2004，65(16):17-22.

[19] D′Alonzo G′Kraclaman S．Circadian rhythm sleep disorders[J]．JAOA，2000，100(8):15S-21S.

[20] Turek FW．Circadian rhythms[J]．Recent Prog Horm Res，1994，49(9):43-90.

The effect of low frequency electromagnetic waves on the circadian rhythm in mice

YANG Yunkang, LIU Yanyou, HONG WANG, et al

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 2000μW/cm2 electromagnetic radiation on the circadian rhythm and the expression level of Clock in mice. Methods30 male Kunming mice were randomly divided into control group, 1h/d radiation group and 2h/d radiation group. Mice in radiation group were fixed and accepted 2000μW/cm2 electromagnetic radiation for 10 days. Biological rhythm monitor was used to detect the locomotor circadian rhythms of mice. Total RNAs and proteins of brain tissue were extracted. RT-PCR and western-blot were used to detect the expression level of mRNA and protein. ResultsThe period of the circadian rhythm in the two radiation groups were shorter than that of control group (P<0.05), and the mRNA and protein level Clock were both increased, when compared with that of control group (P<0.05). Conclusion2000μW/cm2 electromagnetic radiation could shorten the period of circadian rhythm in mice, which might be associated with the increased expression of Clock.

【Key words】Electromagnetic radiation; Circadian rhythm; Clock gene

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31371180)

通訊作者：王正榮，教授，本刊常務(wù)編委，E-mail：wangzhengrong@126.com。

【中圖分類號(hào)】R 318.03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.011

(收稿日期：2016-01-19； 編輯： 張文秀)