楊夢(mèng)　張偉　李強(qiáng)　張星星　孫雪麗　寧允葉

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 上海 200433)

·論著·

低氧對(duì)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292黏液合成的影響*

楊夢(mèng)張偉李強(qiáng)張星星孫雪麗寧允葉

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 上海 200433)

【摘要】目的探討人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292對(duì)低氧的應(yīng)答及低氧對(duì)NCI-H292黏液合成的影響。方法體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292，對(duì)照組在常氧條件下培養(yǎng)，低氧組細(xì)胞設(shè)置不同氧濃度及不同培養(yǎng)時(shí)間，提取細(xì)胞總RNA及蛋白。采用AB-PAS染色檢測(cè)細(xì)胞黏液合成情況；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)muc5AC基因轉(zhuǎn)錄情況；Western blot檢測(cè)低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α、muc5AC的表達(dá)情況及相關(guān)信號(hào)通路蛋白的磷酸化水平。結(jié)果隨氧濃度降低，H292細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)增加，1%氧刺激4小時(shí)，HIF-1α表達(dá)與對(duì)照相比差異極顯著。低氧誘導(dǎo)H292細(xì)胞內(nèi)黏液合成增加，干預(yù)HIF-1α表達(dá)后抑制低氧誘導(dǎo)的黏液。低氧時(shí)間依賴性提高muc5AC轉(zhuǎn)錄水平，與常氧對(duì)照組相比在6 h即差異顯著(P<0.05)，12小時(shí)時(shí)差異極顯著(P<0.01)，至24小時(shí)muc5AC mRNA表達(dá)量達(dá)到峰值。AKT、ERK、STAT3(Tyr705)磷酸化活化都參與NCI-H292細(xì)胞對(duì)低氧的應(yīng)答。ERK信號(hào)通路阻斷劑U0126能抑制HIF-1a表達(dá)及黏液合成，而AKT信號(hào)通路阻斷劑LY294002和STAT3信號(hào)通路阻斷劑AG490不影響HIF-1α的表達(dá)量。 結(jié)論人氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292對(duì)1%低氧環(huán)境能迅速作出應(yīng)答。低氧通過(guò)磷酸化活化ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)MUC5AC上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞黏液異常合成，為體外深入研究低氧誘導(dǎo)的氣道黏液異常合成相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】低氧 NCI-H292細(xì)胞; MUC5AC; 黏液合成

慢性炎癥性氣道疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等是危害公眾健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病。支氣管哮喘患者全球有近3億,到2025年全球哮喘患者有可能增加1億[1]。COPD目前居全球死亡原因的第4位，發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)，世界衛(wèi)生組預(yù)測(cè),至2030年COPD將成為全球第3死亡原因[2]。由于慢性氣道疾病患病人數(shù)多，且發(fā)病率、死亡率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人群健康，給家庭和社會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，一直備受關(guān)注。氣道黏液異常合成與分泌是慢性氣道疾病重要的病理生理特征之一，氣道黏液由呼吸道上皮杯狀細(xì)胞和粘膜下腺細(xì)胞分泌[3]，其中95%以上成分為水，主要的大分子物質(zhì)是黏蛋白[4]。氣道壁黏液層是氣道抵御外界異物的第一道防線，在氣道的固有免疫過(guò)程中起到重要作用[5]；但在慢性炎癥性氣道疾病發(fā)生時(shí)，黏液會(huì)異常合成與分泌[6]，引起咳嗽、喘息等癥狀，干擾纖毛對(duì)病原體等有毒物質(zhì)的清除能力，造成呼吸道管腔阻塞、通氣血流灌注失調(diào)，加重疾病，影響預(yù)后[7]。慢性炎癥性氣道疾病中炎癥細(xì)胞的存在使組織氧耗增加，正常情況下氧分壓為2.5%～9%，病理?xiàng)l件下則低于1%[8]。鑒于MUC5AC是黏液黏彈性的主要形成物質(zhì)，而AQP5又與黏液的主要成分——水的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，推測(cè)低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α與慢性氣道疾病黏液的異常合成密切相關(guān)[9-11]。本研究旨在利用人氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292直觀地觀察低氧對(duì)氣道上皮細(xì)胞黏液合成的影響探討相關(guān)作用機(jī)制，為體外深入研究低氧刺激下氣道黏液合成中水的轉(zhuǎn)運(yùn)及黏液的分泌等相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640和胎牛血清購(gòu)自Corning(美國(guó))。AB-PAS染色試劑盒購(gòu)自Baso(珠海)。MUC5AC和GAPDH抗體購(gòu)自Santa(美國(guó))，HIF-1α、p-Akt、p-STAT3-Tyr705、p-ERK抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(美國(guó))，辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG和兔抗小鼠IgG購(gòu)自Abcam(英國(guó))。RNA提取試劑盒(Trizol)購(gòu)自Invitrogen(美國(guó))，實(shí)時(shí)定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara(日本)。HIF-1a選擇性抑制劑YC-1、PI3K-Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002和JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490購(gòu)自Sigma(德國(guó))，ERK抑制劑U0126購(gòu)自CST(美國(guó))。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液。細(xì)胞融合至70%時(shí)，饑餓過(guò)夜，加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基在不同濃度低氧條件下培養(yǎng)，對(duì)照組于常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，本研究所用普通CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱及三氣培養(yǎng)箱皆為T(mén)hermo公司生產(chǎn)。分別于設(shè)定時(shí)間內(nèi)收集RNA和總蛋白。各干預(yù)組細(xì)胞融合至70%饑餓過(guò)夜，分別加入YC-1 (50μM)、LY294002 (10μM)、U0126 (10μM)、AG490(40μM)預(yù)處理1小時(shí)，將細(xì)胞快速移至1%低氧孵箱中培養(yǎng)，分別于設(shè)定時(shí)間內(nèi)收集蛋白，每組重復(fù)3次。

1.3AB-PAS染色采用24孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的Thermo培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，饑餓過(guò)夜后，按分組進(jìn)行不同藥物處理，實(shí)驗(yàn)組于37℃、5% CO2、1% O2的三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，對(duì)照組于常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48小時(shí)后中性多聚甲醛固定30 min，按珠海貝索AB-PAS試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色操作，封片后Nikon正置顯微鏡觀察、200×拍照。

1.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR采用Trizol裂解各組細(xì)胞后抽提總RNA，按PrimeScript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用SYBR Premix Ex Taq (Takara)試劑盒及Rotor-Gene 6000 thermal cycler (Corbett)PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。以目的基因的表達(dá)量與內(nèi)參β-actin表達(dá)量的比值進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。所用引物序列如下：Muc5AC[12]：上游引物5′-TCAACGGAGACTGCGAGTACAC-3′；下游引物 5′-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3′；β-actin：上游引物5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′；下游引物5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。

1.5Western blot測(cè)定相關(guān)蛋白的變化情況采用M-PER蛋白裂解液 (Thermo) 加蛋白酶抑制劑PMSF提取總蛋白。配制10% SDS-PAGE膠，每孔上樣量為30μg(MUC5AC上樣量50μg)，經(jīng)電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫5%BSA封閉1 h，根據(jù)預(yù)染maker及目的蛋白分子量切膜、孵育一抗，4℃過(guò)夜。洗膜后根據(jù)一抗來(lái)源，分別以HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗或兔抗小鼠二抗室溫孵育1h，充分洗膜后ECL顯影，ImageQuant LAS4000化學(xué)發(fā)光成像儀(GE公司)成像。蛋白條帶采用Quantity One軟件進(jìn)行半定量，以目的基因的表達(dá)量與內(nèi)參GAPDH表達(dá)量的比值進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果

2.1不同氧分壓濃度對(duì)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)的影響分別采用常氧(Control)、16%、8%、4%、2%和1%氧的細(xì)胞培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)4h后收集蛋白，Western Blot檢測(cè)如圖1所示，H292細(xì)胞在常氧狀態(tài)下即可見(jiàn)HIF-1α有少量本底水平的表達(dá)，蛋白條帶經(jīng)灰度半定量后統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：隨著氧濃度下降，HIF-1α表達(dá)逐漸增加，氧濃度為2%時(shí)HIF-1α的表達(dá)量與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)，氧濃度降至1%時(shí)，與常氧對(duì)照組相比，差異極顯著(P<0.01)，表明NCI-H292細(xì)胞能對(duì)環(huán)境中氧氣的變化作出應(yīng)答，可以用于建立體外細(xì)胞培養(yǎng)的低氧模型。由此，后續(xù)研究采用1%氧濃度作為低氧培養(yǎng)環(huán)境。

2.2HIF-1α在低氧誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞黏液合成中的作用通過(guò)AB-PAS染色觀察H292細(xì)胞黏液合成情況，結(jié)果如圖2所示，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)染的酸性黏液表達(dá)；與常氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞(control組)相比，低氧刺激48h后NCI-H292(Hypoxia組)細(xì)胞內(nèi)紫紅色黏液顆粒明顯增加，表明低氧刺激下H292細(xì)胞內(nèi)中性黏液合成增加；采用HIF-1α選擇性抑制劑YC-1預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)黏液顆粒明顯減小，顏色變淺(Hypoxia+YC-1組)，表明低氧誘導(dǎo)的中性黏液的合成受到抑制。而常氧培養(yǎng)條件下抑制劑YC-1并不影響細(xì)胞內(nèi)黏液合成情況。表明HIF-1α參與低氧誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞黏液合成。

圖1不同氧濃度對(duì)NCI-H292細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的影響

Fig.1The effect of different concentrations on the expression of HIF-1αin H292 cells

注：C為常氧對(duì)照組。與對(duì)照組相比，*P<0.05, **P<0.01

圖2HIF-1α在低氧誘導(dǎo)的H292細(xì)胞黏液合成中的作用

Fig.2The Effect of HIF-1αon hypoxia-induced mucin production in H292 cells

注：A.Control為常氧對(duì)照組，B.Hypoxia為1%O2組，C.Hypoxia+YC-1為抑制劑預(yù)處理低氧組，D.YC-1為常氧條件下抑制劑對(duì)照組。箭頭示黏液異常合成的細(xì)胞。

2.3低氧對(duì)H292細(xì)胞MUC5AC表達(dá)的影響有研究表明，低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α能夠結(jié)合到黏液中主要的黏蛋白MUC5AC的基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)域，促進(jìn)基因表達(dá)[10]。本研究也探討了低氧對(duì)NCI-H292細(xì)胞中MUC5AC基因表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示。實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，隨低氧刺激時(shí)間的延長(zhǎng)H292細(xì)胞內(nèi)MUC5AC轉(zhuǎn)錄量增加(圖3A)。低氧刺激H292細(xì)胞6 h，muc5AC轉(zhuǎn)錄量即與常氧對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)，在12小時(shí)時(shí)與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。至24小時(shí)MUC5AC達(dá)到峰值，比對(duì)照組提高了11.6倍。之后mRNA表達(dá)開(kāi)始下降，至48小時(shí)與對(duì)照組差異極顯著(P<0.01)，表明低氧時(shí)間依賴性提高M(jìn)UC5AC的基因轉(zhuǎn)錄水平。同時(shí)Western blot檢測(cè)結(jié)果也表明低氧提高H292細(xì)胞內(nèi)MUC5AC蛋白表達(dá)(圖3B)。

2.4低氧對(duì)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)通路的影響為探討H292細(xì)胞中參與低氧應(yīng)答的信號(hào)通路，我們采用Western blot檢測(cè)了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵信號(hào)組分在低氧條件下的磷酸化活化情況，結(jié)果如圖4所示。隨低氧刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，AKT、ERK及STAT3(Tyr705)的磷酸化程度均呈增加趨勢(shì)，提示這些信號(hào)組分相關(guān)的信號(hào)通路參與NCI-H292細(xì)胞對(duì)低氧刺激的應(yīng)答。

圖3低氧對(duì)H292細(xì)胞MUC5AC表達(dá)的影響

Fig.3The effect of hypoxia on the transcription and expression of muc5AC in H292 cells

注：圖3A：實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MUC5AC的mRNA水平。與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；B：Western Blot檢測(cè)MUC5AC蛋白表達(dá)情況。

2.5干預(yù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)的影響為進(jìn)一步探討參與低氧誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞HIF-1α表達(dá)的信號(hào)通路，我們分別采用PI3K抑制劑LY294002阻斷Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、ERK抑制劑U0126阻斷MAPK信號(hào)通路、JAK激酶抑制劑AG490阻斷STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。各抑制劑分別于常氧條件下預(yù)處理H292細(xì)胞1小時(shí)后，將細(xì)胞移至1%低氧孵箱中培養(yǎng)4小時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：U0126抑制ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路后抑制HIF-1α表達(dá)，此時(shí)，HIF1-α表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而LY294002和AG490則不影響低氧誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)(圖5)。

圖4低氧對(duì)H292細(xì)胞不同信號(hào)通路組分的影響

Fig.4Effect of hypoxia on signal molecules in H292 cells

圖5信號(hào)通路抑制劑對(duì)低氧誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞HIF-1a表達(dá)的影響

Fig.5The effect of different signal inhibitors on hypoxia-induced HIF-1α in H292 cells

注：與常氧對(duì)照組相比，**P<0.01

2.6抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)H292細(xì)胞黏液合成的影響 通過(guò)AB-PAS染色，我們進(jìn)一步觀察了抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞黏液合成的影響，結(jié)果如圖6所示，與常氧對(duì)照(Control)組相比，1%低氧(Hypoxia組)NCI-H292細(xì)胞內(nèi)被染成紅色的中性黏液增加，紫紅色深染黏液顆粒數(shù)量明顯增多，而U0126干預(yù)后在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)AB-PAS陽(yáng)染數(shù)量減少且多呈藍(lán)色酸性黏液性質(zhì)。常氧環(huán)境下，U0126干預(yù)不影響H292細(xì)胞內(nèi)的黏液合成。由此表明抑制ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接抑制了低氧誘導(dǎo)H292細(xì)胞黏液的合成。

圖6 U0126干預(yù)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)低氧誘導(dǎo)的H292細(xì)胞黏液合成的影響

Fig.6The effect of U0126 on hypoxia-induced mucin production in H292 cells

注：A.Control為常氧對(duì)照組，B.Hypoxia為1%O2組，C.Hypoxia+U0126為抑制劑預(yù)處理低氧組，D.U0126為常氧條件下抑制劑對(duì)照組，箭頭示黏液異常合成的細(xì)胞。

3討論

正常氣道表面的黏液包括5～50 μm 的凝膠層和約7μm的液體層[13]。Lamb等于1969年首次報(bào)道通過(guò)AB-PAS染色發(fā)現(xiàn)了健康及煙霧誘導(dǎo)的大鼠氣道組織黏液成分的存在[14]。此后人們逐漸認(rèn)識(shí)到氣道黏液-纖毛清除系統(tǒng)的重要性。氣道炎癥總伴有氣道粘液高分泌，因此，慢性炎癥性疾病如哮喘、COPD等均存在氣道黏液過(guò)度分泌現(xiàn)象[15，16]。但慢性炎癥不足以解釋慢性氣道疾病復(fù)雜的病理生理過(guò)程。針對(duì)炎癥的治療在干預(yù)COPD進(jìn)展尤其是氣道粘液高分泌方面難以達(dá)到令人滿意的效果[17]。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查又有學(xué)者提出氣道炎癥與粘液高分泌可能是兩個(gè)相對(duì)分離的病理過(guò)程[18]。因此，選擇一種合適的細(xì)胞模型在非炎癥狀態(tài)下探討細(xì)胞內(nèi)黏液合成及相關(guān)作用機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步闡明慢性氣道疾病中黏液的異常生成與分泌具有重要意義。

在人直徑小于2mm的小氣道中，正常情況下并沒(méi)有黏液細(xì)胞及杯狀細(xì)胞存在。但在病理狀態(tài)下上皮細(xì)胞AB-PAS染色呈陽(yáng)性，也就是發(fā)生了所謂“黏液化生”[9]?！盎币馕吨?xì)胞亞型的改變。Reader等人證實(shí)[19]，在小鼠哮喘模型中，上皮細(xì)胞總數(shù)未發(fā)生改變，但是Clara細(xì)胞減少了75%，纖毛上皮細(xì)胞減少了25%，而杯狀細(xì)胞，也就是黏液分泌細(xì)胞大量增加。這意味著在黏液產(chǎn)生過(guò)程中，Clara細(xì)胞和纖毛上皮細(xì)胞向分泌型黏液細(xì)胞--杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化占有重要地位。Lumsden等人也證實(shí)[20]，吸煙COPD患者的氣道上皮，在正常情況下附有Clara細(xì)胞的部位被杯狀細(xì)胞取代，提示在慢性氣道疾病中上皮細(xì)胞黏液分泌亞型扮演了關(guān)鍵角色。氣道上皮細(xì)胞系NCI-H292是一種肺黏液上皮樣癌細(xì)胞，由于其粘液分泌特性，常被選作氣道粘液相關(guān)的體外研究工具細(xì)胞，故本研究選用該細(xì)胞研究氣道黏液的異常合成。

低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物的乏氧細(xì)胞內(nèi)[21]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β聚合而成的二聚體，HIF-1β為組成型表達(dá)，而HIF-1α為誘導(dǎo)型表達(dá)，且在慢性氣道疾病黏液異常分泌中發(fā)揮重要作用，是預(yù)防和治療氣道黏液高分泌的一個(gè)重要靶點(diǎn)[22]。在低氧環(huán)境中，HIF-1α和HIF-1β聚合鏈接到低氧反應(yīng)組件(HRE)，從而募集轉(zhuǎn)錄共刺激因子p300/CBP到低氧反應(yīng)基因的啟動(dòng)子上，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄激活[23]。而黏蛋白MUC5AC啟動(dòng)子序列有與HRE序列相似的區(qū)域[9]。Kim等[24]證實(shí)低氧會(huì)誘導(dǎo)正常人鼻粘膜NHNE細(xì)胞表達(dá)HIF-1α進(jìn)而促進(jìn)黏蛋白MUC5AC表達(dá)。本研究NCI-H292細(xì)胞適用于低氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)黏液合成的相關(guān)研究。

黏蛋白是黏液中最主要的蛋白組分，它是一種高度糖基化的大分子糖蛋白，形成了黏液的黏彈性和膠樣性質(zhì)[6]。黏蛋白按性質(zhì)不同可分為膜結(jié)合型黏蛋白和分泌型黏蛋白，前者主要附著于細(xì)胞表面，具有黏附、結(jié)合病原菌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[25，26]；后者構(gòu)成細(xì)胞外的黏液層，與黏液的黏性密切相關(guān)。研究表明氣道的分泌型黏蛋白以MUC5AC和MUC5B為主[27]。MUC5AC主要由氣道表面杯狀細(xì)胞分泌，而MUC5B則主要存在于黏膜下層；MUC5AC基因敲除小鼠可正常存活，而MUC5B敲除小鼠死于肺部感染，提示MUC5B可能更全面的調(diào)控氣道屏障和清除的作用[28]。然而在哮喘患者、吸煙者以及哮喘模型小鼠中，均檢測(cè)到MUC5AC表達(dá)明顯增高而MUC5B并無(wú)明顯變化[9,29，30]，提示MUC5AC在慢性氣道疾病黏液異常分泌中扮演重要角色。本研究證實(shí)，低氧刺激NCI-H292細(xì)胞黏液異常合成的過(guò)程中MUC5AC基因表達(dá)增加。

研究表明，MAPK途徑是比較經(jīng)典的一條調(diào)控黏蛋白合成的信號(hào)途徑[31]。Polosukhin等[10]報(bào)道吸煙者及COPD患者氣道杯狀細(xì)胞高分泌與HIF-1α密切相關(guān)。楊紅菊等[32]發(fā)現(xiàn)鈣敏感受體CaSR激活劑可增強(qiáng)低氧引起的人氣道上皮細(xì)胞系16HBE細(xì)胞的MUC5AC表達(dá)及ERK磷酸化。本研究提示低氧誘導(dǎo)H292細(xì)胞黏液異常合成是通過(guò)活化ERK信號(hào)通路進(jìn)行的。此外，AKT及STAT3酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化活化參與NCI-H292細(xì)胞對(duì)低氧的應(yīng)答，而并不參與HIF-1a的誘導(dǎo)表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)黏液的異常合成。提示這些組分相關(guān)的信號(hào)通路可能參與低氧刺激下NCI-H292細(xì)胞其它生理病理過(guò)程。

4結(jié)論

低氧通過(guò)磷酸化活化ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，上調(diào)MUC5AC基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞黏液異常合成，本研究采用NCI-H292細(xì)胞經(jīng)AB-PAS染色直觀地觀察細(xì)胞黏液合成情況的變化，為體外深入研究低氧誘導(dǎo)的氣道黏液異常合成與分泌的相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of hypoxia on mucin production in human airway epithelial Cells

YANG Meng,ZHANG Wei,LI Qiang,et al

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,ChanghaiHospital,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the response of human airway epithelial cell line (NCI-H292) to hypoxia and the effect of hypoxia on the mucin production in cells. MethodsSerum-deprived H292 cells were maintained under normoxia (the control group) or hypoxia for the indicated times. Total RNA and proteins were isolated from each group. Mucin production in NCI-H292 cells was observed by AB-PAS staining. The transcription of muc5AC was determined by real-time RT-PCR. Western Blot was applied to assay the protein expression of HIF-1α, MUC5AC and the phosphorylation of ERK, AKT and STAT3(Tyr705). ResultsHypoxia induced the expression of HIF-1αprotein in H292 cells as the oxygen pressure decreased. 1% Oxygen significantly up-regulated the expressions of HIF-1a as compared to the normoxia control group (P<0.01). Realtime RT-PCR showed the transcription of muc5AC in H292 cells exposed to 1% oxygen increased in a time-dependent manner with the increases being significant at 6 h(P<0.05) and dramatically singifcant at 12 h(P<0.01)compared with that in cells exposed to normoxia. The muc5AC mRNA reached maximally at 24 h under hypoxia. The phospholation of AKT, ERK and STAT3(Tyr705) were all implicated in the response of NCI-H292 to hypoxia. Blocking ERK signaling transduction by U0126 inhibited the up-regulation of HIF-1αand the production of mucin in NCI-H292 when the cells were exposed to hypoxia, while LY294002 and AG490 had little effect on them. ConclusionH292 cells responded to 1% oxygen quickly. Hypoxia induced the expression of HIF-1α, increased the expression of MUC5AC, and stimulated the abnormal production of mucin by phospholation of ERK. This study laid a foundation for further study on the mechanism of hypoxia-induced airway mucin synthesis in vitro.

【Key words】Hypoxia; NCI-H292 cells; MUC5AC; Mucus production

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81370136,81100012)

通訊作者：李強(qiáng),E-mail:liqressh@hotmail.com

【中圖分類號(hào)】R 329.2+5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.006

(收稿日期：2015-02； 編輯： 張文秀)

共同第一作者:楊夢(mèng)，張偉