陳華　于波濤　范開(kāi)華　金偉華　蒲志強(qiáng)　王詩(shī)華　謝秋

(解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科， 四川 成都 610083)

·論著·

辛蒼顆粒中藥材的定性鑒別和黃芩苷的含量測(cè)定*

陳華于波濤范開(kāi)華金偉華蒲志強(qiáng)王詩(shī)華謝秋

(解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科， 四川 成都 610083)

【摘要】目的建立辛蒼顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法(TLC)對(duì)辛蒼顆粒處方中的黃芩、甘草、黃芪進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)處方中的黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，色譜柱為Agilent HC-C18(4.6mm ×250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸(40∶60)，流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，柱溫為34℃。結(jié)果TLC斑點(diǎn)清晰，分離度較好，專屬性強(qiáng)，陰性對(duì)照無(wú)干擾；黃芩苷在1.92～61.44μg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999),平均回收率為100.30%，RSD=1.82%(n=9)。結(jié)論該研究方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，且簡(jiǎn)便可行，可用于辛蒼顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】辛蒼顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；黃芩苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

辛蒼顆粒是由白芷、川芎、蒼耳子、黃芪、梔子等11味中藥材經(jīng)提取精制而成的醫(yī)院制劑，批準(zhǔn)文號(hào)為成制字(2011)F02010號(hào)，具有清熱、解毒、祛風(fēng)、通竅等功效，主治鼻塞、流鼻涕、感冒等。經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用，已成為療效確切的驗(yàn)方，原質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)方法較為簡(jiǎn)單。為適應(yīng)國(guó)家對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑室進(jìn)行GPP管理和軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃要求，有效控制該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥安全有效，本研究結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)條件，采用薄層色譜法(TLC)對(duì)處方中黃芩、甘草、黃芪進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)處方中黃芩苷含量進(jìn)行測(cè)定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1儀器與試藥

1.1儀器HP 1100高效液相色譜儀[G1311A Quat Pump泵，G1315A DAD 紫外檢測(cè)器，Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)分析柱，美國(guó)Agilent公司]；AB135-S型精密電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，精度：0.01mg)；AE-200S型電子天秤(梅特勒-托利多儀器公司，精度：0.1mg)；VGT-1990QTD型超聲儀(蘇州江東精密儀器有限公司)；TGL-18G-C型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；DU730型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼儀器公司)；HHS11-Ni2電熱恒溫水浴鍋(北京長(zhǎng)安永創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司)；SZ-97型自動(dòng)三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2藥品與試劑辛蒼顆粒樣品(成都軍區(qū)總醫(yī)院，規(guī)格：5g/袋，批號(hào)：150120、150121、150122)，甘草對(duì)照藥材(批號(hào)：120904-201318)，黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)：121462-201304),均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：110715-201117，純度：97.0%)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；陰性樣品均為自制；甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純；水為三重蒸餾水；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)。

2方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1黃芩的TLC鑒別[2,3]取供試品10g，研細(xì)，加甲醇30ml，加熱回流30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml溶解，離心，取上清液，作為供試品溶液。另取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1.0mg/ml的照品溶液。取缺黃芩陰性樣品10g，同供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部中TLC法[1]，分別吸取黃芩苷對(duì)照品溶液2μl，供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各3μl，點(diǎn)于同一含4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，晾干至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1黃芩TLC圖

Figure 1TLC of Radix Scutellariae

注：1.黃芩苷對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照

2.1.2甘草的TLC鑒別[4,5]取供試品10g，研細(xì)，加三氯甲烷25ml，加熱回流1小時(shí)，濾過(guò)，棄去三氯甲烷液，藥渣揮干溶劑，加水5ml攪拌濕潤(rùn)，加水飽和正丁醇50ml，超聲處理30min，濾過(guò)，取正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對(duì)照藥材1g和缺甘草的陰性樣品10g，同法分別制成對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部中TLC法[1]，分別吸取對(duì)照藥材溶液6μl、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各15μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰并置紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2甘草TLC圖

Figure 2TLC of Radix et Rhizoma Glycyrrhizae

注：1.甘草對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照

2.1.3黃芪的TLC鑒別[6，7]取供試品10g，研細(xì)，加甲醇10ml，超聲處理30min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0ml溶解，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20ml，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1g和缺黃芪陰性樣品10g，同法制成對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照品溶液。參照2010年版《中國(guó)藥典》一部中TLC法[1]，分別吸取對(duì)照藥材溶液8μl、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10μl，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，預(yù)飽和15min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰后置紫外光燈(365nm) 下檢視。結(jié)果顯示，在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

2.2黃芩苷的含量測(cè)定[8-10]

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸(40∶60)；流速：1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：34℃；進(jìn)樣量：10μl，理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

圖3黃芪TLC圖

Figure 3TLC of Astragali Radix

注：1.黃芪對(duì)照藥材；2～4.供試品；5.陰性對(duì)照

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成50μg/ml的溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備取裝量差異下的供試品適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇75 ml，密塞，稱定重量，超聲處理20min，放冷，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對(duì)照溶液的制備取缺黃芩的陰性樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.2.5專屬性試驗(yàn)精密吸取上述黃芩苷對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μl, 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液在與黃芩苷對(duì)照品溶液相應(yīng)的出峰處未見(jiàn)吸收峰，表明陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

2.2.6線性關(guān)系考察精密稱取黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇溶液制成76.8μg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再分別取適量對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，精密量取，加甲醇適量，分別制成每1ml含1.92、3.84、7.68、15.36、30.72、61.44μg的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液10μl，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品的測(cè)定濃度(x,mg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=23.939x-5.5149(r=0.9999)。結(jié)果顯示，黃芩苷在1.92～61.44μg范圍內(nèi)濃度與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7精密度試驗(yàn)精密吸取 “2.2.6”項(xiàng)下61.44μg/ml黃芩苷對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，計(jì)算RSD=0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

圖4高效液相色譜圖

Figure 4HPLC chromatograms

注：A. 黃芩苷對(duì)照品；B. 供試液品；C. 陰性對(duì)照品；1.黃芩苷

2.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12，24小時(shí)各進(jìn)樣1次，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示， RSD=0.54%(n=6)，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9重復(fù)性試驗(yàn)分別取同一批號(hào)樣品6份約0.5g，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示， RSD=1.0%(n=6)，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.10加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品9份，約0.25g，精密稱定，按3份為1組，每組中分別按樣品中黃芩苷含量的80%、100%、120%精密加入對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)樣9次，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。

2.2.11樣品含量測(cè)定取3批供試品各適量，分別按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中黃芩苷的含量，見(jiàn)表2。

3討論

辛蒼顆粒為中藥復(fù)方制劑，成分較多，彼此干擾，在供試品的前處理過(guò)程中，通過(guò)提取、分離、純化，使溶液成分由復(fù)雜變簡(jiǎn)單，減少干擾。在甘草TLC鑒別中，以三氯甲烷為提取溶劑，提取后棄去三氯甲烷液，可減少脂溶性成分干擾。在黃芩TLC鑒別時(shí)，參考《中國(guó)藥典》2010版一部方法，黃芩鑒別使用的薄層板為聚酰胺薄膜，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后修訂采用含4%醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板，系臨用前自制的薄層板；展開(kāi)劑篩選過(guò)程中，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)后斑點(diǎn)清晰易觀察，Rf值適中，斑點(diǎn)清晰勻稱，陰性無(wú)干擾，重現(xiàn)性好。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2　樣品中黃芩苷的含量

在黃芩苷含量測(cè)定項(xiàng)下流動(dòng)相的選擇中， 參照《中國(guó)藥典》2010 年版及有關(guān)文獻(xiàn)，試用多種流動(dòng)相體系， 甲醇-水-磷酸 (47∶53∶0.2) 、甲醇-0.1%磷酸 (40∶60) 、甲醇-0.3%磷酸 (20∶80)、 甲醇-冰醋酸-水 (40∶1∶60)進(jìn)行試驗(yàn)， 結(jié)果表明，用甲醇-0.1%磷酸溶液 (40∶60)作為流動(dòng)相，樣品分離度較好，峰型佳，保留時(shí)間穩(wěn)定，無(wú)雜質(zhì)峰干擾。

目前，《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》(以下簡(jiǎn)稱《軍規(guī)》)雖然經(jīng)歷了多次修訂，但隨著醫(yī)藥檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和安全監(jiān)管要求的提高，與現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》等國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)相比差距較大，突出表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。①部分制劑處方工藝不合理。②檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置不夠齊全。③檢測(cè)方法落后，當(dāng)前通用的技術(shù)和設(shè)備應(yīng)用較少。④質(zhì)控指標(biāo)偏低，難以控制制劑質(zhì)量。⑤凡例通則項(xiàng)明顯落后于現(xiàn)版《中國(guó)藥典》，難以保證藥品安全、有效和質(zhì)量可控。⑥非標(biāo)準(zhǔn)制劑審批把握尺度寬嚴(yán)不一，批準(zhǔn)后未再進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，其執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中存在的問(wèn)題比標(biāo)準(zhǔn)制劑更為嚴(yán)重[11]。軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃是以確保人民群眾與官兵用藥安全為根本目的，以提高藥品標(biāo)準(zhǔn)和藥品質(zhì)量為工作重心，完善監(jiān)管體制，創(chuàng)新監(jiān)管機(jī)制，依法科學(xué)實(shí)施監(jiān)管。通過(guò)本次制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃，能夠?qū)χ苿┵|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有個(gè)整體的推進(jìn)，并初步建立制劑的準(zhǔn)入和退出標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)完善標(biāo)準(zhǔn)提高的長(zhǎng)效機(jī)制，將加快《軍規(guī)》向《中國(guó)藥典》等國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)看齊的步伐，更加完善軍隊(duì)醫(yī)療制劑的監(jiān)管制度，全面保障軍民用藥安全有效。

此次啟動(dòng)“軍隊(duì)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃”對(duì)軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑的發(fā)展是一種強(qiáng)有力的引導(dǎo)，尤其會(huì)對(duì)軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑滑坡現(xiàn)狀起到推動(dòng)作用[12]，引導(dǎo)配制單位爭(zhēng)取各種資金，加大研發(fā)投入，引導(dǎo)醫(yī)院制劑向著重視研發(fā)的良性道路發(fā)展。

4結(jié)論

本研究建立的辛蒼顆粒定性鑒別方法，特征斑點(diǎn)明顯，分離度佳，陰性對(duì)照無(wú)干擾；建立的定量方法，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均符合要求，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于辛蒼顆粒質(zhì)量控制。

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Qualitative identification of Xincang Granules and determination of Baicalin in Xincang Granules

CHEN Hua，YU Botao，F(xiàn)AN Kaihua，et al

(DepartmentofPharmacy,GeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Chengdu610083,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the quality standard of Xincang Granules. MethodsThe TLC method was used to qualitatively identify Radix Scutellariae, licorice and Astragali Radix. HPLC method was adopted to determine the content article of baicalin．The determination was performed on Agilent HC-C18(4.6mm ×250mm，5μm) column with mobile phase consisted on methyl alcohol-0.1% phosphoric acid(40∶60) at the flow rate of 1.0ml/min,the column temparature was 34℃ and the detection wavelength was set at 280nm.ResultsThe spots of TLC were fairly clear with the good separation. The negative samples showed no interference. The linear range of baicalin was 1.92～61.44μg/m1(r=0.9999)．The average recovery rate was 100.30%. The RSD was 1.82%(n=9)．ConclusionThe simple, rapid and reliable method can be used for the quality control of Xincang Granules.

【Key words】Xincang Granules；Quality standard；Baicalin; TLC；HPLC

基金項(xiàng)目：總后衛(wèi)生部軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題(14ZJZ18-2)

通信作者：范開(kāi)華，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：fankeyi@sohu.com

【中圖分類號(hào)】R 914

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.06.026

(收稿日期：2015-12-02； 編輯： 母存培)